許培磊，韓先焱，范書田，王月，張寶香，李昌禹，艾軍，路文鵬※，吳漢

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學園藝學院，長春 130118；3.荏平縣信發(fā)街道林業(yè)站，山東 聊城 252000）

五味子〔Schisandra chinensis (Turcz.) Baill〕主要分布于中國東北、朝鮮半島、日本、韓國及俄羅斯的遠東地區(qū)，其果實為我國的常用名貴中藥材。近年來，五味子人工栽培迅猛發(fā)展，由于五味子原生境多為半陰生環(huán)境，空氣濕潤、溫度變化緩和，而在人工栽培條件下葉片常常受到霜害等不利環(huán)境條件的影響，影響植株的生長和正常開花結(jié)果[1]，影響產(chǎn)量和經(jīng)濟效益。早春霜害一般發(fā)生在每年的5 月5～20 日，常出現(xiàn)1～2 次3～ 2 ℃低溫。東北地區(qū)五味子種植區(qū)每年都會發(fā)生不同程度的霜凍危害，程度比較輕的部分枝葉凍傷和花器官受害，嚴重的則直接導致死亡[2]。五味子栽培面臨減產(chǎn)和顆粒無收的風險。葉綠素熒光分析技術(shù)可以快速、靈敏地檢測植物光合生理狀況，直觀地顯示低溫對植物的脅迫及植株的抗性[3]。因此，本研究對低溫脅迫下五味子葉片的熒光特性進行檢測，旨在為篩選五味子抗低溫種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所五味子資源圃中‘嫣紅’品種為試材，選擇生長勢、株高大致相同的2 年生盆栽嫁接植株18 盆，于2016 年8 月上旬，每株選取葉片大小、生長狀況一致的向陽健康成熟葉片為試材供測定。

1.2 方法

將五味子品種‘嫣紅’盆栽苗放在1 ℃和6 ℃的環(huán)境中處理1、2、3 d，每個處理選3 盆植株，在不同處理時間運用葉綠素熒光成像儀對葉片的熒光參數(shù)進行測定、成像分析和石蠟切片觀察。

1.2.1 石蠟切片方法 植物組織結(jié)構(gòu)的觀察采用石蠟切片法，將經(jīng)FAA 固定的試驗材料，通過叔丁醇梯度脫水、滲蠟、浸蠟、包埋等過程，用自動切片機切片，切片厚度10～12m，番紅-固綠對染，加拿大樹膠封片，顯微鏡觀察并照相，圖片放大倍數(shù)為100 。

1.2.2 葉綠素熒光成像觀察 采用葉綠素熒光成像系統(tǒng)測定葉綠素熒光參數(shù)，葉片經(jīng)暗適應20 min，將待測葉片置于樣品臺，每個葉片上設定3 個直徑1 cm的自動光學檢測（AOI），調(diào)節(jié)測量光0.5mol（/m2·s），測定初始熒光Fo，設置光化光強度PAR 為205mol（/m2·s）（植物用來進行光合作用，與生長環(huán)境光強一致），飽和脈沖強度為2 700mol（/m2·s），持續(xù)時間為0.8 s。在軟件的Kinetics窗口檢測各葉綠素熒光參數(shù)的動力學變化曲線，相應數(shù)據(jù)可直接從Report 窗口導出。相關的葉綠素熒光參數(shù)包括光合系統(tǒng)Ⅱ（以下簡稱 PSⅡ）的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm（PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化率）、PSⅡ的實際量子產(chǎn)量PSⅡ、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NPQ）、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NO）、電子傳遞速率rETR。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

五味子葉片葉肉組織由上表皮（a）、柵欄組織（b）、海綿組織（c）和下表皮（d）組成。對照五味子葉片的葉肉組織顯示，柵欄組織排列緊密，細胞壁、細胞質(zhì)等內(nèi)含物較多；與對照相比，低溫脅迫使葉片厚度變薄，1 ℃和6 ℃脅迫分別處理1 d和2 d時，其柵欄組織變得松散稀疏，內(nèi)含物變少，染色較淺，以處理1 d 時更為明顯；但隨著脅迫處理時間的延長，第3 天時，其柵欄組織逐漸恢復緊密狀態(tài)，內(nèi)含物較處理前2 天增多；不同溫度處理間的葉肉組織結(jié)構(gòu)變化不明顯。結(jié)果見圖1。

圖1 ‘嫣紅’經(jīng)低溫脅迫后的葉肉細胞結(jié)構(gòu)Fig.1 Mesophyll structure of'yanhong'under low temperature stress

2.2 五味子葉片葉綠素熒光參數(shù)及成像變化

Fv/Fm 是PS II 的最大量子效率，反映植物潛在最大光合能力[4]。1 ℃和6 ℃處理 3 d 過程中，在第 2 天1 ℃處理條件下，其Fv/Fm 最低，與對照相比下降了3.8%，由此可見，該參數(shù)在低溫脅迫過程中變化不大，成像結(jié)果差異亦不明顯。結(jié)果見圖2、3。

圖2 ‘嫣紅’經(jīng)低溫脅迫后的葉綠素熒光參數(shù)變化Fig.2 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of'yanhong'under low temperature stress

圖3 ‘嫣紅’經(jīng)低溫脅迫后的葉綠素熒光成像變化Fig.3 Changes of chlorophyll fluorescence imaging of'yanhong'under low temperature stress

Y（NPQ）是PSII處調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量，在植物接受的光強過剩時，可以通過調(diào)節(jié)熱耗散來保護機體，是光保護的重要指標。qN 反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，也反映了植物的光保護能力[6]，該研究中，上述2 個參數(shù)變化趨勢一致，1℃處理2d的值最高，6℃處理1d的值最低，說明1℃下的光保護能力比6℃時高，其將過剩光能轉(zhuǎn)換為熱的能力較高，相比1 ℃處理條件，其對光的需求更低（圖2）。Y（NO）指PS II 處非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量。若Y（NO）較高，則表明光化學能量轉(zhuǎn)換和保護性的調(diào)節(jié)機制不足以將植物吸收的光能完全消耗掉。即入射光強超過了植物能接受的程度。這時，植物可能已經(jīng)受到損傷，或者繼續(xù)照光植物將受到損傷。Y（NO）是光損傷的重要指標。6℃處理1 d 的Y（NO）最高，說明該條件下的入射光強過剩，在6℃低溫處理初始階段，葉片對光比較敏感（圖2）。

rETR為相對電子速率，常被用于反映植物受脅迫程度的指示參數(shù)[7]。低溫脅迫影響葉片的光合電子傳遞速率，隨著光強不斷增大，處理的電子傳遞速率均低于對照，2 d 1 ℃條件的電子傳遞速率最低，與PSⅡ趨勢一致，說明在該條件下，其光合機構(gòu)受脅迫最嚴重。結(jié)果見圖4。

圖4 ‘嫣紅’經(jīng)低溫脅迫后的光響應電子傳遞速率變化Fig.4 Changes of electron transfer rate of'yanhong'under low temperature stress

3 結(jié)論與討論

葉綠素熒光分析技術(shù)在植物應答逆境脅迫過程中被廣泛用于抗性種質(zhì)的評價和抗性機理研究，如在番茄[8-9]、高粱[10]、篤斯越橘[11]等植物均有大量報道。研究發(fā)現(xiàn)，低溫弱光脅迫使甜椒幼苗萎蔫并嚴重失水[12]。柵欄組織層數(shù)少、柵欄組織細胞細長的茶藨屬植物比較抗寒[13]。伍寶朵等[14]發(fā)現(xiàn)了胡椒葉片厚度隨低溫脅迫時間延長而降低，柵欄組織和海綿組織細胞隨著脅迫時間的延長損傷加劇。較抗寒的黃瓜葉片具有較強的保水力[15]?？梢姡蜏孛{迫對植株葉片結(jié)構(gòu)影響較大。在低溫處理過程中，五味子葉片厚度變小，在處理1d和2d時，柵欄組織排列整齊度降低，細胞內(nèi)含物變少；處理3 d 時，葉片柵欄組織恢復緊密狀態(tài)，說明在零上低溫脅迫處理時，五味子葉片經(jīng)低溫脅迫后能逐漸恢復并適應。

Fv/FM與PSⅡ的顯著降低說明，低溫導致PSⅡ反應中心發(fā)生部分失活或傷害。本研究中，五味子經(jīng)低溫處理后，其Fv/FM參數(shù)變化與成像變化均不顯著，不能指示五味子經(jīng)低溫脅迫后的傷害PSⅡ可指示低溫處理植物的實際光合能力和實際光合效率，該值降低后又回升，表明五味子在經(jīng)歷低溫初期有抵御能力，能夠在一段時間內(nèi)維持光合效率，超過抵御的臨界點，其光合效率就會大幅度降低，隨后再升高，植物會有一定的自愈能力，且與脅迫程度有關，因此，該指標可作為篩選五味子抗低溫種質(zhì)的參數(shù)。結(jié)合熒光參數(shù)成像結(jié)果PSⅡ、NPQ及Y（NPQ）均能指示出五味子在2 d 1 ℃條件下的變化PSⅡ圖像與脅迫程度相關性更大，可以直觀地體現(xiàn)五味子受脅迫程度。