趙安菊 王智黔 黃平

(貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

糖尿病腎病是糖尿病的常見及嚴重并發(fā)癥之一，后期以大量蛋白尿及高度水腫為主，最終進展到終末期腎衰而致死亡，嚴重威脅人類健康。糖尿病是一種典型足細胞病，研究表明，足細胞損傷是 DN 進展的關(guān)鍵，足細胞損傷導(dǎo)致大量蛋白尿[1]。光鏡下腎小球病變輕微，或輕度系膜增生；電鏡下足細胞足突廣泛融合，足細胞退行性病變[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]黃芪注射液有降低尿蛋白作用，腎臟足細胞減少或缺失是導(dǎo)致大量尿蛋白原因之一。本研究通過STZ腹腔注射法誘導(dǎo)建立糖尿病腎病SpragueDawley大鼠模型，并用黃芪注謝液進行治療，在電鏡下觀察正常大鼠、糖尿病腎病(DN)大鼠及黃芪注射液治療的DN大鼠腎臟足細胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化，為黃芪注射液減少DN蛋白尿及改善腎功能提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 8周齡雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量150～200 g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心。PHILIPS TECNAI-10透射電子顯微鏡(由第三軍醫(yī)大學(xué)生物測試分析中心提供)。

1.1.2主要試劑 STZ(美國Sigma公司);MAXVISION試劑盒(福建邁新公司)。2.5%戊二醛[0.1 mol/L(pH7.4)二甲砷酸鈉緩沖液配制]、1%鋨酸、30%、50%、70%乙醇溶液、80%、90%、95%、100%丙酮溶液、環(huán)氧樹脂包埋劑、檸檬酸鉛染液、雙蒸水、超薄切片機、恒溫箱、400目銅網(wǎng)等。

1.2實驗方法

1.2.1動物造模及分組 24只雄性SD大鼠隨機分為糖尿病腎病組(DN 組)、黃芪注射液干預(yù)組(H組)及對照組(C 組)，DN組及H組采用STZ 60 mg/ kg一次性腹腔注射，C組予等量檸檬酸緩沖液。以連續(xù)3次血糖> 16.6 mmol/ L，尿量> 原尿量150 %，尿蛋白排泄> 30 mg/ 24 h 尿者為成模標準。成模后H組給予黃芪注射液腹腔注射5 mg/kg/d 10 d后，留取24 h 尿液并股靜脈取血，檢測血糖、24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐處死大鼠。血糖檢測采用酶電解層析法，尿蛋白定量檢測使用雙縮脲比色法，血尿素氮測定用GLDH 動力學(xué)法，血肌酐濃度測定用酶法。經(jīng)腹主動脈灌注生理鹽水后摘取右腎。

1.2.2電鏡標本制作 取各組大鼠的腎臟組織，立即投入固定液中，取材要迅速，以防止細胞缺氧發(fā)生超微結(jié)構(gòu)變化。把樣本立即投入到0.1 mol/L(pH7.4)的二甲砷酸鈉緩沖液配制的2.5%戊二醛中，4 ℃固定2 h。然后用0.1 mol/L(pH7.4)的二甲砷酸鈉緩沖液洗三次，再放入用相同緩沖液配制的1%鋨酸中固定2 h(4 ℃)。用雙蒸水清洗固定好的標本，按順序投入到30%、50%、70%的乙醇中，在4 ℃條件下各10 min．然后再投入到80%、90%、95%的丙酮中各10 min，100%的丙酮中兩次，每次10 min脫水。把標本由100%丙酮中移入裝有混勻包埋劑的小瓶中，在30 ℃下震蕩4h浸透。把標本放入膠囊底部，將混勻的包埋劑分裝入膠囊中進行包埋，加好標簽，把裝有標本和包埋劑的膠囊置35 ℃、45 ℃、60 ℃溫箱中各24 h，使包埋劑聚合，硬化，由流體變?yōu)榫鶆虻墓腆w。然后切厚度為1 μm、2 μm 超薄切片，將切片樣本置入枸緣酸鉛染液中染色，1%NaOH溶液洗一次，水洗二次，干燥后送樣，上機觀察拍照。

2 結(jié) 果

2.1生化指標 DN組血糖及尿蛋白量(24 h)較C 組及H組顯著增高(P<0.05)，見表1。

表1 三組血糖、腎功能及尿蛋白量(24 h)的變化

注：與C組比較，△P< 0.05，與DN組比較，*P< 0.05.

2.2各組電鏡下表現(xiàn) 電鏡下可見C組大鼠腎小球毛細血管袢結(jié)構(gòu)清晰，腎小球囊腔結(jié)構(gòu)清晰，足細胞足突緊貼于毛細血管基膜外，突起之間可見裂孔，足細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，腎小球基底膜及系膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，基底膜未見增厚。DN組大鼠腎組織可見腎小球毛細血管袢正常屏障結(jié)構(gòu)紊亂模糊、喪失，小球毛細血管基底膜彌漫性增厚，腎小球囊腔消失；足細胞結(jié)構(gòu)萎縮，足細胞數(shù)目減少，足突廣泛融合，足突裂孔消失，系膜外基質(zhì)(ECM)增多，腎臟病理超微結(jié)構(gòu)明顯改變。H組大鼠腎組織基底膜、足突融合等病理改變均較DN組有所減輕。

注： A：正常對照組；B：糖尿病腎病模型組；C：黃芪注射液干預(yù)組。

圖1各組電鏡下表現(xiàn)

3 討 論

糖尿病是一種常見病、多發(fā)病，嚴重危害人類健康，糖尿病腎病是其常見及嚴重并發(fā)癥之一，已成為導(dǎo)致終末期腎病的主要原因[4]。足細胞(podocyte)是貼附于腎小球基底膜(GBM)外側(cè)面的臟層上皮細胞，電鏡下可見自胞體伸出許多突起，其足突間的濾過裂孔是構(gòu)成腎小球濾過屏障的結(jié)構(gòu)之一。糖尿病狀態(tài)下高糖、非酶糖基化蛋白均可引起足細胞數(shù)量減少和密度降低，而糖尿病白蛋白尿的產(chǎn)生主要是由于腎小球足細胞減少及結(jié)構(gòu)受損，致使腎小球濾過屏障破壞所致[5]。足細胞是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的腎小球終末分化細胞，為最容易損傷的部分，其增殖能力有限，若被損傷，則會導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生，同時足細胞也被認為是一種高度分化、分裂增殖能力有限的終末細胞，一旦損傷或缺失就很難再生[6]。

黃芪為補氣要藥，臨床上較多研究發(fā)現(xiàn)黃芪制劑具有減少腎病患者尿蛋白、降低血糖、改善腎臟血流等作用，從而改善腎功能[7-8]。但其改善腎功能及減少尿蛋白的機制仍不十分清楚。有研究[9]發(fā)現(xiàn)高糖能抑制體外培養(yǎng)的足細胞活力，減少足細胞的數(shù)目，而黃芪甲苷能顯著對抗高糖環(huán)境對足細胞的不良影響。因此，黃芪可能是通過減輕足細胞損傷而發(fā)揮保腎作用。本研究通過電鏡下觀察正常大鼠、STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠及黃芪干預(yù)后的糖尿病腎病大鼠的腎小球足細胞超微結(jié)構(gòu)變化差異，為進一步探討黃芪注射液降低糖尿病腎病尿蛋白機制提供客觀依據(jù)。

本研究通過建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病(SD)大鼠模型，并給與黃芪注射液干預(yù)10 d，結(jié)果顯示：生化指標DN組較C組腎功明顯異常，24 h尿蛋白明顯增加，H組腎功能及24 h尿蛋白較DN組明顯改善(P<0.05)，但未能恢復(fù)正常，提示黃芪注射液可一定程度減少糖尿病腎病大鼠蛋白尿，進而改善腎功能。進一步電鏡下觀察正常大鼠、DN大鼠及黃芪注射液干預(yù)后大鼠腎小球足細胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)DN組較正常組腎小球足細胞數(shù)目明顯減少，足突廣泛融合，足突裂孔減少，腎小球毛細血管基底膜正常屏障結(jié)構(gòu)喪失，黃芪注射液干預(yù)組大鼠腎臟腎小球足細胞病變較糖尿病腎病組大鼠有所減輕。通過以上生化指標及電鏡下足細胞超微結(jié)構(gòu)變化客觀提示黃芪注射液可能通過改善腎小球足細胞損傷進一步減少尿蛋白，從而改善腎功能。該研究不足之處在于藥物使用時間較短，沒有設(shè)置藥物分組及成熟的陽性對照組，在今后的后續(xù)研究中進一步改進。