馬建國，侯扶江，Saman BOWATTE

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 /蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

青藏高原作為全球海拔最高、面積最大的陸地生態(tài)系統(tǒng)[1]，面臨著草地退化的嚴(yán)峻考驗[2]，造成這一結(jié)果的原因有全球變化、人類干擾以及過度放牧。據(jù)調(diào)查，青藏高原90%的草地已經(jīng)開始退化，其中35%的草地嚴(yán)重退化成只有有毒植物覆蓋的“黑土灘”[3]。能夠直接或間接危害人和動物的植物通常被稱為有毒植物[4]。造成草地退化的因素中過度放牧被認(rèn)為是主要因素，草地退化最終將導(dǎo)致物種多樣性喪失和群落功能退化，有毒植物逐漸演替成為優(yōu)勢物種[5-6]。有毒植物的擴張會導(dǎo)致優(yōu)良牧草的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，草畜矛盾不斷激化，嚴(yán)重制約了牧區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，已成為草地生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)、牧區(qū)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境保護(hù)等工作的嚴(yán)峻問題[7]。因此，研究草地有毒植物具有重要意義。

有毒植物作為草地逆向演替的產(chǎn)物，能夠忍耐并適應(yīng)惡劣的生長環(huán)境，防止草地沙化和草地生態(tài)環(huán)境走向崩潰，但有毒植物的擴張所帶來的損失也不容忽視[8]。早在20 世紀(jì)60 年代任繼周[9]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒(Stellera chamaejasme)、醉馬草(Achnatherum inebrians)等有毒植物對家畜具有毒害作用，并針對不同有毒植物提出不同的防治措施。1998 年，美國農(nóng)業(yè)部成立了有毒植物研究實驗室，開展了一系列化感研究[10]。近年來關(guān)于有毒植物的研究日益增多，在調(diào)查青藏高原北部退化草地中有毒植物和優(yōu)良牧草種群豐度空間和氣候格局的關(guān)系時，Wu 等[11]發(fā)現(xiàn)降水是影響有毒植物和優(yōu)良牧草比例的主要氣候因素。也有報道稱，氣溫不斷升高以及越來越長的生長季也會加劇有毒植物的擴張[12]。王迎新等[13]圍繞草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)四個生產(chǎn)層論述了有毒植物在草地生態(tài)系統(tǒng)中的作用，認(rèn)為有毒植物的擴張是草地退化的標(biāo)志。然而，有毒植物的合理利用能提高牧區(qū)經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。在有毒植物的防控與利用上有學(xué)者提出了不同的方法，如人工拔除、使用除草劑等化學(xué)方法滅除、競爭種代替控制、生物防治和新藥物開發(fā)等[8]。

雖然已經(jīng)有許多關(guān)于有毒植物的研究[4-5,8,11]，但是關(guān)于有毒植物對地下過程影響的研究卻很少。植物會影響地下微生物群落、養(yǎng)分有效性(土壤C、N 等)、有機質(zhì)礦化、碳封存、土壤溫室氣體排放等[14]，當(dāng)草地中有毒植物的比例發(fā)生變化時，地下環(huán)境狀況也會隨之改變。這將對草地生產(chǎn)力和植物群落多樣性產(chǎn)生重大影響。瑞香狼毒是一種常見的家畜不喜食的有毒植物，在青藏高原高寒草甸上大量入侵。Sun 等[15]研究瑞香狼毒的傳播引起的土壤養(yǎng)分、碳氮庫大小和周轉(zhuǎn)率的變化，發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒斑塊形成了肥力島(即更高的土壤養(yǎng)分有效性)，從而促進(jìn)了其在高寒草甸內(nèi)的擴張。是否所有有毒植物都顯示出類似的效果，或者它們對土壤的影響是否在不同的有毒植物之間有所不同？這一重要疑問還沒有得到檢驗，因此，本研究假設(shè)，不同有毒植物的地下效應(yīng)存在差異，并且這些影響也不同于無毒的適口植物。為了驗證假設(shè)，本研究選取青藏高原中最主要的5 種有毒植物甘肅棘豆(Oxytropis kansuensis)、瑞香狼毒、披針葉黃華(Thermopsis lanceolata)、麻花艽(Gentiana straminea)、黃帚橐吾(Ligularia virgaurea)[16]和一種適口性優(yōu)勢種多年生草本植物垂穗披堿草(Elymus nutans)，比較它們對地下環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 研究樣地概況

本研究在甘肅省甘南州瑪曲縣阿孜畜牧科技示范園區(qū)天然草地進(jìn)行，該示范園區(qū)位于青藏高原東北部(33°36'40'' N，102°44'50'' E)，海拔3 550 m，年平均氣溫為1.4 ℃，年降水量為650 mm[17]。放牧家畜為牦牛，草地類型為典型高寒草甸，土壤類型為亞高山草甸土。由于長期超載過牧，樣地有毒植物滋生，主要包括黃帚橐吾、披針葉黃華、甘肅棘豆、瑞香狼毒以及龍膽科植物，適口性好的優(yōu)質(zhì)牧草主要有垂穗披堿草、禾葉嵩草(Kobresia graminifolia)、草地早熟禾(Poa annua)、洽草(Koeleria macrantha)、波伐早熟禾(P. poophagorum)等[17]。

1.2 樣品采集

2018 年8 月下旬，在該示范區(qū)天然草地上隨機選擇6 個區(qū)域，在每個區(qū)域內(nèi)同一種植物生長密集(蓋度 ＞ 90%)的地方進(jìn)行取樣，所選植物如表1所列[17]。齊地剪掉地上部分，分別用根鉆(直徑15 cm)取10 cm 深的土壤，在 24 h 內(nèi)，用2 mm 土篩去除土壤樣品中的植物殘體、石頭等，分裝成兩份樣品，一份 -20 ℃保存用于土壤微生物分析，另一份4 ℃保存用于土壤理化性質(zhì)的測定。

表 1 5 種有毒和1 種無毒植物特征Table 1 Details of five toxic and one non-toxic plant species used in this experiment

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

采用烘干法測定土壤水分，將土壤樣品置于鋁盒內(nèi)在105 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A，上海精宏)中烘干至恒重(約48 h)。用pH 計(PE-10，Sartorious, Germany)測定土壤pH (土∶水 = 1∶5)。使 用 元 素 分 析 儀(Vario EL / micro cube, Elementar,Hanau, Germany)測定土壤全碳(total carbon, TC)和全氮(total nitrogen, TN)。

1.4 土壤微生物指標(biāo)測定1.4.1 土壤微生物量碳測定

土壤微生 物生物量碳(microbial biomass carbon,MBC)的測定采用熏蒸-氯仿提取方法[18]。

1.4.2 土壤微生物DNA 提取

使 用FastDNA? spin kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)試劑盒提取土壤中的總DNA，將提取的樣品DNA 保存在 -20 ℃冰箱中備用。

1.4.3 土壤細(xì)菌、真菌和氮循環(huán)細(xì)菌的定量

使用CFX96 光學(xué)實時檢測系統(tǒng)(CFX96TM Thermal Cycler, USA)進(jìn)行實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)測定每個樣品的DNA，每個樣品3 個重復(fù)，來分析土壤細(xì)菌、真菌和氮循環(huán)細(xì)菌的基因拷貝數(shù)。土壤細(xì)菌、真菌基因拷貝數(shù)分別通過定量16S rDNA 和18S rDNA 擴增數(shù)量確定。通過標(biāo)靶amoA 基因來研究氨氧化細(xì)菌(ammoniaoxidizing bacteria, AOB)，標(biāo)靶nirS 基因研究亞硝酸還原菌，標(biāo)靶nosZ 基因研究氧化亞氮還原菌3 個氮循環(huán)關(guān)鍵細(xì)菌基因豐度。qPCR 反應(yīng)混合物(20 μL)，其中包含10 μL TB Green Premix Ex Taq (TaKaRa Biotech,大連，中國)，正向與反向引物各0.25 μL 和1.0 μL 土壤DNA 模板，之后使用滅菌的超純水補充到20 μL。利用克隆技術(shù)獲得微生物標(biāo)靶基因的重組質(zhì)粒，然后以10 倍梯度稀釋質(zhì)粒濃度用于qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物和熱循環(huán)條件如表2 所列。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2010 輸入并整理，用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素方差分析，顯著水平P＜0.05 的用Origin 2017 軟件作圖，對基因豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換以滿足正態(tài)分布要求。采用主成分分析法(Canoco 5.0)研究了有毒植物與土壤參數(shù)之間的相關(guān)性。

表 2 引物信息及反應(yīng)條件Table 2 qPCR primer details and thermal conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)比較

對有毒和無毒植物的土壤特性進(jìn)行分析(圖1)，結(jié)果表明，除土壤pH、C/N 以外，有毒植物對土壤理化性質(zhì)有顯著影響，且不同有毒植物對土壤理化性質(zhì)的影響存在差異。有毒植物的平均土壤含水量普遍高于無毒植物垂穗披堿草，但只有甘肅棘豆和披針葉黃華與其差異顯著(P＜0.05)。除麻花艽以外，所有有毒植物的土壤TC 顯著高于無毒植物垂穗披堿草(P＜0.05)，且在有毒植物中，狼毒的土壤TC 顯著高于披針葉黃華、麻花艽和黃帚橐吾(P＜0.05)。除麻花艽以外，有毒植物的土壤TN 顯著高于無毒植物垂穗披堿草(P＜0.05)。除麻花艽以外，所有有毒植物的土壤MBC顯著高于無毒植物垂穗披堿草(P＜0.05)，且有毒植物中MBC 最高的是甘肅棘豆，其次是瑞香狼毒，最低的是麻花艽。

圖 1 有毒和無毒植物對土壤特性的影響Figure 1 Effects of toxic and non-toxic plants on soil properties

2.2 土壤微生物豐度比較

對有毒和無毒植物的土壤微生物基因豐度進(jìn)行分析(圖2)，結(jié)果顯示，植物類型對土壤細(xì)菌、硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌有顯著影響，但對真菌的影響不顯著(P ＞ 0.05)。有毒植物的平均細(xì)菌豐度低于無毒植物垂穗披堿草，但只與狼毒、披針葉黃華和麻花艽差異顯著(P＜0.05)，且有毒植物物種之間差異不顯著(P ＞ 0.05)；所有有毒植物的土壤硝化細(xì)菌豐度顯著低于無毒植物垂穗披堿草(P ＜0.05)，且有毒植物中黃帚橐吾的AOB 基因豐度高于其他有毒植物。狼毒的土壤nirS 基因顯著低于垂穗披堿草、甘肅棘豆和黃帚橐吾(P＜0.05)。植物類型對土壤nosZ 基因豐度有顯著影響(P ＜0.05)。

圖 2 有毒和無毒植物對土壤微生物基因豐度影響Figure 2 Effects of toxic and non-toxic plants on soil microbial gene abundance

2.3 土壤特性與植物相關(guān)性

4 種有毒植物(甘肅棘豆、披針葉黃華、瑞香狼毒、黃帚橐吾)與土壤理化性質(zhì)正相關(guān)，但與土壤微生物負(fù)相關(guān)；相反，無毒植物垂穗披堿草與土壤微生物正相關(guān)，與土壤理化性質(zhì)負(fù)相關(guān)(圖3)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，有毒植物(除麻花艽)對青藏高原高寒草甸土壤特性有顯著影響，且不同于無毒植物垂穗披堿草，同時不同有毒植物對土壤特性的影響也存在差異。而毒性最低的麻花艽對土壤特性的影響與無毒植物垂穗披堿草相似。王文穎等[24]發(fā)現(xiàn)，高寒矮嵩草草甸麻花艽對土壤特性影響小，可能是麻花艽根際分泌物作用小，且其生長對養(yǎng)分需求小的共同作用。有毒植物能夠提高土壤養(yǎng)分，這一研究結(jié)果與Sun 等[15]對青藏高原高寒草甸不同地形瑞香狼毒對土壤養(yǎng)分影響的結(jié)果一致。但吳天馬等[25]分析云南、四川紫莖澤蘭(Ageratina adenophora)對土壤特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其顯著降低了土壤碳、氮、磷等養(yǎng)分，這可能與植物的生長節(jié)律有關(guān)。

有毒植物(除麻花艽)土壤TC、TN 都明顯高于無毒植物垂穗披堿草，這是由于動物選擇性采食垂穗披堿草等優(yōu)良牧草，減少有毒植物因動物采食而造成的組織損失。同時，有毒植物的擴張導(dǎo)致返還到土壤中的枯落物產(chǎn)量增加[26]，這與瑞香狼毒[15]和入侵種綠毛山柳菊(Hieracium pilosella)[27]的研究結(jié)果相似。豆科植物(甘肅棘豆、披針葉黃華)具有很強的生物固氮能力，可預(yù)測隨這兩種有毒植物的擴張，將有更高的氮在土壤中得到積累。通常情況下，不同植物根際釋放的化學(xué)物質(zhì)具有特異性，致使植物類型對土壤pH 的影響不同[28]。我們假設(shè)這種現(xiàn)象在有毒植物中也會發(fā)生，因為已知有毒植物在根際釋放的化學(xué)物質(zhì)不同[29-30]。但本研究中植物類型對土壤pH 無影響。安冬云等[31]對瑞香狼毒發(fā)生區(qū)與未發(fā)生區(qū)土壤特性差異的研究中，發(fā)現(xiàn)其對土壤pH 影響不顯著。除麻花艽外，有毒植物顯著提高土壤MBC，但本研究發(fā)現(xiàn)有毒植物降低細(xì)菌豐度，對真菌無影響。一般認(rèn)為，細(xì)菌和真菌的豐度與土壤MBC 顯著相關(guān)[32]。這可能是存在有適應(yīng)有毒植物根境的特殊小動物，在測定MBC 時被熏蒸殺死，造成MBC 結(jié)果偏高。

圖 3 植物與土壤理化性質(zhì)和微生物豐度相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis of plant and soil physicochemical properties and microbial abundance

不同植物根系分泌不同的化學(xué)物質(zhì)，對土壤微生物影響也不同。已有研究表明，有毒植物可以通過改變土壤中原有的微生物結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)擴張，同時有毒植物入侵改變了凋落物的結(jié)構(gòu)也將影響參與枯落物分解的細(xì)菌。也有研究表明，瑞香狼毒的擴張降低了多酚氧化酶[33]。此外，無毒植物垂穗披堿草建植可以提高土壤細(xì)菌豐度[34]，這就能解釋本研究中發(fā)現(xiàn)的有毒植物降低了土壤微生物細(xì)菌豐度。一方面是因為有毒植物形成了只適合自身生長的細(xì)菌群落，另一方面是因為無毒植物垂穗披堿草枯落物中含有大量難分解物質(zhì)(如纖維)，需要大量的細(xì)菌參與分解。相同的結(jié)果在雜草五爪金龍(Ipomoea cairica)入侵地得到驗證[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，有毒植物能降低土壤氮循環(huán)細(xì)菌豐度。AOB 作為硝化作用的限速步驟，參與氨轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽反應(yīng)，控制著整個硝化作用速率，當(dāng)植物和土壤微生物消耗硝酸鹽的速率小于硝化反應(yīng)速率，將導(dǎo)致氮的凈流失。有研究表明，一些非洲草種能夠限制土壤中的硝化作用來防止氮的流失[36]，本研究5 種有毒植物均降低了土壤AOB 基因豐度，這種限制土壤硝化作用的方式將減少有毒植物擴張區(qū)土壤中氮的凈流失，增加土壤有效氮含量，從而促進(jìn)有毒植物自身生長[37]，同時有毒植物的這一機制將防止水體富營養(yǎng)化、減少N2O的排放。同樣的結(jié)果在紫菀(Aster tataricus)入侵歐洲和美國時候也得到驗證[38]。不過，關(guān)于擴張入侵種對土壤AOB 基因影響結(jié)果不一，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)大麥狀雀麥(Bromus hordeaceus)在改變?nèi)肭值赝寥繟OB 群落結(jié)構(gòu)的同時增加了AOB 豐度[39]。造成這種結(jié)果不一的原因可能是不同植物在不同生長地表現(xiàn)出不同的適應(yīng)機制。因此，如果能平衡放牧和有毒植物之間的關(guān)系，不僅能解決放牧和有毒植物擴張的對立矛盾，還能收獲生態(tài)環(huán)境效益。PCA 清楚地表明土壤特性與有毒植物呈正相關(guān)關(guān)系，并且微生物與有毒植物呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而無毒植物正好相反。這說明本研究選取的幾種有毒植物在該地區(qū)競爭趨于穩(wěn)定，形成了一套完整的養(yǎng)分競爭模式。

有毒植物本屬于草地固有植被，其擴張是由草地嚴(yán)重超載，環(huán)境走向邊緣導(dǎo)致的。這種現(xiàn)象雖然阻礙了牧區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護(hù)等工作，但本研究認(rèn)為有毒植物在草地養(yǎng)分固定，防止氮流失等功能上優(yōu)于無毒植物，這一機制有利于保護(hù)水質(zhì)、減少N2O 溫室氣體的排放，提高退化草地植被多樣性和生產(chǎn)力。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)有毒植物能明顯改變青藏高原高寒草甸地下環(huán)境，如提高土壤養(yǎng)分含量(TC、TN、MBC)，降低土壤氮循環(huán)細(xì)菌豐度，這一機制表明平衡植物群落中有毒植物的比例具有重要意義。未來關(guān)于有毒植物的研究可以控制模擬不同比例下有毒植物對土壤和無毒植物的影響，探究有毒植物的擴張機制，針對不同的有毒植物提出不同的防控與利用措施。