劉 迪 韓 莉 曾 妮 余婷婷 -王 亨 王 彬 榮 茂

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075)

喹喔啉類藥物是一類包含有喹喔啉-1,4-二氮氧結(jié)構(gòu)[1]通過化學(xué)合成的專用獸用藥物，因其具有良好的抗菌和促進生長的效果，被廣泛添加于禽、畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中[2]，其中喹乙醇是喹喔啉類藥物的典型代表[3]。動物基體對于喹乙醇有蓄積作用，并且會引起動物產(chǎn)生畸形，對人類更是有致突變和致癌的作用[4]。喹乙醇原藥的性質(zhì)不穩(wěn)定，在體內(nèi)代謝迅速，能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，其中的絕大多數(shù)性質(zhì)也不穩(wěn)定，無法被定量檢測。3-甲基-喹喔啉-2-羧酸(MQCA)作為喹乙醇的主要代謝產(chǎn)物之一，因其代謝過程比較長，并且殘留量相對穩(wěn)定，現(xiàn)在通常都是通過測定MQCA的含量來間接反映喹乙醇的殘留情況[5]。中國自2019年5月1日起停止經(jīng)營、使用喹乙醇獸藥的原料藥及各種制劑[6]，而早在1998年，喹乙醇就已經(jīng)被歐盟禁止作為飼料添加劑[7]。時至今日，MQCA用很多檢測方法可以檢測[8-12]，其中液相色譜法和液相—質(zhì)譜/質(zhì)譜為主流的檢測方式。動物源食品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，液相色譜法一般需要經(jīng)過相對復(fù)雜的前處理，且定性難度較大，容易產(chǎn)生假陽性；而液相—質(zhì)譜/質(zhì)譜檢出限低，抗干擾能力和定性能力較強，可以在降低檢出限的同時避免假陽性的產(chǎn)生。MQCA的前處理方式通常為酶解和水解(酸解)，酶解耗時長，酸解提取效率不高，后續(xù)凈化效果不徹底，檢出限高，靈敏度不足。采用液相—質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測也需要不斷地改進優(yōu)化前處理方法，縮短樣品測定時間，減少基質(zhì)效應(yīng)，提高靈敏度的同時保證準確度，李佩佩等[13]用免疫親和柱對MQCA進行特異性吸附，效果較好，但免疫親和柱價格成本較高，且容易堵塞[14]。痕量污染物分析檢測的重點是簡化操作，減少干擾，以期提高靈敏度；而難點是分離分析物和雜質(zhì)以及合適的凈化方法[15]。張小軍等[16]采用鹽酸水解提取MQCA，陰離子固相萃取柱凈化，對魚肉等水產(chǎn)食品的水解程度可以達到很好的效果，但對于畜禽肉水解效果并不是很理想；吳玉杰等[17]對水解液進行反復(fù)的液液萃取，操作繁復(fù)，過程損失大。

試驗擬建立堿水解提取，固相萃取法凈化和液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的3-甲基-喹喔啉-2-羧酸的分析方法，為快速檢測和監(jiān)管動物源性食品中3-甲基-喹喔啉-2-羧酸殘留提供技術(shù)保障和參考。

1 試驗部分

1.1 材料及試劑

雞肉、豬肉、魚：武漢市售；

陰性基質(zhì)：通過國家標準方法測定驗證；

3-甲基-喹噁啉-2-羧酸標準品：純度均≥99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

喹噁啉-2-羧酸-D4(quinoxaline-2-carboxylic-D4，QCA-D4)標準品：純度≥99%，德國Witega公司；

正己烷、鹽酸、氫氧化鈉：分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

乙腈、甲酸、甲醇、乙酸乙酯：質(zhì)譜級，德國默克公司；

Oasis MAX固相萃取柱：美國Waters公司；

試驗用水：去離子水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)，Millipore-Q超純水儀自制。

1.2 儀器與設(shè)備

串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀：Xevo TQD型，美國Water公司；

液相色譜儀：ACQUITY UPLC型，美國Water公司；

高速離心機：Allegra X-15R型，美國Beckman Coulter有限公司；

電子分析天平：XS204、ME2002E型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：HEI-VAP/LR20型，德國Heidolph GmbH公司；

超聲波清洗器：Elmasonic P型，德國艾爾瑪公司；

漩渦混合儀：EOFO基礎(chǔ)型，美國Talboys公司；

水浴氮吹儀：N-EVAP24型，美國Organomation公司。

1.3 標準溶液的配制

在兩個10 mL容量瓶中分別準確稱量10 mg MQCA和QCA-D4標準品，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的MQCA標準儲備液和1 mg/mL QCA-D4同位素內(nèi)標儲備液。放置于-20 ℃的冰箱，有效期3個月。根據(jù)需要，用甲醇將MQCA和QCA-D4標準儲備液稀釋成濃度均為1 μg/mL中間標準溶液。臨用前，將中間標準溶液用0.1%甲酸水溶液配制成0.5～50.0 ng/mL 的同位素內(nèi)標曲線，每毫升該標準工作液含有同位素內(nèi)標5 ng。

1.4 樣品處理

稱取5.00 g搗碎并已均勻混合的樣品到50 mL的聚丙烯離心管中，然后加入50 μL QCA-D4同位素內(nèi)標標準溶液，加入2 mol/mL NaOH溶液20 mL，渦旋均勻，60 ℃ 水浴條件下水解1 h[18]。待水解液冷卻至室溫后，用10 mol/L HCl溶液將水解液pH值調(diào)至1.0±0.2，4 000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入20 mL正己烷，充分混合，4 000 r/min離心5 min，去除正己烷層。向離心管中加入乙酸乙酯15 mL，渦旋混勻器上渦旋3 min，4 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至50 mL雞心瓶中。提取液用15 mL 乙酸乙酯復(fù)提一次，合并乙酸乙酯于同一雞心瓶中，50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至凈干，用5 mL 2%氨水溶液溶解殘渣，待凈化。用3 mL甲醇和3 mL水活化Oasis MAX固相萃取柱后，所有待凈化的液體均經(jīng)過MAX固相萃取柱，等待樣品溶液完全流出后，用3 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液，水和甲醇溶液依次淋洗， 將流出液全部棄去。 加壓吹干2 min，并用3 mL 2%的甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液收集于15 mL離心管中[19]。洗脫液置于50 ℃水浴下氮氣吹干，將殘余物用1.0 mL的0.1%甲酸水復(fù)溶，0.22 μm 有機濾膜過濾，供液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測。內(nèi)標法定量。

1.5 液相色譜條件

色譜柱型號：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；色譜柱溫度：35 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.30 mL/min；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫過程：0.0～1.0 min，98% A；1.0～2.5 min，98%～50% A；2.5～2.6 min，50% A；2.6～3.0 min，50%～10% A；3.0～3.2 min，10%～98% A；3.2～5.0 min，98% A。

1.6 質(zhì)譜參考條件

離子模式：正離子模式；離子源類型：電噴霧離子源(ESI源)；離子源溫度：120 ℃；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；毛細管電壓：2.00 kV；去溶劑氣：高純N2，流速：800 L/h，溫度：450 ℃；錐孔氣：高純N2，流速50 L/h；碰撞氣：高純Ar。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

分別在ESI+和ESI-模式下，根據(jù)目標化合物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，選擇響應(yīng)最高的離子加和峰作為母離子，通過對比ESI+和ESI-模式下的母離子響應(yīng)，確定試驗在ESI+下進行。對選定的母離子加碰撞能量擊碎，同時進行離子掃描，分析可能的斷裂規(guī)律以及根據(jù)二級碎片離子掃描質(zhì)譜圖，分別選取離子豐度相對較強的一對碎片離子作為定量離子，次強的一對碎片離子作為定性離子，最后在多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下分別對錐孔電壓、碰撞能量進行優(yōu)化。對于同位素內(nèi)標物質(zhì)而言，僅需一個豐度相對最強的一對碎片離子即可。表1中顯示了最終確定多反應(yīng)監(jiān)測條件的質(zhì)譜參數(shù)。

表1 3-甲基-喹噁啉-2-羧酸和內(nèi)標物的離子對及錐孔電壓、碰撞能量?

Table 1 Ion pair and cone voltage and collision energy of MQCA and internal standard

分析物母離子(m/z)子離子(m/z)錐孔電壓/V碰撞能量/eVMQCA189.0145.0?143.0301514QCA-D4179.0133.0?2917

? 帶*的離子為定量離子。

2.2 色譜條件的確定

MQCA為極性一般的弱酸性化合物，在C18柱上有好的保留效果[8]，因此采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)的超高效液相色譜柱進行試驗。同時，在正離子模式下以乙酸銨溶液作為流動相，會出現(xiàn)一定的離子抑制作用；而流動相中添加一定量的甲酸，減小pH值的同時，不僅可以改善峰型，還可以提高離子電離效率以及目標與雜質(zhì)的分離度。通過對0.1%甲酸溶液與乙腈、甲醇分別作為有機相組成流動相的效果進行了比較。對于標準品而言，乙腈和甲醇均有較好的峰型，甲醇作為流動相時的峰寬要大于乙腈作為流動相時的峰寬；并且分離樣品時，以乙腈作為流動相時不僅靈敏度略高，并且目標物和雜質(zhì)的分離效果明顯要比甲醇作為流動相時的目標物和雜質(zhì)的分離效果好，因此試驗選擇流動相為乙腈—0.1%甲酸溶液。色譜條件經(jīng)過優(yōu)化后，MQCA的峰形得到改善，與基質(zhì)中的雜質(zhì)也有較好的分離度，峰型尖銳，整個分離過程可以在5 min內(nèi)完成。標準溶液、空白基質(zhì)樣本及添加藥物樣本的選擇離子流色譜圖見圖1～3。

2.3 水解方式的選擇

水解方式一般為酶水解[20]、酸水解[21]、堿水解[22]3種，MQCA與其他獸殘檢測一樣，也是先水解組織(破壞目標物與細胞的結(jié)合)，再凈化提取液，然后再檢測凈化液的流程。酶水解過程十分溫和，需在(47±3) ℃振蕩水浴中反應(yīng)16 h以上，酶解過程耗時長且步驟繁瑣；酸水解反應(yīng)相對較溫和，所以對于豬肉等樣品，其水解效率不高。因為MQCA與組織主要是共價結(jié)合，采用酶解和酸解的方式并不能完全將MQCA從組織中解離出來[18]。強堿水解相對于酶解和酸解效果更好，反應(yīng)通常較為劇烈，能在短時間內(nèi)有效水解樣品中的蛋白質(zhì)并將MQCA從組織中解離出來。試驗通過改變堿水解時間以及NaOH堿溶液的濃度，通過水解液狀況評價水解效果。選擇水解時間分別為20，40，60，80，100，120 min，NaOH溶液濃度分別采用0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mol/L，在60 ℃下對樣品進行水解。通過對比發(fā)現(xiàn)，NaOH濃度太低，水解過程耗時長；NaOH濃度越高水解液相反會變得濃稠，不適合后續(xù)的提取凈化過程。選用2 mol/L NaOH溶液水解60 min時，基質(zhì)樣品被完全水解，MQCA從樣品中被完全釋放出來，沒有殘渣剩余。因此，選擇該條件進行后續(xù)試驗。

圖1 標準溶液選擇離子流色譜圖

圖2 空白基質(zhì)樣本選擇離子流色譜圖

圖3 添加藥物樣本的選擇離子流色譜圖

2.4 凈化條件的確定

動物源樣品通常包含大量的蛋白質(zhì)、脂肪等內(nèi)源性物質(zhì)，直接檢測必定會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，對檢測造成影響，對設(shè)備也會造成損害。常用凈化的方式有固相萃取法和液液萃取法，試驗采用液液萃取法與固相萃取法結(jié)合凈化的方式。大多數(shù)的文獻和國家標準都是選擇的MAX固相萃取小柱[19,21-23]，因為MQCA能解離形成負離子，可以與MAX上的季銨正離子發(fā)生相互作用結(jié)合。試驗發(fā)現(xiàn)，水解液pH較大，濾液比較黏稠，若不經(jīng)過處理直接過固相萃取柱容易堵塞固相萃取小柱篩板，使過柱流速變慢，導(dǎo)致后續(xù)凈化過程無法進行，因此必須先通過液液萃取過程，將目標物萃取出來。由于MQCA呈弱酸性，水解液必須要經(jīng)過酸化后MQCA才能形成分子形態(tài)，才能被乙酸乙酯萃取，并且MQCA分子在堿性條件下才能夠離解形成負離子，與MAX上的季銨正離子才能充分鍵合。試驗選擇用濃鹽酸對水解液進行酸化，強酸對蛋白起到一定的沉淀作用，乙酸乙酯萃取MQCA，濃縮乙酸乙酯后，用2%氨水溶液溶解殘渣，通過MAX固相萃取小柱凈化，整個過程符合陰離子固相萃取柱的陰離子交換作用的原理，可以達到理想的富集和凈化的效果。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

將MQCA標準溶液分別用流動相和空白基質(zhì)提取溶液稀釋成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL，均以峰面積為縱坐標，MQCA質(zhì)量濃度為橫坐標作圖，即可分別得到標準工作曲線和基質(zhì)曲線，通過兩個曲線的斜率的比值可知，MQCA的基質(zhì)曲線響應(yīng)值約為標準曲線響應(yīng)值的60%，說明MQCA在所驗證基質(zhì)中有一定程度的離子抑制效應(yīng)，檢測過程中的基質(zhì)抑制效應(yīng)和試驗提取過程中的損耗會對定量帶來誤差。為了定量更加精準，在實際樣品檢測中既可采取基質(zhì)匹配外標曲線校正法，也能采用同位素內(nèi)標標準曲線法進行定量。鑒于基質(zhì)匹配外表曲線校正法的操作相對比較麻煩，試驗采用同位素內(nèi)標標準曲線法作為最終的定量方法，MQCA和QCA化學(xué)性質(zhì)相近，參考相關(guān)標準和文獻[19,23-24]，選擇QCA-D4作為內(nèi)標。

2.6 線性關(guān)系和檢出限

根據(jù)上述所確定的液相條件、質(zhì)譜參數(shù)及構(gòu)建的MQCA殘留的檢測分析方法，對配制的0.5～50.0 ng/mL的MQCA系列標準工作曲線進行方法學(xué)指標分析。結(jié)果表明，在0.5～50.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，MQCA呈良好的線性關(guān)系，擬合曲線為y=0.659 6x+0.085 5(R2=0.999 7)。取陰性樣品，通過加入低濃度MQCA標準溶液制得濃度含量低的加標樣品，按照1.4方法對樣品進行處理，以3倍信噪比計算方法的檢出限，根據(jù)結(jié)果，確定此方法MQCA檢出限為0.1 μg/kg (S/N=3)。

2.7 回收率和精密度

分別準確稱取5.00 g豬肉、雞肉、魚肉搗碎樣品(陰性)，分別加入MQCA和QCA-D4標準溶液，得到0.1，0.2，1.0 μg/kg 3個濃度添加水平的加標樣，每個濃度水平做6個平行。所得樣品按照1.4方法處理，通過測定濃度與添加濃度之比計算回收率，并通過6次測定的回收率得出相對標準偏差。各基質(zhì)加標回收率和相對標準偏差見表2。由表2可知，動物源食品中目標化合物的回收率為95.6%～108.2%，相對標準偏差為3.4%～14.3%(n=6)。

表2魚，雞肉和豬肉中MQCA的加標回收率和相對標準偏差

Table 2 Additive recovery and relative standard deviation of MQCA in fish,chicken and pork(n=6)

樣品加標量/(μg·kg-1)回收率/%RSD/%0.1108.212.6魚肉0.2100.35.21.097.24.10.195.610.5雞肉0.296.77.21.099.33.70.1104.314.3豬肉0.297.64.21.0100.43.4

2.8 市售動物源食品的測定

采用試驗方法對流通市場中的30批動物源食品樣品(魚、雞肉、豬肉樣品各10個)進行檢測，結(jié)果表明，魚肉和雞肉樣品中均未檢出MQCA；有2個批次的豬肉中檢出了MQCA，其殘留量分別為0.23，3.08 μg/kg(根據(jù)GB/T 20746—2006國家標準方法測定的結(jié)果則為未檢出和2.87 μg/kg)。綜上可知，喹乙醇藥物在中國仍在使用并存在組織殘留的風(fēng)險，在一定程度上對食品安全造成了威脅。漁業(yè)養(yǎng)殖和禽類養(yǎng)殖過程中對于喹喔啉類藥物的使用和監(jiān)管有了一定的成效；而由于喹乙醇代謝物在豬肉中存在允許限量，豬飼料里面允許加入適量的喹乙醇，所以豬肉中相對檢出率要高。

3 結(jié)論

通過在堿性環(huán)境下水解提取樣品組織，MQCA能夠有效地從組織中游離，通過調(diào)節(jié)pH值在酸性介質(zhì)下液液萃取提取MQCA，經(jīng)過混合型強陰離子交換小柱凈化等樣品前處理技術(shù)除去大量雜質(zhì)，減少基質(zhì)效應(yīng)，建立了一種快速、準確檢測喹乙醇代謝物MQCA在動物源性食品中殘留量的LC-MS/MS方法。該方法分離效果良好，操作簡單快捷，準確度高，精密度較好。在0.1～1.0 μg/kg的添加水平范圍內(nèi)的平均回收率為95.6%～108.2%；相對標準偏差為3.4%～14.3%(n=6)。該方法適合動物源食品中MQCA殘留的快速定量定性分析。運用高靈敏度和強特異性的免疫學(xué)方法的對大批量樣品進行盲篩，以及結(jié)合液相串聯(lián)質(zhì)譜的強定性定量能力，發(fā)展基于新型材料更便捷的前處理方法，是今后亟需探索和發(fā)展的新方向。