趙連波，張 倩，付 穎，郝 磊，薩旭仁貴，韓開林，劉 振

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

靛紅又名吲哚二酮(isatin，見圖1)，是一種廣泛存在于自然界中的氮雜環(huán)類生物堿，具有良好的生物活性．近年來研究[1-4]發(fā)現(xiàn)，靛紅作為天然治療癌癥的先導化合物對多種腫瘤細胞的生長有抑制作用，同時其對正常細胞不產(chǎn)生作用，這有效降低了抗腫瘤藥物的毒副作用．靛紅衍生物不僅具有靛紅的生物學特性，而且既傳承了傳統(tǒng)中藥的優(yōu)點又克服了現(xiàn)有抗癌藥物損害正常細胞的缺點，其中一些衍生物已經(jīng)成功用于治療癌癥．

本課題組前期研究[5-7]發(fā)現(xiàn)了靛紅1 位、5 位是關(guān)鍵活性位點，為了研究三取代靛紅衍生物對活性的影響，本研究以4-溴吲哚二酮、6-溴吲哚二酮、7-溴吲哚二酮為起始原料，通過NBS 溴代、鈴木偶聯(lián)反應(Suzuki-Coupling)、N-烷基化三步反應制備合成了3 種新型三取代靛紅衍生物，利用核磁共振方法確定了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并利用MTT 法和流式細胞儀檢測了目標化合物對腫瘤細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響．

圖1 靛紅母核結(jié)構(gòu)式 Fig. 1 Structure of isatin

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

4-溴吲哚二酮、6-溴吲哚二酮、7-溴吲哚二酮、4-甲氧基苯硼酸等試劑，化學純，百靈威科技有限公司；N-溴代丁二酰亞胺、4-甲氧基氯化芐、[1，1′-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀、乙酸鉀、碳酸鉀等試劑，化學純，國藥化學試劑有限公司；喜樹堿(CPT)，北京偶合科技有限公司；甲醇、石油醚、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)及1，4-二氧六環(huán)等溶劑，分析純，北京化學試劑公司．

TX323L 型電子分析天平，島津國際貿(mào)易有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；循環(huán)水式真空泵，河南予華儀器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；低溫恒溫反應浴，鞏義市京華儀器有限責任公司；Av-400 MHz 型核磁共振儀，瑞士Bruker 公司．

1.2 合成路線

以4-溴吲哚二酮、6-溴吲哚二酮、7-溴吲哚二酮為起始原料，通過NBS 溴代、鈴木偶聯(lián)反應、N-烷基化三步反應制備目標化合物，具體合成路線如圖2 所示．

1.2.1 化合物a 的合成

將4-溴吲哚二酮1.0 g(4.42 mmol)、N-溴代丁二酰亞胺0.83 g(4.64 mmol)溶解于DMF(3 mL)中，室 溫反應24 h．TLC 檢測反應完全后，將其倒入冰水中，產(chǎn)生紅色固體．過濾收集沉淀，沉淀用甲醇重結(jié)晶，得到4，5-二溴吲哚二酮1.11 g，產(chǎn)率為83%(未經(jīng)純化直接進行下步反應)．

圖2 1，4，5、1，5，6、1，5，7-三取代靛紅衍生物合成路線 Fig. 2 Synthesis route of 1，4，5，1，5，6，1，5，7-trisubstituted isatin derivatives

將4，5-二溴吲哚二酮0.50 g(1.64 mmol)、4-甲氧基苯硼酸 0.30 g(1.97 mmol)、PdCl2(dppf)0.06 g (0.08 mmol)、CH3COOK 0.32 g(3.28 mmol)溶解于1，4-二氧六環(huán)(5 mL)中，氬氣保護下，微波輔助135 ℃反應30 min．TLC 檢測反應完全后，將其倒入50 mL 水中，反應液用二氯甲烷萃取(100 mL)3 次，合并有機相．有機相用飽和NaCl 水洗，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到固體產(chǎn)物4，5-二(4-甲氧基苯基)吲哚二酮0.27 g，產(chǎn)率為45%(未經(jīng)純化直接進行下步反應)．

將 4，5-二(4-甲氧基苯基)吲哚二酮 0.10 g (0.28 mmol)、無水碳酸鉀0.12 g(0.84 mmol)、4-甲氧基芐氯0.05 g(0.36 mmol)室溫下溶解于DMF(2 mL)中，室溫反應12 h．TLC 檢測反應完全后，將其倒入冰水中，反應液用二氯甲烷萃取(50 mL)3 次，合并有機相．有機相用無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)．粗產(chǎn)品用洗脫劑洗脫(V石油醚﹕V乙酸乙酯＝10﹕1～1﹕1)，200～300 目硅膠柱層析純化．得到固體化合物a，產(chǎn)率為80%．

1.2.2 化合物b 的合成

化合物b 的合成方法同化合物a．以6-溴吲哚二酮1.0 g(4.42 mmol)為起始原料，依次通過溴化、鈴木偶聯(lián)反應和烷基化反應獲得化合物 b，產(chǎn)率為91%．

1.2.3 化合物c 的合成

化合物c 的合成方法同化合物a．以7-溴吲哚二酮1.0 g(4.42 mmol)為起始原料，依次通過溴化、鈴木偶聯(lián)反應和烷基化反應獲得化合物 c，產(chǎn)率為92%．

1.3 體外抗腫瘤活性測試

分別取對數(shù)生長期的人慢性髓原白血病細胞K562、人肝癌細胞HepG2 和人結(jié)腸癌細胞HT-29，用0.25%胰蛋白酶消化(貼壁細胞)，以5×104mL-1細胞密度接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育一定時間(懸浮細胞孵育2 h，貼壁細胞孵育24 h)．每組設3 個平行孔，每孔加入不同濃度化合物0.5 μL．同時設置等體積DMSO 溶劑對照組和喜樹堿陽性對照組．37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h 終止培養(yǎng)．貼壁細胞小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基上清液，每孔加入100 μL DMSO；懸浮細胞每孔繼續(xù)加入100 μL 鹽酸-異丙醇溶液后反復吹打混勻．置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱10 min， 臜甲結(jié)晶充分溶解后，用酶標儀(貼壁細胞選擇492、630 nm，懸浮細胞選擇578、630 nm)測定吸光度(A)．按式(1)計算細胞存活率[8]，并計算半數(shù)有效抑制濃度IC50值．

1.4 化合物c對K562細胞增殖的作用

取處于對數(shù)生長期的K562 細胞，按5×104mL-1細胞密度接種于 96 孔板，每孔加入細胞懸液100 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別加入終濃度為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L 的化合物c，對照孔僅加入DMSO 溶劑．將孔板置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，孵育48 h，每孔加入5 mg/mL 的MTT 20 μL 繼續(xù)孵育4 h，加入100 μL 鹽酸-異丙醇溶液后反復吹打混勻．再將孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱10 min，使用酶標儀測定吸光度，并采用GraphPad Prism 5 進行數(shù)據(jù)分析．

1.5 Annexin-V/PI 雙染法檢測化合物c 對K562 細胞凋亡的影響

取處于對數(shù)生長期的K562 細胞，以5×104mL-1接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別加入0.2 μmol/L 和2 μmol/L 化合物c，24 h 和48 h 后，1 000 r/min 離心5 min．除去培養(yǎng)基上清液，用預冷的1×PBS 將細胞吹懸，2500 r/min 離心5 min，除去上清液，冰浴．加入一定量的1×Binding Buffer 到離心管中重懸細胞，轉(zhuǎn)移至EP 管中進行染色，輕輕振蕩混勻，25 ℃避光孵育10 min；補加400 μL 1×Binding Buffer 后使用流式細胞儀進行測試[9]．

1.6 PI染色檢測化合物c對K562細胞周期的影響

取處于對數(shù)生長期的K562 細胞，以5×104mL-1細胞密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別加入0.2 μmol/L 和2 μmol/L 化合物c，24 h 和48 h 后，將細胞分別收集至EP管中，2 500 r/min 離心5 min．棄去上清液，加PBS 緩沖液將細胞吹懸，2 500 r/min 離心5 min，棄去上清液，重復1 次；加入1 mL 75%乙醇于4 ℃固定過夜．1 000 r/min 離心5min，棄固定液．用1 mL PBS緩沖液洗滌1次，1000 r/min 離心5 min，棄去上清液．用 500 μL PBS(含有 50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2% TritonX-100)4 ℃避光染色30 min，使用流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo 7.6 軟件分析PI熒光強度圖．

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物光譜數(shù)據(jù)

化合物a：1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 3.74(s，3H)，3.79(s，6H)，4.91(s，2H)，6.69～6.71(d，2H， J＝8.4 Hz)，6.76～6.81(m，3H)，6.85～6.90(m，4H)， 6.97～6.99(d，2H，J＝8.0 Hz)，7.31～7.33(d，2H，J＝8.4 Hz)，7.43 ～7.45(d，1H，J ＝8.0 Hz).13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ 43.4，55.1，55.1，55.3，109.5，113.2，113.2，113.4，113.4，114.4，114.4，115.1，126.7，126.7，129.0，129.0，130.7，130.7，131.3，131.3，131.8，137.6，139.2，141.1，150.1，158.0，158.4，159.3，159.4，182.2. ESI-MS 480.1 [M+H]+.

化合物b：1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 3.77(s，3H)，3.79(s，3H)，3.79(s，3H)，4.89(s，2H)，6.73～6.77(m，4H)，6.81(s，1H)，6.87 ～6.97(m，6H)，7.29～7.31(d，2H，J＝8.4 Hz)，7.61(s，1H).13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ 43.5，55.2，55.2，55.3，112.6，113.7，113.7，113.7，113.7，114.4，114.4，116.3，126.7，127.4，129.0，129.0，130.6，130.6，130.6，130.6，132.0，132.5，136.1，149.4，150.2，158.6，158.8，159.4，159.4，182.9. ESI-MS 480.2 [M+H]+.

化合物c：1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 3.73(s，3H)，3.83(s，3H)，3.87(s，3H)，4.68(s，2H)，6.53～6.55(d，2H，J ＝7.8 Hz)，6.64 ～6.66(d，2H，J ＝8.4 Hz)，6.83～6.85(d，2H，J＝8.0 Hz)，6.93～6.95 (d，2 H，J＝7.8 Hz)，7.03～7.05(d，2 H，J＝8.0 Hz)，7.44～7.46(d，2H，J＝8.0 Hz)，7.47(s，1H)，7.83(s，1 H).13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ 43.5，55.2，55.2，55.3，110.3，113.4，113.4，113.6，113.6，114.4，114.4，116.7，126.4，126.8，129.1，129.1，130.3，130.3，131.6，131.6，132.0，133.6，136.9，143.8，150.1，158.7，159.0，159.4，159.4，182.8. ESI-MS 480.2 [M+H]+.

2.2 三取代吲哚二酮衍生物對腫瘤細胞生長的影響

化合物a、b 和c 在1，4，5 位、1，5，6 位和1，5，7 位引入3 個4-甲氧基苯基取代基，其生物學活性與母核靛紅相比，化合物a、b 和c 對K562 細胞增殖的抑制活性顯著提升，化合物c 對HepG2 和HT-29 細胞具有明顯的細胞毒性作用(表1)．

表1 三取代吲哚二酮衍生物對腫瘤細胞生長的影響 Tab. 1 Effect of tri-substituted isatin derivatives on tumor cells

分析原因可能是在4，5 位和5，6 位引入相鄰兩個4-甲氧基苯基取代造成空間太擠，從而影響其生物學活性，5，7 位引入的兩個4-甲氧基苯基避免了空間擁擠的問題，從而使活性得到提升．綜上所述，空間位阻較小的三取代靛紅衍生物體外抑制腫瘤細胞增殖活性較靛紅母核顯著提高．綜上，1，5，7 位引 入的3 個4-甲氧基苯基的化合物c 抗腫瘤活性顯著優(yōu)于化合物a 和b．

2.2.1 化合物c 對K562 細胞的抑制作用

不同濃度化合物c 對K562 細胞增殖的抑制作用如圖3 所示．由圖3 可知：化合物c 能顯著抑制K562 細胞存活率，呈現(xiàn)濃度依賴性；當化合物c 濃度為0.01、10、100 μmol/L 時，K562 細胞存活率分別為為97.06%、9.41%、2.84%．

圖3 不同濃度化合物c對K562細胞增殖的抑制作用 Fig. 3 Inhibitory effect of different concentrations of compound c on K562 cell’s proliferation

顯微鏡下觀察K562 細胞生長情況，結(jié)果如圖4所示．正常對照DMSO 組細胞呈圓形，而加入不同濃度化合物c 的測試組細胞形態(tài)發(fā)生較明顯的變化，部分呈現(xiàn)不規(guī)則梭形細胞及凋亡小體，且凋亡細胞數(shù)量與化合物c 的濃度及作用時間呈正相關(guān)．

圖4 化合物c對K562細胞形態(tài)學的影響 Fig. 4 Influence of compound c on K562 cell’s morphology

2.2.2 化合物c 誘導K562 細胞凋亡的作用

細胞形態(tài)學提示化合物c 對K562 細胞具有誘導細胞凋亡的作用，因此采用Annexin-V/PI 雙染法檢測化合物c 對K562 細胞凋亡的作用，如圖5 所示．空白對照組細胞凋亡率為4.2%，0.2 μmol/L 化合物c 處理24 h 時，細胞凋亡率為11.3%；處理48 h時，細胞凋亡率增加至19.2%．2 μmol/L 化合物c 處理24 h 時，細胞凋亡率為18.1%，處理48 h 時，細胞凋亡率增加至49.4%．這說明化合物c 能夠明顯誘導K562 細胞的凋亡，這有可能是它抑制細胞增殖的作用機制之一．

圖5 化合物c對K562細胞凋亡的影響 Fig. 5 Effect of compound c on K562 cell’s apopotosis

2.2.3 化合物c 對K562 細胞周期的影響

前期細胞形態(tài)學結(jié)果能夠明顯觀察到K562 細胞形態(tài)變長、呈棒狀的現(xiàn)象[10]，因此，研究化合物c抑制K562 細胞生長是否與其細胞周期阻滯有關(guān)．化合物c 對K562 細胞周期的影響如圖6 所示．0.2、2 μmol/L 化合物c 處理K562 細胞處理3、6、12、24 h 后，G2/M 期出現(xiàn)阻滯，呈現(xiàn)時間和濃度依賴性. 0.2 μmol/L 化合物c 作用K562 細胞6 h 和24 h 時，G2/M 期所占比例分別為14.20%、27.84%.2 μmol/L化合物c 作用K562 細胞6 h 和24 h 時，G2/M 期所占比例分別為25.80%、84.67%．這表明化合物c 抑制K562 細胞生長與細胞周期阻滯作用相關(guān)．

圖6 化合物c對K562細胞周期的影響 Fig. 6 Effect of compound c on K562 cell’s cycle

3 結(jié) 論

本文合成了3 種三取代靛紅衍生物，利用MTT法和流式細胞儀檢測了目標化合物對腫瘤細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響．MTT 測試結(jié)果表明：在1，4，5 位(化合物a)、1，5，6 位(化合物b)引入3 個4-甲氧基苯基取代基造成空間太擠，其生物學活性未有改善；1，5，7 位引入3 個4-甲氧基苯基(化合物c)避免了空間擁擠的問題，從而使活性得到顯著提高．流式細胞儀檢測化合物c 的活性時發(fā)現(xiàn)，化合物c 能顯著誘導白血病K562 細胞的凋亡和G2/M 期阻滯，并與化合物濃度和處理時間成正相關(guān)．這表明空間位阻較小的三取代靛紅衍生物體外抑制腫瘤細胞增殖活性較靛紅母核顯著提高，以此為該類化合物的進一步衍生化和構(gòu)效關(guān)系研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)．