郭倩倩，王大濤，孫紅梅，李春義

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112）

鹿茸是哺乳動(dòng)物中可以完全再生的附屬器官[1]。Li 等[2-3]研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸再生是基于干細(xì)胞的過程。鹿茸干細(xì)胞包括生茸區(qū)骨膜細(xì)胞（Antlerogenic periosteal cells，APCs）與角柄骨膜細(xì)胞（Pedicle periosteal cells,PPCs），它們分別是鹿茸發(fā)生與再生的關(guān)鍵[4]。有限的鹿茸干細(xì)胞通過井然有序地快速分裂增殖與分化，生成完整的鹿茸組織[2]。然而，參與這一過程的分子機(jī)制還不是很清楚。

組織再生最基本的生物學(xué)特征之一是細(xì)胞的快速分裂增殖，這一過程離不開嚴(yán)格的細(xì)胞周期調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，再生模型（如蠑螈、兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物肝臟、MRL 品系小鼠等）中，再生細(xì)胞表現(xiàn)出一種獨(dú)特的細(xì)胞周期表型，即細(xì)胞大多數(shù)阻滯于G2/M 期[5-7]。在MRL 品系小鼠的再生模型中，Bedelbaeva 等[8]證實(shí)，組織再生與p21 基因的不表達(dá)有關(guān)，敲除p21 基因的非再生小鼠獲得了再生表型，同時(shí)，也表現(xiàn)出G2/M阻滯的細(xì)胞周期分布，由此，揭示了p21 基因與再生有著密不可分的聯(lián)系。

p21蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，參與細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制，是細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)的重要組成部分[9-10]。當(dāng)細(xì)胞檢測(cè)到染色體DNA 在G1/S 期受到損傷時(shí)，p53 基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，p21 基因被激活，阻止細(xì)胞進(jìn)一步增殖，直到DNA 損傷修復(fù)完成，以此確保遺傳物質(zhì)精確傳遞給下一代[11-13]。缺乏p21 基因則可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞G1/S監(jiān)測(cè)點(diǎn)的功能缺陷，造成對(duì)G2/M監(jiān)測(cè)點(diǎn)的依賴，表現(xiàn)出G2/M 阻滯的特殊細(xì)胞周期表型，同時(shí)，也會(huì)帶來細(xì)胞失控性增殖的潛在威脅[8,14-17]。

鹿茸再生是一種重要的哺乳動(dòng)物組織器官再生模型，推測(cè)p21 蛋白在鹿茸干細(xì)胞周期調(diào)控與鹿茸再生中扮演著重要角色。本試驗(yàn)以鹿臉部骨膜細(xì)胞（Facial periosteal cells，F(xiàn)PCs）為對(duì)照細(xì)胞，研究鹿茸干細(xì)胞（APCs 與PPCs）中p21 基因的表達(dá)水平，初步探討該基因在鹿茸干細(xì)胞中的功能性作用，以期為從細(xì)胞周期角度闡明鹿茸再生的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞

包膜質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒pCMV-dr8.91（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；鹿茸干細(xì)胞（APCs、PPCs、）、FPCs、人胚腎細(xì)胞 293t、感受態(tài)細(xì)胞 DH5甘油菌、p21RNA 干擾慢病毒載體―重組質(zhì)粒pLVTHM（靶向p21shRNA 序列為：shRNA 正義鏈5-cgcgtcccc GCGGTGGAACTTCGACTTT ttcaagaga AAAGTCGAAGTTCCACCGC tttttggaaat-3；shRNA 反義鏈5-cgatttcca aaaa GCGGTGGAACTTCGACTTT tctcttgaa AAAGTCGAAGTTCCACCGC gggga-3）（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省省部共建特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、構(gòu)建并保存）。

1.2 試劑

大量質(zhì)粒DNA 提取試劑盒（Qiagen 公司）；酵母提取物、胰蛋白胨、氨芐青霉素、RNaseA、二甲基亞酚（Sigma公司）；NaCl、無水乙醇、氯仿（北京化工廠）；改良型杜氏培養(yǎng)基（DMEM）、胰蛋白酶、Lipofectamine 2 000（Invitrogen 公司）；干細(xì)胞專用胎牛血清 FBS（Clark 公司，）；碘化丙啶（PI）、UNlQ-10 柱式 Trizol 總RNA抽提試劑盒（生工生物工程有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa 公司）；熒光定量試劑盒（Roche 公司）；其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton,Dickinson and Company公司）、ABI7500 熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 公司）。

2 方法

2.1 qRT-PCR鑒定p21mRNA的表達(dá)水平

RNA 抽提試劑盒提取 APCs、PPCs、FPCs 細(xì)胞總RNA，并檢測(cè)260、280 nm處的OD值，確定所提RNA的濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以其為模板，使用Roche 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，以Actin 基因用于校正結(jié)果的內(nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15min，94 ℃變性 15 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 32 s，共 40個(gè)循環(huán)。

針對(duì)p21 基因，設(shè)計(jì)熒光定量PCR 上、下游引物：上游引物5-GACCACTTGGACCTGTCGCT-3；下游引物5-GGGTTAGGGCTTCCTCTTGG-3。

針對(duì)Actin 內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)熒光定量PCR 上、下游引物：上游引物5-GCGTGACATCAAGGAGAAGC-3；下游引物5-GGAAGGACGGCTGGAAGA-3。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

取指數(shù)增長(zhǎng)期的APCs、PPCs、FPCs 細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，1 000 r/min 5 min 離心收集細(xì)胞；4℃預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗細(xì)胞2 次，加入2 mL 預(yù)冷75%乙醇，混勻后-20 ℃過夜，固定細(xì)胞。1 000 r/min 5 min 離心，棄固定液，加入RNAase（50μg/mL），37 ℃孵育 30 min。300目篩網(wǎng)過濾置干凈流式管中，加入PI染液（50μg/mL），避光染色30 min。上流式細(xì)胞儀，Multi SET 軟件收集細(xì)胞，ModFit LT軟件分析細(xì)胞周期，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

2.3 慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)的無內(nèi)毒素大量提取

將重組質(zhì)粒pLVTHM、包裝質(zhì)粒pCMV-dr8.91 與包膜質(zhì)粒pMD2. G 分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3 并涂布，過夜培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行小量擴(kuò)增，按照1∶500 的比例將菌液稀釋至100mLLB液體培養(yǎng)基（Amp 100g/mL）中，37 ℃、220 r/min 過夜振蕩培養(yǎng)。OD 值約 0.8 時(shí)，使用Qiagen 無內(nèi)毒素大量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

2.4 慢病毒顆粒的制備

在10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種2 106個(gè)293t 細(xì)胞，37 ℃、5%CO2 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)于每皿細(xì)胞，將24DNA（pLVTHM∶pCMV-dr8.91∶pMD2.G 質(zhì)量比為2.00∶1.50∶0.75）與 60L Lipofectamine 2 000，加入到1.5 mL 無血清DMEM 培養(yǎng)基中并輕輕混勻，室溫孵育15 min。更換細(xì)胞培養(yǎng)皿中的DMEM 完全培養(yǎng)基，分別逐滴加入上述混合液，輕輕混勻，37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下檢測(cè)表達(dá)GFP 的陽性細(xì)胞數(shù)，以確定轉(zhuǎn)染效率，若轉(zhuǎn)染效果較好，則進(jìn)行第1 次收毒。0.45m 濾膜過濾上清液，將濾液置于MilliporeAmicon Ultra-15離心超濾管中，12 000 r/min、4 ℃離心30 min。棄廢液，將濾后濃縮病毒液分裝于干凈無菌的1.5 mL 凍存管，-80 ℃或液氮保存。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行第2 次收毒。

2.5 APCs的慢病毒感染

胰酶消化APCs，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種細(xì)胞于6孔板中，每孔加完全培養(yǎng)基2 mL。待細(xì)胞貼壁且細(xì)胞密度在 50%～70%時(shí)，更換新的細(xì)胞培養(yǎng)基，接種“1.2.4”項(xiàng)下0.22m 濾膜過濾后的濃縮病毒液200L，37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱孵育。24 h 后，每隔 12 h 觀察GFP熒光的表達(dá)情況，以確定感染效率；72 h后進(jìn)行傳代，擴(kuò)增被感染的APCs。試驗(yàn)共設(shè)3 組，即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的p21 干擾組（p21-shRNA）、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白載體的空白對(duì)照組（Blank control）以及未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組（Control）。

3 結(jié)果與分析

3.1 APCs、PPCs與FPCs中p21基因mRNA的表達(dá)水平

以FPCs 作為對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR，利用7 500 System software 對(duì)鹿茸干細(xì)胞（APCs 和 PPCs）與對(duì)照細(xì)胞中p21 基因mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定、分析。結(jié)果如圖1 所示，F(xiàn)PCs 中p21 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為 0.299±0.103，明顯低于 APCs（1.000±0.286）和PPCs（0.832±0.103），即鹿茸干細(xì)胞中 p21 基因mRNA 的表達(dá)高于對(duì)照細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；APCs 與 PPCs 中 p21mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P ＞ 0.05）。

圖1 qRT-PCR 鑒定 APCs、PPCs 與 FPCs 中 p21 基因 mRNA的表達(dá)水平Fig.1 Quantitative identification of p21mRNA expression in APCs,PPCs and FPCs by qRT-PCR

3.2 APCs、PPCs與FPCs的細(xì)胞周期分布

以FPCs 作為對(duì)照細(xì)胞，利用ModFit LT 軟件對(duì)鹿茸干細(xì)胞（APCs和PPCs）與對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況進(jìn)行檢測(cè)、分析。結(jié)果如圖2 所示，APCs、PPCs和FPCs的細(xì)胞周期分布相似，無明顯差異；表1 顯示，APCs、PPCs 和FPCs各時(shí)段的細(xì)胞周期比例差異無顯著性，即鹿茸干細(xì)胞（APCs 和PPCs）與對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞周期分布無明顯差異。

圖2 APCs、PPCs 與 FPCs 細(xì)胞周期分布Fig.2 Cell cycle of APCs,PPCs and FPCs

表1 APCs、PPCs、FPCs 細(xì)胞周期分布比例Table 1 Cell cycle distribution ratio of APCs,PPCs and FPCs （n=3）（%）

3.3 重組慢病毒感染APCs

由重組慢病毒感染的 APCs 經(jīng)過傳代擴(kuò)增培養(yǎng)后，獲得了大量且純度較高的陽性細(xì)胞。圖3 為倒置顯微鏡下的觀察結(jié)果，如圖所示，在熒光顯微鏡下，p21基因干擾組與空白對(duì)照組細(xì)胞均表達(dá)較強(qiáng)的熒光（圖3-A、C），且分布均勻；在光學(xué)顯微鏡下可觀察到APCs生長(zhǎng)狀況良好，基本無細(xì)胞碎片及死細(xì)胞（圖3-B、D）。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)，得出干擾效率約為90%，利于后續(xù)試驗(yàn)的要求，即利于對(duì)p21 基因干擾效果的檢測(cè)。

圖3 APCs 感染效果檢測(cè)Fig.3 Effects of infection on APCs

3.4 APCs中p21基因干擾效果的確認(rèn)

利用 qRT-PCR 對(duì) APCs 中 p21 基因的干擾效率進(jìn)行檢測(cè)。p21 基因干擾組細(xì)胞的 mRNA 表達(dá)量（0.327±0.062）明顯低于對(duì)照組（1.000±0.125）以及空白對(duì)照組（0.901±0.232），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白對(duì)照組與對(duì)照組之間差異不顯著（P ＞0.05），說明載體本身對(duì)APCs 中p21 基因的表達(dá)影響較小，可以忽略。由此可確定，攜帶p21-shRNA 的表達(dá)載體可有效沉默 APCs 中 p21 基因的表達(dá)，沉默效率為67.3%。結(jié)果見圖4。

圖4 qRT-PCR 鑒定APCs 中p21 基因的干擾效果確認(rèn)Fig.4 Identification of p21 gene interference in APCs by qRTPCR

3.5 干擾p21基因?qū)PCs周期的影響

利用流式細(xì)胞術(shù)分析干擾p21 基因?qū)PCs 周期的影響。3 組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布相似，無明顯差異。p21 干擾組與空白對(duì)照組以及未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比，APCs 細(xì)胞各時(shí)段的細(xì)胞周期比例差異無顯著性，即干擾p21 基因?qū)PCs 周期無明顯影響。結(jié)果見圖5、表2。

4 討論

鹿茸再生作為一種哺乳動(dòng)物組織器官再生模型，是一種基于干細(xì)胞的割處再生[2,18]，這一點(diǎn)不同于傳統(tǒng)再生模型，因此，鹿茸再生機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。對(duì)傳統(tǒng)再生模型的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期分布與再生有著緊密的聯(lián)系[18]，并且，近年來對(duì)MRL品系小鼠的研究已經(jīng)證實(shí)，p21 基因與小鼠再生有著密不可分的關(guān)系[7]，在鹿茸再生中這些都尚未有相關(guān)研究報(bào)道。本研究利用qRT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)以及RNAi技術(shù)，對(duì)鹿茸再生與細(xì)胞周期分布、p21 基因表達(dá)之間的關(guān)系做了初步探索，為后續(xù)更深入的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖5 干擾p21 基因后APCs 周期分布Fig.5 Cell cycle of APCs after downregulation of p21 gene

表2 干擾p21 基因后APCs 周期分布比例Table 2 Cell cycle of APCs after downregulation of p21 gene （n=3）（%）

Bedelbaeva 等[8]報(bào)道，MRL 品系小鼠的再生與p21 基因的低表達(dá)有關(guān)。與這一報(bào)道相反的是，本研究經(jīng)過qRT-PCR 鑒定發(fā)現(xiàn)，p21 基因在鹿茸干細(xì)胞中高表達(dá)。p21 基因的主要作用是細(xì)胞周期的調(diào)控[19]，而本研究利用RNAi 技術(shù)，干擾p21 基因的表達(dá)并沒有影響鹿茸干細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。p21 基因除細(xì)胞周期調(diào)控外，還參與多種細(xì)胞代謝反應(yīng)，如細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡等[10,20]。基于p21 基因在鹿茸干細(xì)胞中的高表達(dá)，推測(cè)雖然p21 基因在細(xì)胞周期調(diào)控中沒有發(fā)揮不可或缺的作用，但可能以某種其他的功能在鹿茸再生中發(fā)揮著作用，這需要進(jìn)一步研究。

組織再生離不開細(xì)胞增殖，處于快速增殖中的細(xì)胞在受到內(nèi)部與外部壓力時(shí)受到嚴(yán)格的細(xì)胞周期調(diào)控，一旦調(diào)控系統(tǒng)紊亂，則易遭受癌變的危險(xiǎn)[17,21-22]。完整的細(xì)胞周期必須嚴(yán)格按照G1-S-G2-M順序進(jìn)行，在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，為了精確調(diào)控細(xì)胞周期的有序進(jìn)行，防止由于細(xì)胞失控性增殖引發(fā)腫瘤，細(xì)胞建立了一類內(nèi)在監(jiān)測(cè)點(diǎn)機(jī)制。細(xì)胞檢測(cè)到異常事件，如DNA 損傷時(shí)，G1 監(jiān)測(cè)點(diǎn)啟動(dòng)，細(xì)胞周期停滯，直到異常事件消除，重新進(jìn)入細(xì)胞周期[10-12]。因此，若G1 監(jiān)測(cè)點(diǎn)功能缺失，則有可能導(dǎo)致對(duì)G2/M監(jiān)測(cè)點(diǎn)的依賴，從而表現(xiàn)G2/M 阻滯的特殊細(xì)胞周期表型。有趣的是，水螅、蠑螈、哺乳動(dòng)物肝臟以及MRL 品系小鼠等再生模型都表現(xiàn)出這樣一個(gè)特殊的細(xì)胞周期表型。敲除p21 基因的非再生小鼠不僅表現(xiàn)出同MRL 品系小鼠相同的再生表型，而且相關(guān)的再生細(xì)胞也出現(xiàn)G2/M阻滯現(xiàn)象，由此確定，G2/M 期細(xì)胞的積累與再生有關(guān)，細(xì)胞周期的變化可能是具有再生能力動(dòng)物的一種共性。

G2/M 阻滯的特殊細(xì)胞周期有利于細(xì)胞的快速增殖，從而促進(jìn)再生，但同時(shí)由于G1/S 監(jiān)測(cè)點(diǎn)機(jī)制功能的缺陷，增加了細(xì)胞周期調(diào)控紊亂以及細(xì)胞失控性增殖的可能性，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，與以上再生模型不同的是，鹿茸干細(xì)胞并沒有表現(xiàn)G2/M阻滯這一特殊的細(xì)胞周期，并且這一表型不會(huì)由于p21基因的缺失而改變，由此說明，與其他再生模型相比，鹿茸干細(xì)胞可能擁有一套更完善更嚴(yán)格的細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)。因此，鹿茸再生不僅為我們提供了一個(gè)哺乳動(dòng)物組織器官再生模型，而且為研究如何保證組織器官再生的同時(shí)防止腫瘤的發(fā)生提供了一個(gè)較佳的機(jī)會(huì)。