王海崗，溫琪汾，穆志新，喬治軍

山西谷子核心資源群體結構及主要農(nóng)藝性狀關聯(lián)分析

王海崗，溫琪汾，穆志新，喬治軍

（山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，太原 030031）

【】分析山西谷子地方品種遺傳多樣性和群體遺傳結構，篩選與谷子農(nóng)藝性狀相關聯(lián)的分子標記，為谷子雜交組合親本選配及分子標記輔助育種提供依據(jù)。利用96對SSR標記對595份山西谷子核心資源進行全基因組掃描，采用PowerMarker 3.25軟件分析群體遺傳多樣性，利用STRUCTURE 2.3.4軟件分析群體遺傳結構，使用TASSEL 2.1軟件中GLM（general linear model，Q）和MLM（mixed linear model，Q+K）2種方法，進行表型和標記關聯(lián)分析。96對SSR引物共擴增出828個等位變異，平均每對引物擴增到8.6個，變化范圍為2—26；基因多樣性指數(shù)變化范圍為0.005—0.941，平均為0.610；多態(tài)信息量變化范圍為0.005—0.938，平均為0.577；各位點雜合度變化范圍為0—0.050，平均位點雜合度僅為0.016。群體結構分析將595份核心資源分為3個亞群。4 560個SSR位點成對組合中，共線性組合和非共線性組合之間都存在一定的連鎖不平衡。統(tǒng)計概率（<0.01）支持的LD成對位點1 955個，占全部位點組合的42.9%，平均值為0.23。通過GLM方法共檢測到12個極顯著性位點（＜0.01），表型變異解釋率為2.34%—13.94%，平均為6.33%，貢獻率較高的等位變異位點是CAAS2050（2=13.94%）和B153（2=11.36%）；通過MLM方法共檢測到9個極顯著性位點（＜0.01），表型變異解釋率為2.80%—9.22%，平均為5.16%，貢獻率較高的等位變異位點是P89（2=9.22%）和P3*（2=8.28%）；2種方法共同檢測到的極顯著性位點有7個。利用SSR標記分析了595份山西谷子核心資源的遺傳多樣性和群體遺傳結構。2種關聯(lián)分析模型中，GLM方法關聯(lián)到12個標記與節(jié)數(shù)、株高、頸長、莖粗、穗長、穗粗、碼數(shù)、碼粒數(shù)、蛋白質(zhì)含量9個性狀相關；MLM方法關聯(lián)到9個標記與節(jié)數(shù)、頸長、葉寬、莖粗、穗粗、碼數(shù)、碼粒數(shù)、千粒重8個性狀相關。

谷子；山西；地方品種；SSR；遺傳多樣性；連鎖不平衡；關聯(lián)分析

0 引言

【研究意義】谷子（（L.）Beauv.）是起源于中國黃河流域的糧飼兼用作物，又稱粟，去殼后為小米，在中國的栽培歷史可追溯到11 500年前[1]，是世界范圍內(nèi)最古老的禾谷類作物之一。山西谷子種質(zhì)資源豐富，占全國谷子種質(zhì)資源的1/5[2]，山西傳統(tǒng)的名優(yōu)谷子品種較多，如東方亮、沁州黃、晉谷21號、晉谷10號，這些品種蘊藏著豐富的優(yōu)異基因資源。優(yōu)異基因發(fā)掘是作物種質(zhì)資源研究的重要部分，對作物分子育種具有重要的實踐意義。關聯(lián)分析是基因發(fā)掘的有效途徑之一，以連鎖不平衡為基礎，通過對自然群體表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計檢測，尋找性狀可遺傳變異和標記多態(tài)性之間的關聯(lián)[3-5]?！厩叭搜芯窟M展】目前，關聯(lián)分析已在水稻庫源相關性狀[6]、紋枯病抗性[7]等；小麥株高[8]、旗葉葉綠素[9]、穗發(fā)芽抗性[10]等性狀；大豆農(nóng)藝性狀[9]、加工和品質(zhì)性狀[12-14]、幼苗期耐淹性[15]及棉花農(nóng)藝和纖維品質(zhì)性狀[16]、葉綠素含量[17]、適宜機采相關性狀[18]等已進行了大量研究。且在大麥[19-21]、谷子[22-25]、小豆[28]、豇豆[29]等小宗作物也進行了一定研究。山西谷子年播種面積在22.46×104hm2左右，占全國的1/4[30]，但是作為山西傳統(tǒng)雜糧作物的谷子分子輔助育種相對緩慢，充分挖掘山西本土谷子資源中的優(yōu)良等位變異，利用分子標記輔助選擇，創(chuàng)制谷子新種質(zhì)是谷子資源研究急需開展的工作?！颈狙芯壳腥朦c】本研究中所用材料主要來自20世紀50—80年代征集的山西谷子地方品種[31-32]，這些材料未經(jīng)過育種的選擇壓力，多數(shù)資源是通過自然選擇或突變后篩選而保留下來的種質(zhì)，是環(huán)境和歷史的載體材料。傳統(tǒng)育種主要根據(jù)作物的表型和產(chǎn)量性狀進行雜交親本組合配制，對遺傳組成的差異考慮較少，導致親本來源單一，育成品種間遺傳基礎狹窄，很難培育出具有突破性的優(yōu)良品種?！緮M解決的關鍵問題】本研究對595份山西谷子地方品種初選核心資源進行遺傳多樣性分析，明確山西谷子地方品種的遺傳結構，尋找與農(nóng)藝性狀顯著相關聯(lián)的分子標記，為谷子種質(zhì)創(chuàng)新中的優(yōu)異等位變異發(fā)掘、親本組配和標記輔助選擇等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及表型鑒定

所用595份山西谷子地方品種來源于5 627份山西谷子資源構建的初選核心資源[30]及近年新收集的谷子資源。2017—2018年在山西省農(nóng)業(yè)科學院東陽試驗基地種植，對抽穗期、節(jié)數(shù)、株高、頸長、葉長、葉寬、穗長、穗粗、莖粗、單穗重、穗粒重、碼數(shù)、碼粒數(shù)、千粒重、蛋白質(zhì)含量等15個性狀進行鑒定。

1.2 基因組DNA提取

谷子抽穗后取倒二葉，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。采用植物基因組DNA提取試劑盒（DP305-03）提取DNA，利用全功能酶標儀（美國伯騰SynergyH1）測定DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR分析

選取分布于9條染色體上的96對引物進行多態(tài)性掃描（表1）[22-27]。SSR反應體系包括模板DNA 1.0 μL、2×Tap PCR Mastermix 5.0 μL、10 mmol·L-1Forward primer 0.4 μL、10 mmol·L-1Reverse primer 0.4 μL和ddH2O 3.2 μL。PCR反應程序為95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃（不同引物退火溫度根據(jù)溫度梯度試驗確定）30 s，72℃ 60 s，32個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)SSR擴增產(chǎn)物的電泳結果，參照DNA Ladder記錄擴增產(chǎn)物條帶的分子量大小。使用Powermarker 3.25軟件計算每個位點等位基因數(shù)、基因型數(shù)、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)性信息含量指數(shù)和雜合度，并計算Nei遺傳距離采用MEGA 5.0軟件構建NJ聚類圖。

采用Structure2.3.4軟件分析群體遺傳結構，K取值為1—10，3次重復；將MCMC（markov chain monto carlo）開始時的不作數(shù)迭代設為100 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設為100 000次，其余參數(shù)采用軟件默認的設置。根據(jù)lnP(D)計算ΔK，并依據(jù)ΔK值選擇一個合適的K值。使用Tassel 2.1軟件計算SSR位點組合間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）水平及支持概率，繪制LD配對檢測矩陣圖，使用一般線性模型（general linear model，GLM）和混合線性模型（mixed liner model，MLM）結合基因型數(shù)據(jù)、表型值和Q值，對SSR標記與表型性狀進行關聯(lián)分析，計算<0.01時標記位點對表型變異的貢獻率（2）。采用STRUCTURE軟件計算Q值，用軟件SPAGeDi1.5軟件計算Kinship值。

2 結果

2.1 SSR多樣性

96對SSR引物在595份山西谷子地方品種核心資源中共檢測到828個等位變異，變化范圍2—26個，平均為8.6個，其中，標記B109檢測到的等位變異最多為26個（表1）?；蛐蛿?shù)變化范圍在2—47，平均每個位點為13?；蚨鄻有灾笖?shù)變化范圍為0.0050—0.9411，平均為0.6097；多態(tài)信息量變化范圍為0.0050—0.9379，平均為0.5773；各位點雜合度變化范圍為0—0.050，平均位點雜合度僅為0.0159，說明谷子異交率很小接近于純系。每條染色體上標記平均數(shù)有10對，平均等位變異為92個；第3和第8染色體檢測到等位變異最多，均為107個，第7染色體最少為79個。第3染色體基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量最高，分別為0.720和0.6912，第7染色體最低，分為0.5322和0.4940。第7染色體雜合度最小，為0.0114，第1染色體雜合度最大，為0.0212。

表1 96對SSR引物遺傳多樣性

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 群體結構分析

采用Structure 2.3.4軟件對595份山西谷子核心資源進行群體遺傳結構分析，計算每份材料的Q值（每份種質(zhì)被分配到對應亞群中的概率）。隨著K值的增大，LnP(D)遞增，未出現(xiàn)拐點，因此無法準確判斷K值（圖1）。參照EVANNO等[33]方法，當K=3時，ΔK出現(xiàn)最大值，因此該群體材料被劃分為3個亞群（圖2）。按照亞群中個體的概率≥0.6時，個體被分配到相應聚類的亞群；亞群中個體的概率≤0.6時，個體被分配到一個混合類群的分配原則，分析每份核心資源對應的Q值。結果表明，595份材料歸屬為3個亞群，分別包含77、222和187份材料，3個亞群各占比例為12.9%、37.3%和31.4%；另有109份材料在任意一個亞群內(nèi)Q值均＜0.6，單獨劃為一個混合群，占比例為18.3%。

基于SSR遺傳距離的11個地市聚類分析可以看出（圖3），運城、晉城、臨汾、長治、陽泉聚為第一類；大同、朔州、忻州、太原聚為第二類；晉中、呂梁聚為第3類。劃分的3個類群按照緯度高低自北向南依次分開，這與山西復雜多樣的地理生態(tài)類型有一定關系，說明山西谷子種質(zhì)資源存在地理生態(tài)型的分化。

A：ln P(D)值與K值的變化圖；B：ΔK值隨K值的變化圖 A: Line chart of K and ln P(D); B: magnitude of ΔK as a function of K

圖2 595份山西谷子地方品種的群體遺傳結構

2.3 連鎖不平衡分析

關聯(lián)分析以不同位點等位基因間的連鎖不平衡為基礎，描述群體的重組史。對分布于谷子全基因組96對SSR標記進行連鎖不平衡分析，4 560個SSR位點成對組合中，共線性組合（同一染色體）和非共線性組合（不同染色體）之間都存在一定的連鎖不平衡（圖4）。統(tǒng)計概率（<0.01）支持的LD成對位點1 955個，占全部位點組合的42.9%，平均值為0.23。LD成對位點的值范圍主要集中在0—0.2和0.2—0.4（表2），在第2和第4染色體上未發(fā)現(xiàn)在0.5以上的LD位點，說明這兩條染色體較其他7條染色體受到的選擇壓力??；分析共線性位點組合的LD，發(fā)現(xiàn)第4、第6和第9染色體上的LD成對位點分別有31、35和36個，高于其他染色體，且第6染色體上平均值最高為0.28，說明群體材料中，該染色體上發(fā)生重組選擇要大于其他染色體。

2.4 SSR標記與性狀關聯(lián)分析

采用Tassel 2.1軟件分析了595份山西谷子核心資源在一點2年2種模型的15個性狀表型和基因型，結果顯示，在<0.01下，共檢測到14個SSR標記與11個性狀相關聯(lián)（表3）。GLM方法檢測到12個標記與節(jié)數(shù)、株高、頸長、莖粗、穗長、穗粗、碼數(shù)、碼粒數(shù)和蛋白質(zhì)9個性狀相關聯(lián)。表型變異解釋率為2.34%—13.94%，平均值為6.33%。表型變異解釋率較大的標記是CAAS2050和B153，解釋率分別為13.94%和11.36%；MLM方法檢測到9個標記與節(jié)數(shù)、頸長、葉寬、莖粗、穗粗、碼數(shù)、碼粒數(shù)和千粒重8個性狀相關聯(lián)。表型變異解釋率為2.80%—9.22%，平均為5.16%。貢獻率較高的位點是P89和P3*，解釋率分別為9.22%和8.28%。比較GLM和MLM結果，CAAS6023、P3*、In6-2、CAAS2050和B117 5個標記在2種模型條件下同時被檢測到。B153、P58、B117、In6-2、CAAS6023和B142標記同時與2個或多個性狀相關聯(lián)，這可能與性狀相關有一定關系，說明控制該性狀的等位基因可能連鎖或一因多效。

與莖粗相關的標記有5個，表型變異解釋率為4.45%—9.77%，平均值為6.72%，貢獻率最高的位點為P89；與碼數(shù)相關的標記有4個，表型變異解釋率為2.58%—13.94%，平均值為5.76%，貢獻率最高的位點為CAAS2050；與蛋白質(zhì)相關的位點有3個，表型變異解釋率為4.25%—11.36%，平均值為8.61%，貢獻率最高的位點為B153；與節(jié)數(shù)相關的位點有2個，表型變異解釋率為5.20%—5.97%，平均值為5.63%，貢獻率最高的位點為P58；與穗長相關的位點有2個，表型變異解釋率為2.34%—6.05%，平均值為4.16%，貢獻率最高的位點為B153；與穗粗相關的位點有2個，表型變異解釋率為4.57%—6.46%，平均值為5.94%，貢獻率最高的位點為B142。

表2 不同D'值范圍LD成對位點數(shù)

圖4 9條染色體SSR位點的連鎖不平衡分布

3 討論

3.1 山西谷子資源的遺傳多樣性

優(yōu)異基因發(fā)掘是種質(zhì)資源高效利用和作物遺傳改良的基礎，種質(zhì)資源的遺傳多樣性評價和群體遺傳結構的分析是優(yōu)異基因發(fā)掘的前提條件。關聯(lián)分析將蘊藏在不同種質(zhì)中的等位變異與表型性狀建立了聯(lián)系，通過尋找顯著關聯(lián)位點，可以發(fā)掘種質(zhì)資源中優(yōu)異等位基因。山西谷子資源豐富，栽培歷史悠久，名優(yōu)品種眾多，但是傳統(tǒng)谷子育種只是簡單的品種雜交，通過應用分子標記輔助選擇聚合有利基因，改良谷子地方品種，是山西谷子育種和種質(zhì)創(chuàng)制的新途徑。本研究采用SSR標記對山西谷子地方品種核心資源進行遺傳多樣性評價，分析群體遺傳結構，挖掘與農(nóng)藝性狀關聯(lián)的分子標記，對指導山西谷子資源的利用和育種親本選擇具有指導意義。

通過對595份山西谷子核心資源進行分子標記掃描，發(fā)現(xiàn)平均等位基因8.6個，平均基因多樣性指數(shù)0.610，平均PIC為0.577，低于Wang等[22]和Jia等[23]對全國谷子地方品種和育成品種研究結果，同時也低于Vetriventhan等[24]的研究，說明山西谷子資源的遺傳多樣性要低于全國和世界的谷子資源。但與GUPTA等[25]和Jia等[34]研究結果相近，這與等位變異統(tǒng)計方法和試驗選擇引物有一定關系。山西行政區(qū)域從北緯34°34′到40°44′橫跨6個緯度，海拔從180 m到3 058 m，地貌類型復雜多樣，全省各縣均有谷子資源分布，形成了多類型谷子種植區(qū)，按照緯度和海拔分為春播早熟區(qū)、春播中熟區(qū)、春播晚熟區(qū)和夏播區(qū)[35]。山西谷子核心資源按照11個地市來源劃分成3個類群，基本按照緯度高低由北到南劃分開來[36]，說明山西谷子種質(zhì)資源存在地理生態(tài)型分化，也從分子水平證明了山西省是春、夏谷2種類型同時存在的省份。同時，明確了各地市谷子資源的遺傳距離，為山西谷子生態(tài)區(qū)域劃分和育種親本選配提供了分子證據(jù)。

表3 GLM和MLM關聯(lián)分析

SN：節(jié)數(shù)；PH：株高；PL：頸長；LW：葉寬；DMS：莖粗；PL：穗長；PD：穗粗；PBNP：碼數(shù)；SNPB：碼粒數(shù)；GW：千粒重；PC：蛋白含量；GLM：一般線性模型；MLM：混合線性模型

SN: stem node number; PH: plant height; PL: peduncle length; LW: Leaf width; DMS: diameter of main stem; PL: panicle length; PD: panicle diameter; PBNP: primary branch number per panicle; SNPB: spikelet number per primary branch; GW: 1000-grain weight; PC: protein content; GLM: general linear model; MLM: mixed linear model

3.2 SSR位點連鎖不平衡及關聯(lián)分析

已有研究表明[22,24]，谷子LD衰減距離在15—40 cM，說明谷子的LD水平較高，有利于進行全基因組關聯(lián)分析，進而發(fā)掘種質(zhì)資源中的有利基因。本研究利用覆蓋全基因組的96對SSR引物進行標記掃描，4 560個位點成對組合中，不論是共線性組合還是非共線性組合，都有LD存在。統(tǒng)計概率（<0.01）支持的LD成對位點占42.9%，較高水平的LD成對位點（>0.5）主要分布在第1、第2、第6和第9染色體上及與其組合的位點，說明這4條染色體面臨的選擇壓力大于其他染色體，這些材料多經(jīng)歷了較多農(nóng)藝性狀的選擇。本研究發(fā)現(xiàn)核心資源的整體連鎖不平衡水平較低（平均值為0.23），說明山西谷子資源在經(jīng)歷人為重組和自然突變的歷程較少，且谷子是自花授粉作物，自然異交率低，地方品種中攜帶的大量優(yōu)異等位變異仍單獨存在，所以山西谷子育種仍有進一步提升空間。關聯(lián)分析在極顯著（<0.01）條件下共檢測到14個與農(nóng)藝性狀和蛋白質(zhì)含量相關的位點，對表型變異解釋率平均值為5.98%，在谷子育種中可利用這些標記進行材料的等位變異標記輔助選擇研究；另外，有6個標記位點同時與2個以上性狀相關聯(lián)，其中B142位點與4個性狀相關聯(lián)，這可能是性狀相關和一因多效的遺傳基礎，說明這些標記可以同時進行改良多個目標性狀，可用于多個性狀的聚合育種研究。

4 結論

595份谷子核心資源遺傳結構存在3個類群，11個地市按照緯度由高到低劃分成3類，山西谷子資源存在地理生態(tài)型分化。共線性或非共線性位點組合都有LD存在，核心資源群體有利于關聯(lián)分析和優(yōu)異等位變異挖掘。2種關聯(lián)模型下分別找到12個與節(jié)數(shù)、株高、頸長、莖粗、穗長、穗粗、碼數(shù)、碼粒數(shù)、蛋白質(zhì)含量相關聯(lián)的標記和9個與節(jié)數(shù)、頸長、葉寬、莖粗、穗粗、碼數(shù)、碼粒數(shù)、千粒重相關聯(lián)的標記。

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Population Structure and Association Analysis of Main Agronomic Traits of Shanxi Core Collection in Foxtail Millet

WANG HaiGang, WEN QiFen, MU ZhiXin, QIAO ZhiJun

(Institute of Crop Germplasm Resources of Shanxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture/Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taiyuan 030031)

The objective of this study is to detect the SSR markers associated with agronomic trait and analyze genetic diversity and genetic structure of foxtail millet landrace in Shanxi province. The results will be helpful for hybridization combination of parent materials and molecular marker assisted breeding.96 SSR markers on 9 chromosomes were genome-wide screened for polymorphism in core collection of 595 accessions. PowerMarker 3.25 software was used to estimate the polymorphism information of population. Population structure was analyzed using STRUCTURE 2.3.4 software. Then the data were associated with 96 SSR markers by GLM (general linear model, Q) and MLM (mixed linear model, Q+K).Totally 828 alleles were found with 96 SSR markers and 8.6 alleles were revealed with each marker in average ranged from 2-26. The gene diversity was from 0.005 to 0.941, averagely 0.610. The polymorphism information content (PIC) value ranged from 0.005 to 0.938 with the mean of 0.577. Heterozygosity per locus on average was 0.016, ranging from 0 to 0.050.All the 595 accessions were divided into three subgroups by analysis of population genetic structure. There was linkage disequilibrium (LD) among linked loci and unlinked loci pairs, and 1 955 out of 4 560 loci pairs (42.9%) had significant LD (< 0.01) with average′ value of 0.23. A total of 12 locus found by GLM method significantly at the level of<0.01 which explained 2.34%-13.94% of the phenotypic variance and the mean value was 6.33%. CAAS2050 (2=13.94%) and B153(2=11.36%) kept the max value. Meanwhile, 9 loci were found by MLM method significantly at the level of<0.01 which explained 2.80%-9.22% of the phenotypic variance and the mean value was 5.16%. P89(2=9.22%) and P3*(2=8.28%) kept the max value. A total of 7 loci were detected in common by GLM and MLM.Genetic diversity and population structure of 595 accessions were analyzed through SSR markers. In the two association analysis models, 12 markers were associated with nine traits including stem node number, plant height, peduncle length, diameter of main stem, panicle length, panicle diameter, primary branch number per panicle, spikelet number per primary branch, protein content by GLM. Nine markers were associated with eight traits including stem node number, peduncle length, leaf width, diameter of main stem, panicle diameter, primary branch number per panicle, spikelet number per primary branch, 1000-grain weight by MLM.

foxtail millet; Shanxi; landrace; SSR; genetic diversity; linkage disequilibrium; association analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.013

2019-04-22；

2019-06-20

山西省平臺基地和人才專項優(yōu)秀人才科技創(chuàng)新項目（201705D211026）、山西省農(nóng)業(yè)科學院特色農(nóng)業(yè)技術攻關（YGG17057）、國家谷子高粱產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-06-13.5-A16）

王海崗，E-mail：nkywhg@126.com。通信作者穆志新，E-mail：muzx2008@sina.com。通信作者喬治軍，E-mail：nkypzs@126.com

（責任編輯 李莉）