●趙文杰 陳麗紅 李曉霞

昆布是臨床常用中藥，具有消痰軟堅(jiān)、泄熱利水、止咳平喘、散結(jié)的作用。常用于癭瘤、瘰疬、疝氣下墮、咳喘、水腫。多個(gè)經(jīng)方以昆布為君藥，如昆布散、三香昆布丸、五癭昆布方、海藻玉壺湯等，在治療癭瘤、瘰疬等疾病中發(fā)揮了重要的作用。昆布的主要活性成分為昆布多糖（Laminarin）。近年來，研究表明其可通過增強(qiáng)T 細(xì)胞的增殖，提高NK 細(xì)胞的活性等作用提高機(jī)體免疫力，亦可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡而實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用[1]。昆布多糖以β-1，3連接的葡聚糖為主，與真菌細(xì)胞壁成分β-1，3葡聚糖分子結(jié)構(gòu)相似，是模式識(shí)別受體TLR-2、Dectin-1的配體。細(xì)胞壁作為藥物靶點(diǎn)研究已成為抗真菌藥物的研究熱點(diǎn)[2]。模式識(shí)別受體是機(jī)體天然免疫識(shí)別病原微生物的第一道防線，其識(shí)別并引導(dǎo)吞噬細(xì)胞吞噬病原真菌是機(jī)體清除病原菌的最重要的防御機(jī)制。昆布多糖具有成為新的抗真菌的免疫調(diào)節(jié)劑或疫苗的潛能，但其作用過程及機(jī)制并未得到完整的解釋[3-4]。

糖皮質(zhì)激素是臨床常用的抗炎及免疫抑制劑。長期大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療的病人可出現(xiàn)致命的侵襲性真菌感染（invasive fungal infections，IFI），臨床常見的侵襲性真菌為白色念珠菌(Candida albicans)及煙曲霉(Aspergillus)。如何降低免疫抑制狀態(tài)下機(jī)會(huì)性真菌感染，如何有效地治療深部真菌病已成為現(xiàn)實(shí)的難題。地塞米松(Dexamethasone，DEX)可降低巨噬細(xì)胞的識(shí)別、吞噬真菌的能力[5]，但其機(jī)制尚不明確。那么昆布多糖能否作為免疫調(diào)節(jié)劑對巨噬細(xì)胞識(shí)別與吞噬病原真菌功能產(chǎn)生影響，從而對抗免疫抑制下的機(jī)會(huì)性真菌感染？

筆者通過建立昆布多糖、地塞米松與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的免疫抑制模型，研究昆布多糖對巨噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬病原真菌的作用，以期探討昆布多糖對免疫抑制狀態(tài)下巨噬細(xì)胞的免疫識(shí)別及吞噬功能的影響。從而為機(jī)會(huì)性真菌的防治提供新的治療思路：針對模式識(shí)別受體激動(dòng)劑的應(yīng)用及靶向治療的定位等，亦為常用中藥昆布的開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 真菌的取材及鑒定及培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用煙曲霉購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)醫(yī)學(xué)真菌中心，標(biāo)準(zhǔn)菌株為：煙曲霉CCCCM ID A1。刮取菌落加入盛有無菌生理鹽水10mL 及8 個(gè)玻璃珠的三角燒瓶內(nèi)，振蕩20min 后用8 層粗紗濾去菌絲，制成濃度為1×107CFU/mL孢子混懸液。

1.2 巨噬細(xì)胞RAW264.7RAW264.7 細(xì)胞系購自中科院細(xì)胞庫，離心去凍存液：放至離心機(jī)中500G離心2min，棄上清，應(yīng)用37℃、5%1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)重懸細(xì)胞，吹打，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106分瓶。置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，換液、傳代時(shí)間視細(xì)胞生長情況而定。

1.3 試驗(yàn)方法巨噬細(xì)胞培養(yǎng)2～3天后，換液，巨噬細(xì)胞1×106cell/孔，每孔加入1×107煙曲霉分生孢子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。共培養(yǎng)細(xì)胞分為四組：A.煙曲霉分生孢子組；B.煙曲霉分生孢子+昆布多糖組；C.煙曲霉分生孢子+地塞米松組；D.煙曲霉分生孢子+昆布多糖+地塞米松組。巨噬細(xì)胞存活率檢測：各組共培養(yǎng)2h后，取出培養(yǎng)板中的蓋玻片。臺(tái)盼藍(lán)染色，光鏡下觀察200個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算存活率。巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)檢測：吞噬指數(shù)=被吞噬的分生孢子數(shù)/吞噬了分生孢子的巨噬細(xì)胞數(shù)。各組共培養(yǎng)2h 后，取出培養(yǎng)板中的蓋玻片，PAS染色，光鏡下觀察200個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算吞噬指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 昆布多糖對各組巨噬細(xì)胞存活率的影響臺(tái)盼藍(lán)染色，光鏡下觀察巨噬細(xì)胞存活率：（1）與煙曲霉分生孢子組比較，地塞米松可增加共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的存活率（P＜0.05），昆布多糖可降低共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的存活率（P＜0.05）；（2）與地塞米松組比較，昆布多糖可降低共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的存活率（P＜0.05）。見圖1、圖2。

圖1 各組共培養(yǎng)2h后各組巨噬細(xì)胞存活率（×400）（A為煙曲霉分生孢子，DEX為地塞米松，L為昆布多糖）

圖2 巨噬細(xì)胞與煙曲霉分生孢子共培養(yǎng)2h后各組巨噬細(xì)胞存活率（A為煙曲霉分生孢子，DEX為地塞米松，L為昆布多糖）

2.2 昆布多糖對各組巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響與煙曲霉分生孢子組比較，昆布多糖可增加共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)（P＜0.05）；地塞米松降低共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)（P＜0.05）。與地塞米松組比較，昆布多糖可增加巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)（P＜0.05）。見圖3、圖4。

3 討論

圖3 各組巨噬細(xì)胞吞噬分生孢子（×400）（A為煙曲霉分生孢子，L為昆布多糖，DEX為地塞米松）

昆布，藥用來源為海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布的干燥葉狀體，是一種重要的食用及藥用植物。昆布?xì)庑?，味咸，入肝、胃、脾?jīng)，具有化痰、軟堅(jiān)散結(jié)、止咳平喘、散結(jié)行水之功效?！侗静菥V目》中指出：“昆布下氣，……海島之人愛食之，為無好菜，只食此物，服久相習(xí)，病亦不生……”初步提及了昆布的“免疫增強(qiáng)”作用。隨著昆布食用及藥用功能的研究不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其可以提高機(jī)體細(xì)胞免疫從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力[3]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中研究了昆布多糖對巨噬細(xì)胞的免疫識(shí)別及吞噬功能的影響，進(jìn)一步證實(shí)了昆布的免疫增強(qiáng)作用。

正常免疫狀態(tài)下，人體吸入的真菌孢子可被機(jī)體天然的免疫系統(tǒng)清除，因此不易致病?，F(xiàn)今對自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、腫瘤、器官移植術(shù)后等的治療仍大量采用糖皮質(zhì)激素。隨之而來的免疫抑制狀態(tài)下的侵襲性真菌感染越來越多，逐漸成為這類疾病的重要致死因素?？拐婢幬锬退幵黾右喑蔀橹委熤械募謫栴}[6]，上市不久的棘白素類抗真菌藥也出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象[7]。煙曲霉是臨床上僅次于白念珠菌的一種重要的條件致病真菌。近年來煙曲霉病的發(fā)病率呈上升趨勢[8-9]。機(jī)體殺滅煙曲霉的免疫細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞。其識(shí)別、吞噬、殺傷煙曲霉的功能決定了曲霉病的發(fā)展方向。校正免疫抑制狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬真菌能力亦成為抗真菌治療的關(guān)鍵。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)地塞米松可以降低巨噬細(xì)胞對煙曲霉分生孢子的吞噬指數(shù)，同時(shí)提高共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的存活率。巨噬細(xì)胞存活率高，表明其因吞噬殺傷病原真菌后的細(xì)胞調(diào)亡率低，即其識(shí)別吞噬病原真菌功能低下。昆布多糖則能夠增加巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，降低共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的存活率，并可以逆轉(zhuǎn)地塞米松對巨噬細(xì)胞識(shí)別與吞噬的抑制作用。說明昆布多糖可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對煙曲霉識(shí)別與吞噬，從而說明了昆布多糖在機(jī)體抗真菌中的免疫增強(qiáng)作用。

圖4 各組巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)（A為煙曲霉分生孢子，L為昆布多糖，DEX為地塞米松）

筆者在以往的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了昆布多糖可上調(diào)TLR-2與Dectin-1表達(dá)[10]，其不能激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，而高表達(dá)的模式識(shí)別受體可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的識(shí)別病原能力。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)可以推論：昆布多糖的抗真菌天然免疫增強(qiáng)作用，即其增強(qiáng)巨噬細(xì)胞識(shí)別與吞噬病原真菌的作用，可能與其上調(diào)模式識(shí)別受體TLR-2 與Dectin-1 相關(guān)。而正因?yàn)槔ゲ级嗵遣荒軐C(jī)體產(chǎn)生促炎反應(yīng)即致病性反應(yīng)，所以其臨床藥理安全性高。

昆布多糖有望成為侵襲性真菌病防治的免疫調(diào)節(jié)劑及有效的靶向藥物。真菌免疫過程十分復(fù)雜，其被機(jī)體天然免疫識(shí)別及被殺傷細(xì)胞吞噬后，激活細(xì)胞通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程最終產(chǎn)生效應(yīng)性炎癥因子，最終完成炎癥過程。昆布多糖通過何種信號(hào)途徑來實(shí)現(xiàn)其免疫增強(qiáng)作用，仍需要深入研究。昆布是廉價(jià)、高產(chǎn)的常用中藥，開發(fā)其功效及療效，具有深遠(yuǎn)的意義。