周芳超，蔣 靜，2，劉金晶，郁多男

(1.揚(yáng)州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225001;2.揚(yáng)州大學(xué) 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

淋巴瘤是起源于淋巴結(jié)和淋巴組織免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤，淋巴瘤大致可分為非霍奇金淋巴瘤(90%)和霍奇金淋巴瘤(10%)。大多數(shù)淋巴瘤(90%)起源于B細(xì)胞，但也可能是T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞[1]。B細(xì)胞淋巴瘤是B細(xì)胞發(fā)生的惡性實(shí)體腫瘤，涉及免疫球蛋白位點(diǎn)的染色體易位是許多B細(xì)胞淋巴瘤的標(biāo)志。然而，其他例如環(huán)境因素DNA復(fù)制錯誤等也在B細(xì)胞惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2]。核糖體蛋白(ribosomal protein，RP)是核糖體的重要成分之一，它可以和RNA結(jié)合形成核糖體并起到合成蛋白質(zhì)的作用。RP除了參與蛋白質(zhì)的合成以外，還能夠參與調(diào)控細(xì)胞增殖，凋亡和分化以及參與DNA的復(fù)制[3]，目前也有報道核糖體蛋白異常表達(dá)會導(dǎo)致惡性血液疾病[4]，同時部分核糖體蛋白也被報道能參與調(diào)控胃癌，但是對于核糖體蛋白與淋巴瘤之間的關(guān)系，目前尚無報道。本實(shí)驗(yàn)旨在證明一種核糖體蛋白RPL34具有顯著促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤生長的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑

小鼠B淋巴瘤細(xì)胞(由本實(shí)驗(yàn)室組負(fù)責(zé)人郁多男教授構(gòu)建)；Alph MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)；Annexin V Alexa Fluor647/PI/Appotosis dection kit(南京福麥斯生物公司)；BrdU細(xì)胞周期檢測試劑盒(美國BD生物公司)。

1.2 穩(wěn)定過表達(dá)RPL34的B淋巴瘤細(xì)胞系構(gòu)建

在pubmed上查詢到RPL34的基因序列后，設(shè)計(jì)引物通過PCR的方法體外擴(kuò)增RPL34的序列后，通過分子克隆將RPL34的序列插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-Puro中，包裝病毒并感染38B9細(xì)胞48 h后用0.6 μg/μL的嘌呤霉素連續(xù)篩選7 d即得到穩(wěn)定表達(dá)RPL34的B淋巴瘤細(xì)胞系RPL34-38B9。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)

取對數(shù)生長期的RPL34-38B9及其對照組pBABE-38B9,細(xì)胞體外培養(yǎng)，連續(xù)計(jì)數(shù)4 d。

1.4 細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期的RPL34-38B9及其對照組pBABE-38B9細(xì)胞，使用BD公司的BrdU細(xì)胞周期檢測試劑盒檢測細(xì)胞周期變化，具體步驟見產(chǎn)品說明書。

1.5 細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的RPL34-38B9及其對照組pBABE-38B9細(xì)胞，用PBS離心清洗后棄去上清，100 μL緩沖液重懸細(xì)胞。每管加入5 μL Annexin V和10 μL PI 染液染色后，避光孵育15 min后再加入400 μL緩沖液后用流式細(xì)胞儀(FACS Verse)檢測。

1.6 H&E染色

取106對數(shù)生長期的RPL34-38B9細(xì)胞及其對照組pBABE-38B9細(xì)胞后，皮下注射到Balb/c小鼠體內(nèi)，每組4只，成瘤后連續(xù)測量腫瘤大小[5]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果分析

2.1 核糖體蛋白RPL34能夠顯著提高38B9細(xì)胞的增殖能力

取相同濃度對數(shù)生長期的RPL34-38B9及其對照組pBABE-38B9細(xì)胞體外培養(yǎng)并連續(xù)計(jì)數(shù)4 d后發(fā)現(xiàn)，如圖1結(jié)果顯示，過表達(dá)核糖體蛋白RPL34能夠顯著提高38B9細(xì)胞的生長速度。

圖1 RPL34在體外對38B9增殖能力的影響Fig 1 Effect of RPL34 on proliferation of 38B9 in vitro

2.2 核糖體蛋白RPL34能夠通過增加細(xì)胞合成期加速細(xì)胞生長

取2×106對數(shù)生長期的RPL34-38B9及其對照組pBABE-38B9細(xì)胞，用PBS清洗一遍后，用70%乙醇冰上固定1 h后，加入破膜劑冰上孵育15 min后，加入PI和RNA酶A后Flow Cytometry分析發(fā)現(xiàn)，如圖2所示,核糖體蛋白RPL34能夠顯著增加細(xì)胞S期，并且整個細(xì)胞周期中處于靜息期外的細(xì)胞比例更高。

圖2 RPL34對38B9細(xì)胞周期的影響Fig 2 Effect of RPL34 on cell cycle of 38B9 cells

2.3 核糖體蛋白RPL34能夠減少38B9的凋亡

取105對數(shù)生長期的RPL34-38B9及其對照組pBABE-38B9細(xì)胞后，用PBS離心清洗后棄去上清，100 μL緩沖液重懸細(xì)胞。每管加入5 μL Annexin V和10 μL PI 染液染色后，避光孵育15 min后再加入400 μl緩沖液后Flow Cytometry分析,結(jié)果如圖3所示,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RPL34能夠減少細(xì)胞早凋和晚凋的比例，同時死細(xì)胞也有一定程度的減少。

2.4 核糖體蛋白RPL34能顯著提高38B9細(xì)胞的成瘤能力

取106對數(shù)生長期的RPL34-38B9及其對照組pBABE-38B9的細(xì)胞注射入Balb/c小鼠腋下，每組4只，待第一只小鼠成瘤后開始測量腫瘤大小，每隔2～3 d測量一次，腫瘤體積結(jié)果如圖4a所示，取第11 d腫瘤稱重后結(jié)果如圖4b所示。由圖4可知，核糖體蛋白RPL34能夠顯著增強(qiáng)38B9細(xì)胞的成瘤能力。

圖3 RPL34對38B9細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Effect of RPL34 on apoptosis of 38B9 cells

圖4 RPL34對38B9細(xì)胞成瘤能力的影響Fig 4 Effect of RPL34 on tumorigenesis of 38B9 cells

3 討論

核糖體作為蛋白質(zhì)合成的場所，在細(xì)胞發(fā)育生長的過程中發(fā)揮著多種重要的功能。核糖體蛋白作為核糖體重要的組成成分，它的異常表達(dá)會阻礙核糖體的正常組裝和功能發(fā)揮，從而影響細(xì)胞的生物合成功能;同時由于核糖體蛋白具有核糖體外功能，其異常將進(jìn)一步影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，進(jìn)而引起疾病的病理生理學(xué)改變[10]。

近年來的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白的異常與一些惡性腫瘤或者血液疾病息息相關(guān)[6-9]，但是其與淋巴瘤之間的關(guān)系尚未見報道,B細(xì)胞淋巴瘤作為一種高度異質(zhì)性，高度惡性的腫瘤，目前在臨床治療上并無有效手段。

隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究不斷深入，腫瘤靶向治療開始成為現(xiàn)實(shí)和當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。腫瘤靶向治療，顧名思義，是專門針對腫瘤特異性靶點(diǎn)的治療方法。一般來說，這些靶點(diǎn)所具有的共有特征是在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在正常細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)。通過阻止這些特異性的靶點(diǎn)，就可以抑制癌癥的生長，殺死腫瘤細(xì)胞腫瘤。隨著靶向治療的研究的不斷深入，不斷尋找的新的腫瘤靶點(diǎn)或許會對治療B細(xì)胞淋巴瘤提供新的思路。我們發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了一種核糖體蛋白RPL34可以顯著促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生和生長，因而可以為淋巴瘤的靶向治療提供一種新的可能，并且核糖體蛋白RPL34基于何種通路促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生和生長也是值得更進(jìn)一步探究的。