李俊輝，王燕，周寶琳，李丕武，趙鑫君，王婷*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250353；2.山東省中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250353)

細(xì)菌素(bacteriocin) 是細(xì)菌在代謝過(guò)程中由核糖體合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑(殺)菌活性的代謝產(chǎn)物, 通常是低分子量的多肽或者蛋白類物質(zhì)[1,2]。自1925年Gratia發(fā)現(xiàn)第一個(gè)細(xì)菌素以來(lái)，已發(fā)現(xiàn)上百種細(xì)菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素[3,4]。而乳酸鏈球菌素(Nisin)是由某些乳酸乳球菌產(chǎn)生的具有34個(gè)氨基酸殘基的多肽類物質(zhì)[5，6]，能對(duì)某些革蘭氏陽(yáng)性菌，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等食源性致病菌起到強(qiáng)烈的抑制作用[7]。作為天然的抑菌劑，可以減少或避免化學(xué)防腐劑所帶來(lái)的安全隱患, 提高食品品質(zhì)，是一類極具開發(fā)潛力的天然食品防腐添加劑[8]。

Nisin是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的，但并非所有的乳酸乳球菌只產(chǎn)生Nisin，還有熱敏感的雙球菌素(diplococcin)、乳球菌素(lactococcin)等多種細(xì)菌素[9，10]。如今雖然許多文章對(duì)Nisin產(chǎn)生菌的篩選進(jìn)行了研究，但大多停留在生理生化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行初步的斷定，在鑒定產(chǎn)生Nisin菌株的方法上尚不夠嚴(yán)謹(jǐn)。因此，能夠快速、準(zhǔn)確地篩選到產(chǎn)Nisin的乳酸菌株，為天然抑菌物質(zhì)與乳酸菌在發(fā)酵食品相結(jié)合的應(yīng)用方面開辟更廣闊的前景，為生物食品抑菌劑提供理論基礎(chǔ)[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及指示菌

市售新鮮小白菜葉；Nisin標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；H103大孔吸附樹脂：陜西樂(lè)博生化科技有限公司；金黃色葡萄球菌：由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良GM17培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基)：酪蛋白胨5 g，大豆蛋白胨2.5 g，牛肉粉5 g，酵母浸粉5 g，蔗糖5 g，抗壞血酸0.5 g，β-甘油磷酸鈉，硫酸鎂0.25 g, 蒸餾水1000 mL，自然pH，若配制固體培養(yǎng)基則加入1.5%瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：在改良的GM17培養(yǎng)基中添加0.004%溴甲酚紫和1500 IU/mg的Nisin標(biāo)準(zhǔn)品。

指示菌培養(yǎng)基：1% K2HPO4牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基: 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，K2HPO410 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。

1.1.3 試劑

三乙胺(分析純)、磷酸：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙腈(色譜純)：上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；pH 3.0的水為用鹽酸溶液將超純水調(diào)至 pH (3.0±0.1)而得。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1214C垂直流超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司； BPH-9042恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HVE-50全自動(dòng)高壓滅菌鍋 華粵集團(tuán)有限公司；Rotavapor R-210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士 Buchi 公司；LC-VP島津液相儀 日本島津公司；Inertsil ODS-3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm ) 日本GL Sciences公司；實(shí)驗(yàn)用水為 Milli-Q 純水儀制備的超純水。

1.3 方法

1.3.1 乳酸鏈球菌素母液的配制

稱取0.01 g Nisin標(biāo)準(zhǔn)品(原始效價(jià)為1000 IU/mg)，溶于20 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液中，此時(shí)效價(jià)為5000 IU/mL, 使用前需經(jīng)孔徑為0.22 μL的微孔濾膜過(guò)濾除菌。

1.3.2 樣品處理

取市售新鮮小白菜葉，無(wú)菌水去除表面泥垢后，切片，大小在1 cm2為宜。

1.3.3 分離方法

將處理好的白菜葉片置于5 mL液體篩選培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。將該富集培養(yǎng)液制備成10-4、10-5、10-6稀釋度的菌懸液，分別吸取0.1 mL涂布于固體篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取明顯使培養(yǎng)基變黃的單菌落，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液的酸度，將產(chǎn)酸的菌做革蘭氏染色鏡檢，最終得到革蘭氏陽(yáng)性、球形、具有Nisin耐受性的乳酸菌菌株，以進(jìn)行下一步的抑菌活性測(cè)定。

1.3.4 抑菌活性的測(cè)定1.3.4.1 指示菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌于1% K2HPO4牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，取生長(zhǎng)量為107CFU/mL的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液作為指示菌懸液。

1.3.4.2 菌株發(fā)酵液的預(yù)處理

使用5 mol/L的HCl將30 ℃培養(yǎng)24 h的乳球菌發(fā)酵液調(diào)至pH 3，于90 ℃水浴30 min，6000 r/min離心8 min，去除沉淀，收集上清液備用。

1.3.4.3 牛津杯法測(cè)定抑菌活性

取0.2 mL指示菌懸液涂平板，待干燥后用無(wú)菌鑷子放置牛津杯(內(nèi)徑6.0 mm,高8.0 mm)中。取經(jīng)預(yù)處理后的發(fā)酵上清液50 μL加入牛津杯內(nèi)，并做陰性和陽(yáng)性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀測(cè)抑菌圈大小。

1.3.5 菌株鑒定

將具有抑菌特性的菌株提取基因組，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rDNA鑒定，數(shù)據(jù)提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)，通過(guò)基本本地隊(duì)列搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool， BLAST)進(jìn)行同源性比較，用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 抑菌物質(zhì)特性的初步探究與鑒定1.3.6.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌性的影響

將篩選的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)過(guò)程中分別在12～48 h期間，每4 h取發(fā)酵液，以牛津杯法做抑菌圈試驗(yàn)(重復(fù)3次，取平均值)。

1.3.6.2 熱處理和pH對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

使用鹽酸溶液將30 ℃培養(yǎng)24 h的乳球菌發(fā)酵液分別調(diào)至pH 2～pH 9，于90 ℃水浴30 min熱處理，以未熱處理的發(fā)酵液做對(duì)照，以牛津杯法做抑菌圈試驗(yàn)，測(cè)定抑菌物質(zhì)的活性(重復(fù)3次，取平均值)。

1.3.7 高效液相色譜法(HPLC)分析1.3.7.1 發(fā)酵液濃縮純化

將30 ℃下培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液調(diào)至pH 3.0，于90 ℃熱處理30 min并于冰上迅速放涼，離心10 min去除沉淀。然后通過(guò)搖瓶吸附的方法[12]，加入1%的H103大孔吸附樹脂，于37 ℃下?lián)u動(dòng)吸附8 h后裝入層析柱。使用pH 3的75%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液用 Nisin 活性 Buffer(pH 3的鹽酸水溶液)稀釋2倍，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上在低溫(30 ℃)懸蒸30 min，待乙醇除凈后，將溫度調(diào)至50 ℃將多余的水分懸蒸出去，最終得到稀釋前溶液體積的1/3，該溶液即為Nisin純化液。

1.3.7.2 流動(dòng)相配制

緩沖液A：48 mmol/L三乙胺水溶液，用磷酸調(diào)至pH 3.0。

緩沖液B：緩沖液A與乙腈的混合液(緩沖液A體積含量為22.5%)。

1.3.7.3 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品前處理

精確稱取0.01 g Nisin標(biāo)準(zhǔn)品，用0.02 mol/L鹽酸溶液溶解，使效價(jià)為10000 IU/mL，用孔徑0.22 μm的水相微孔濾膜過(guò)濾。純化液樣品，同樣用孔徑0.22 μm的水相微孔濾膜過(guò)濾。

1.3.7.4 色譜條件

流動(dòng)相A，B兩相：0～15 min，緩沖液B由30%上升到50%；15～20 min，緩沖液B維持50%。

色譜柱：反向C18柱；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nisin產(chǎn)生菌的平板初篩

在初篩過(guò)程中，通過(guò)設(shè)定4個(gè)篩選條件從樣品中定向篩選Nisin產(chǎn)生菌，以盡可能減少雜菌對(duì)試驗(yàn)的影響。首先，基于Tsai H J等[13]的研究，編碼乳酸鏈球菌素前體的基因(nip+)和其抗性基因(nis+)以及蔗糖發(fā)酵基因(suc+)緊密連鎖。因此，以蔗糖作為唯一碳源，用于Nisin產(chǎn)生菌的篩選。其次，將培養(yǎng)基中添加一定效價(jià)的Nisin，可以減少部分革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，減少雜菌污染，而對(duì)于要篩選的產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌來(lái)講，由于其本身可以產(chǎn)生Nisin，因此，可以在具有一定效價(jià)的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。再者，由于Nisin是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的，因此，配以溴甲酚紫作指示劑，可以快速找到產(chǎn)酸的單菌落，將其挑出，劃線培養(yǎng)，見圖1。最后，通過(guò)革蘭氏染色，鏡檢(見圖1中B)，篩選革蘭氏陽(yáng)性、細(xì)胞形態(tài)為球形的菌株。綜上，選擇同時(shí)具備上述4個(gè)條件特征的菌株進(jìn)行下一步的抑菌試驗(yàn)。

圖1 菌落形態(tài)A和細(xì)胞形態(tài)BFig.1 Colony morphology A and cell morphology B

2.2 菌株抑菌活性檢測(cè)

將初步篩選到的菌株進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)，驗(yàn)證其發(fā)酵產(chǎn)物是否具有抑菌特性，見圖2。4個(gè)樣品均通過(guò)相同的處理， 1號(hào)為發(fā)酵培養(yǎng)基做陰性對(duì)照，4號(hào)是發(fā)酵培養(yǎng)基中加入了Nisin標(biāo)準(zhǔn)品的陽(yáng)性對(duì)照?？梢钥吹讲缓蠳isin的1號(hào)沒有產(chǎn)生抑菌圈，而加入Nisin的3號(hào)產(chǎn)生了最大的抑菌圈，2號(hào)和4號(hào)為篩選到的具有較好抑菌效果的兩株菌，其中4號(hào)的抑菌圈更大，表現(xiàn)出更好的抑菌效果，將其命名為L(zhǎng)-217。

圖2 兩株菌株的抑菌效果圖Fig.2 Antibacterial effect of two strains

2.3 菌種鑒定

將篩選到的具有較好抑菌效果的L-217菌株提基因組，PCR純化后，送到生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，將得到的測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行同源性比較，同源性較高的為乳酸乳球菌屬(Lactococcuslactis)，同源性大于99%。將其與搜索到的同源性大于97%的菌株，用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。發(fā)現(xiàn)L-217菌與乳酸乳球菌屬(Lactococcuslactis)最近，與山羊奶乳球菌屬(Lactococcushircilactis)、富士山乳球菌(Lactococcusfujiensis)和象白蟻乳球菌(Lactococcusnasutitermitis)親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)，結(jié)合菌株形態(tài)和生理生化特征等綜合分析， 鑒定該菌為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。

圖3 菌株L-217的16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA of strain L-217

2.4 產(chǎn)物的初步探究與鑒定

2.4.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響Fig.4 Effect of fermentation time on antibacterial effect

由圖4可知，該菌在培養(yǎng)至12 h時(shí)開始產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，隨時(shí)間增加，抑菌活性快速提高，在生長(zhǎng)至24 h時(shí)，表現(xiàn)出最大的抑菌活性。隨后，其抑菌活性呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，這可能是培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，該菌開始利用自身產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)。因此，將發(fā)酵培養(yǎng)24 h作為該菌抑菌活性測(cè)定的最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.4.2 熱處理和酸處理對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

Nisin具有親水和疏水兩重性，即在N-末端存在大量的疏水殘基，在C-末端存在著親水基團(tuán)，其表現(xiàn)出陽(yáng)離子多肽的特性，等電點(diǎn)在堿性范圍；其溶解度和穩(wěn)定性等與溶液的pH值密切相關(guān)[14]。Nisin的溶解度隨pH值的下降而提高，而在堿性條件下幾乎不溶解。熱穩(wěn)定性與其在不同pH值下的溶解度有關(guān)。溶液在pH 2.5或更低值的鹽酸溶液中煮沸，其活性不發(fā)生變化，即使在115 ℃加熱一定時(shí)間還很穩(wěn)定。121 ℃加熱30 min，尚未完全失去活性。當(dāng)pH值超過(guò)4時(shí)，溫度升高會(huì)使它在水溶液中迅速失活。根據(jù)這一特點(diǎn)，對(duì)篩選到的菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行研究，可對(duì)抑菌物質(zhì)是否為Nisin 進(jìn)行初步的鑒定。

圖5 pH和熱處理對(duì)發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的影響Fig.5 Effects of pH and heat treatment on bacteriostatic substances in fermentation broth

由圖5可知，未熱處理過(guò)的樣品，隨著pH的升高，抑菌物質(zhì)的活性呈下降趨勢(shì)，在中性環(huán)境甚至是堿性環(huán)境下，不再具有抑菌活性，這與Nisin的溶解性特點(diǎn)相符合，隨著pH的升高，溶解度降低，其活性也不穩(wěn)定。此外，在pH 6時(shí)的抑菌圈直徑并沒有太大幅度的降低，從這一點(diǎn)可以排除是某些有機(jī)酸干擾下造成的假陽(yáng)性，側(cè)面驗(yàn)證了起到抑菌效果的物質(zhì)就是細(xì)菌素。而在熱處理?xiàng)l件下，可以發(fā)現(xiàn)在pH 2、pH 3的條件下，90 ℃熱處理30 min，抑菌物質(zhì)的活性和未熱處理過(guò)的樣品活性基本一致，說(shuō)明該物質(zhì)在pH 2～3的條件下，具有極高的耐熱性。這一點(diǎn)可以說(shuō)明不是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的不具有耐熱性的大分子雙球菌素，進(jìn)一步證實(shí)該抑菌物質(zhì)極有可能就是具有熱穩(wěn)定性的Nisin。同時(shí)熱處理的發(fā)酵液也可以排除過(guò)氧化氫對(duì)抑菌效果造成的假陽(yáng)性干擾。

2.4.3 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的初純化

通過(guò)大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附純化后，得到純化液中抑菌物質(zhì)的濃度增大，表現(xiàn)出更好的抑菌活性，見圖6。

圖6 發(fā)酵液純化過(guò)程中各樣品抑菌效果圖Fig.6 Antimicrobial effect of each sample in the purificationprocess of fermentation broth

A，B，C，D對(duì)應(yīng)的樣品分別是發(fā)酵液、吸附殘液、洗脫液、旋蒸濃縮液，將4個(gè)樣品做抑菌圈試驗(yàn)，可以看到發(fā)酵液本身存在抑菌物質(zhì)，表現(xiàn)出抑菌特性；經(jīng)大孔樹脂吸附后的殘液中不再具有抑菌活性，說(shuō)明大孔樹脂將抑菌物質(zhì)全部吸附；而用pH 3.0的75%酒精洗脫后，加入Nisin活性Buffer稀釋得到的洗脫液，產(chǎn)生了抑菌圈，說(shuō)明抑菌物質(zhì)被洗脫下來(lái)；最后通過(guò)旋蒸濃縮，去除溶液中酒精的同時(shí)，提高了樣品中抑菌物質(zhì)的濃度。由圖6可知，旋蒸濃縮后的樣品，抑菌圈又顯著增大，為HPLC檢測(cè)做好了準(zhǔn)備。

2.4.4 HPLC對(duì)產(chǎn)物的分析鑒定

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于 Nisin 的檢測(cè)方法主要包括瓊脂擴(kuò)散法、生物熒光法、電泳法、比濁法和免疫吸附法等[15-19]，而HPLC法用于測(cè)定Nisin含量不僅簡(jiǎn)便快速、精密度高而且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，因此，本文釆用的檢測(cè)方法是Chan等[20]利用48 mmol/L三乙基胺磷酸鹽在232 nm下對(duì)Nisin的檢測(cè)方法。

圖7 濃縮純化液與Nisin標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比圖譜Fig.7 Contrast map of concentrated purified solution and Nisin standard sample

由圖7可知，Nisin標(biāo)準(zhǔn)品在11.4 min左右出現(xiàn)了吸收峰，出峰時(shí)間與所提供方法的出峰時(shí)間基本一致。因此，確定了Nisin的出峰時(shí)間；通過(guò)樣品與Nisin標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比可以看出，在純化的樣品中雖然仍存在著許多雜質(zhì)，但是它與標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)了同樣的吸收峰，證明該樣品中確實(shí)存在Nisin，印證了篩選到的就是產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌。

3 結(jié)論

本文根據(jù)乳酸乳球菌的特點(diǎn)先快速、準(zhǔn)確篩選到具有抑菌特性的菌株，根據(jù)形態(tài)特征和生理生化特性，并通過(guò)16S rDNA序列分析技術(shù)，將其確定為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，命名為L(zhǎng)-217。再進(jìn)一步通過(guò)熱處理和酸處理試驗(yàn)對(duì)抑菌物質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行初步的探究，最后通過(guò)HPLC法與Nisin標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)：該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)與Nisin標(biāo)準(zhǔn)品在同樣的時(shí)間具有吸收峰。綜合這兩方面的結(jié)果，可以認(rèn)定該菌株為具有產(chǎn)Nisin特性的乳酸乳球菌。本文從乳酸菌的篩選、Nisin的吸附、濃縮、純化，HPLC檢測(cè)進(jìn)行分析，建立了一套快速、準(zhǔn)確篩選Nisin產(chǎn)生菌株的方法，為從自然界中Nisin產(chǎn)生菌株的篩選和鑒定提供了有效依據(jù)，為天然食品添加劑Nisin的生產(chǎn)以及以此菌株為基礎(chǔ)的功能食品、醫(yī)用食品等領(lǐng)域提供了重要的菌株資源。