侯雷 元曉龍 馬武開Δ 姚血明 陸道敏 寧喬怡 曾蘋 周靜

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003；2.林州市人民醫(yī)院，河南 林州 456550)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性進(jìn)展性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)以對(duì)稱性、侵蝕性及多關(guān)節(jié)炎為主要特點(diǎn)，其基本病理表現(xiàn)為滑膜炎及血管翳的形成。RA是臨床上常見的難治性風(fēng)濕類疾病，在我國的發(fā)病率為0.42%，且致殘率較高[1]。RA具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前較為一致的觀點(diǎn)認(rèn)為，RA的發(fā)病與體內(nèi)輔助性T細(xì)胞17(helper T cells 17，Th17)及白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)的表達(dá)有關(guān)[2-3]。Th17細(xì)胞是機(jī)體中一種新型的輔助性T細(xì)胞，是導(dǎo)致RA發(fā)生的關(guān)鍵性免疫應(yīng)答細(xì)胞，而IL-17是Th17細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要效應(yīng)因子，具有強(qiáng)大的致炎作用[4-5]。臨床上觀察RA患者常用判斷病情的活動(dòng)指標(biāo)是28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)分(disease activity score-28，DAS28)，但RA患者DAS28評(píng)分不同活動(dòng)度與Th17細(xì)胞及IL-17之間關(guān)系的研究卻很少。因此，本研究通過觀察RA患者28個(gè)關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腫脹數(shù)(swollen joint count，SJC)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)(tender joint count，TJC)、疼痛視覺模擬評(píng)分(Visual Analogue Score，VAS)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)來計(jì)算DAS28評(píng)分，探討其與RA外周血中Th17細(xì)胞及IL-17的相關(guān)性，以期為RA的臨床治療及IL-17靶向藥物的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 RA患者120例均選取于2017年6月至2017年12月在我院風(fēng)濕科住院期間確診的患者，其中男9例，女111例，年齡18～70歲，平均年齡(52.32±10.17)歲，病程1月～26年，平均(59.73±11.28)月。健康對(duì)照組30名均來源于同期在我院體檢中心體健的健康人群，其中男11例，女19例，年齡18～60歲，平均年齡(46.25±14.55)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：RA組：符合2010年ACR/EULAR聯(lián)合制定的RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡在18～70歲；未伴有其它風(fēng)濕免疫性疾病者；患者知情同意。健康對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)室檢測各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，且無慢性疾病史者。排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合上述RA納入標(biāo)準(zhǔn)者；伴有急慢性感染和惡性腫瘤者；伴有嚴(yán)重肝腎功能不全和心腦血管疾病者。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 120例RA患者均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(ACR/EULAR)聯(lián)合制定的RA診斷分類標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.3臨床觀察指標(biāo) 制作RA患者臨床指標(biāo)觀察表，包括28個(gè)關(guān)節(jié)的SJC、TJC，VAS，ESR；運(yùn)用DAS28-ESR公式計(jì)算DAS28評(píng)分[7]，并根據(jù)DAS28評(píng)分分為緩解期組17例(DAS28≤2.6)、低度活動(dòng)組22例(2.65.1)。

1.4實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 人淋巴分離液、無菌PBS緩沖液、流式染色緩沖液、人IL-17酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(以上均購自昆明綠盟科技有限公司)；Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human IL-17A單克隆抗體、同型陰性對(duì)照Alexa Fluor 647 Mouse IgG1 K Isotype control抗體、FITC Mouse Anti-Human CD3單克隆抗體、破膜劑Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO、刺激阻斷劑Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug、PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD8單克隆抗體(以上均購自美國BD公司)。BD FACSCanto II型流式細(xì)胞儀(購自美國BD公司)；酶標(biāo)分析儀、洗板機(jī)(均購自深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司)；臺(tái)式低速離心機(jī)(購自長沙平凡儀器儀表有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(購自上海華連醫(yī)療器械公司)；電熱恒溫水浴箱(購自北京醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)的百分率 取2 mL新鮮肝素抗凝血與2 mL 無菌PBS緩沖液混勻置入無菌流式管中，再加人淋巴分離液4 mL，4 ℃避光2 000 r/min，離心20 min，吸取中間乳白色樣單核細(xì)胞層(PBMC)，加無菌PBS緩沖液配置成250 μL PBMC；加2 μL 250x刺激阻斷劑，混勻，5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)4 h；加20 μL FITC-CD3單克隆抗體及5 μL PerCP-CD8單克隆抗體，混勻，室溫避光30 min；加1 mL 破膜劑，混勻，室溫避光30 min；加1 mL無菌PBS緩沖液，混勻，4 ℃避光1 500 r/min，離心5 min，棄上清；再加1 mL無菌PBS緩沖液，混勻，將細(xì)胞液平均分為兩管，分別加Alexa Fluor - IL-17A單克隆抗體、同型陰性對(duì)照Alexa Fluor- IgG1 K抗體20 μL ，4 ℃ 避光30 min后加流式染色緩沖液1 mL，4 ℃避光1 500 r/min，離心5 min，棄上清；重復(fù)洗滌2次后加無菌PBS緩沖液500 μL，充分重懸后上流式細(xì)胞儀檢測分析Th17細(xì)胞(CD3+CD8-IL-17+)表達(dá)的百分率。

1.6ELISA法檢測血清IL-17表達(dá)的濃度 清晨空腹采集外周靜脈血5 mL，采集后3 000 r/min離心10 min分離血清，置于無菌EP管-20 ℃冰箱保存?zhèn)錂z；檢測時(shí)嚴(yán)格按照人IL-17酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒說明書上的步驟檢測血清IL-17表達(dá)的濃度。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 RA患者不同分組間在性別、年齡及病程上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

表1 不同分組間性別、年齡、病程的關(guān)系

注：不同RA分組間兩兩相比，P均>0.05。

2.2不同RA分組間SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28的比較 SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28在各組中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28由高到低依次為：高度活動(dòng)組>中度活動(dòng)組>低度活動(dòng)組>緩解期組，見表2。

表2 不同RA分組間SJC/TJC/VAS/CRP/DAS28的比較

注：不同RA分組間兩兩相比，P均<0.05。

2.3不同分組間Th17細(xì)胞、IL-17表達(dá)水平的比較 與健康對(duì)照組比較，RA患者各組Th17細(xì)胞、IL-17表達(dá)水平均明顯升高，且兩兩組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。Th17細(xì)胞、IL-17的表達(dá)水平依次為高度活動(dòng)組>中度活動(dòng)組>低度活動(dòng)組>緩解期組>健康對(duì)照組，見圖1-8、見表3。

表3 不同分組間Th17細(xì)胞、IL-17表達(dá)水平的比較

注：不同分組間兩兩相比，P均<0.05。

2.4不同RA分組間Th17細(xì)胞、IL-17表達(dá)水平與DAS28評(píng)分的相關(guān)性 結(jié)果顯示：緩解期組、低度活動(dòng)組、中度活動(dòng)組及高度活動(dòng)組與RA患者外周血中Th17細(xì)胞及IL-17表達(dá)水平均呈正相關(guān)關(guān)系，見表4。

表4 不同RA分組間Th17細(xì)胞、IL-17表達(dá)水平與DAS28評(píng)分的相關(guān)性

3 討 論

RA是由多種炎癥因子共同參與，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜增生和血管翳形成，對(duì)關(guān)節(jié)滑膜及軟骨造成侵犯破壞的無菌性炎癥反應(yīng)疾病，并最終可引起關(guān)節(jié)畸形及活動(dòng)明顯受限，從而嚴(yán)重影響RA患者的日常生活質(zhì)量。至今RA的發(fā)病具體機(jī)制還不完全清楚，但最新的研究提示RA患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群變化異常往往是其發(fā)病的重要原因。例如，研究發(fā)現(xiàn)RA的發(fā)病與體內(nèi)Th17細(xì)胞及IL-17的表達(dá)有關(guān)，在大量小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的研究中表明：Th17細(xì)胞效應(yīng)因子IL-17具有很強(qiáng)的致炎作用，是RA發(fā)病的重要原因[8-10]。

Th17細(xì)胞是機(jī)體中一種新型的輔助性T細(xì)胞，主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、IL-23和TNF-α等細(xì)胞因子，但以分泌IL-17為主要特征。IL-17是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)白介素家族成員，主要是由活化的記憶性CD4+T淋巴細(xì)胞亞群分泌而來[11-12]，尤以Th17細(xì)胞分泌IL-17A為主，其參與了RA的發(fā)病及病情進(jìn)展，并具有強(qiáng)大的致炎作用，因此成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)[13-15]。已有研究明確IL-17可以誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α及IL-1、IL-6等炎癥因子，這些炎癥因子可以促進(jìn)并激發(fā)Th17細(xì)胞的活化，從而加大炎癥反應(yīng)的表達(dá)[16]。IL-17還能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞的活化和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17能刺激RA 患者外周血單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，健康人外周血CD4+單核細(xì)胞經(jīng)巨噬細(xì)胞集落刺激因子和IL-17共同刺激后，其向破骨細(xì)胞分化的能力及破骨細(xì)胞的活性均明顯增強(qiáng)，抑制IL-17治療后，破骨細(xì)胞的數(shù)量減少且骨破壞減輕[17-18]。這些研究說明，Th17細(xì)胞及IL-17在促進(jìn)炎癥和骨破壞方面發(fā)揮著重要作用。

DAS28評(píng)分是臨床上觀察RA患者病情的活動(dòng)指標(biāo)，能有效客觀的評(píng)價(jià)患者的病情程度；目前臨床上常常作為RA患者疾病活動(dòng)度和經(jīng)藥物治療后是否有效的評(píng)估指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28在各組中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外，肖盼盼等[19]、崔潞萍等[20]報(bào)道SJC、TJC、VAS、ESR水平的升高與RA的病情活動(dòng)指標(biāo)呈DAS28評(píng)分正相關(guān)，提示DAS28評(píng)分在臨床上可作為RA患者療效觀察及評(píng)價(jià)和預(yù)后判斷的臨床常用病情監(jiān)測指標(biāo)。我們依據(jù)DAS28-ESR評(píng)分將RA患者進(jìn)行分組，比較四組間與健康對(duì)照組外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量和血清IL-17的表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示，RA患者各組與健康對(duì)照組相比，RA患者外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量和血清IL-17表達(dá)水平均有明顯升高，同時(shí)兩兩組間相比較其表達(dá)水平隨疾病活動(dòng)度的輕重逐漸升高且差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Th17細(xì)胞及IL-17兩者均參與了RA的炎性發(fā)病過程，這與肖盼盼等[19]、車昌燕等[21]、張力力等[22]報(bào)道的研究結(jié)果相一致。RA患者各組與DAS28評(píng)分進(jìn)一步Pearson相關(guān)性分析顯示，RA患者各組外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量和血清IL-17表達(dá)水平與DAS28評(píng)分均呈正相關(guān)性，這與曹艷玲等[23]報(bào)道的研究結(jié)果相一致，提示Th17細(xì)胞及IL-17參與了RA的炎癥反應(yīng)，且兩者的表達(dá)率越高，RA患者的疾病活動(dòng)度越重。

綜上所述，Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子IL-17具有很強(qiáng)的致炎和骨破壞作用，目前大量研究已經(jīng)證實(shí)Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子IL-17參與多種自身免疫性炎性疾病的發(fā)生及病情的進(jìn)展。通過本研究我們可以進(jìn)一步證實(shí)：Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子IL-17在RA發(fā)病炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，并且兩者與DAS28評(píng)分之間存在明顯的正相關(guān)性關(guān)系，臨床上聯(lián)合檢測兩者也有助于評(píng)估RA患者的疾病活動(dòng)度。因此，我們可以推測：針對(duì)Th17細(xì)胞及IL-17的靶向生物制劑的研發(fā)，可以有效地減輕RA患者關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)及疾病活動(dòng)度，為RA的治療領(lǐng)域提供新的研究方向并具有廣闊的應(yīng)用前景[24]。

(圖1—8見封三)