敖慧娟，郭壽清，阿依木古麗·阿不都熱依木，楊 琨，喬自林，王家敏*

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030 ；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030 ；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030 ）

MDCK細(xì)胞系由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel 母曲架犬的腎臟中分離培育建立，通常是以貼壁方式生長的上皮樣細(xì)胞。由于其病毒感染效率高、增殖快，不易變異，且適應(yīng)與無血清的生長條件，MDCK細(xì)胞系被公認(rèn)為最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細(xì)胞系之一[1-3]。由于MDCK細(xì)胞本身具有較高的成瘤性，用其生產(chǎn)疫苗的安全性一直存在著爭議[4，5]。據(jù)報(bào)道，MDCK細(xì)胞的成瘤表型是未知的，在誘發(fā)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化的過程中都在誘導(dǎo)干細(xì)胞特性，且在腫瘤發(fā)生發(fā)展，遷移侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用[6]。近年來，科學(xué)家一直在嘗試確定MDCK細(xì)胞作為流感疫苗基質(zhì)的安全性，以便獲得無腫瘤/低腫瘤的MDCK單克隆細(xì)胞株用于流感疫苗的開發(fā)，本課題組通過單細(xì)胞克隆培養(yǎng)和篩選，得到了數(shù)株低成瘤性的MDCK細(xì)胞株，將其與實(shí)驗(yàn)室已有的高成瘤性細(xì)胞株一并做高通量分析發(fā)現(xiàn)，某些經(jīng)典的腫瘤通路被靶基因激活，其中l(wèi)ncRNA MSTRG.1056.2直接調(diào)控ERBB3激活PI3K-Akt通路，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[7，8]。

SQSTM1蛋白被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切有關(guān)，該蛋白包含促進(jìn)與許多信號激活因子相互作用的結(jié)構(gòu)域。3LC3相互作用區(qū)域（LIR）的存在使SQSTM1與LC3結(jié)合，泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域（UBA）與泛素結(jié)合以介導(dǎo)選擇性降解，SQSTM1的這種細(xì)胞質(zhì)活性取決于其UBA結(jié)構(gòu)域，但不依賴于其與自噬蛋白LC3的相互作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)SQSTM1聚集于肝細(xì)胞癌、胰腺癌、腎癌、肺腺癌以及結(jié)直腸癌等多種腫瘤中，且SQSTM1參與多種信號通路，因此其細(xì)胞水平至關(guān)重要[10]。

SQSTM1在乳腺癌腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥，在腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)中的表達(dá)相反，高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，而在腫瘤基質(zhì)中表達(dá)水平下調(diào)，提示SQSTM1在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮了重要作用[10]。因此，對不同成瘤性MDCK細(xì)胞中SQSTM1的差異表達(dá)及功能的研究具有重要意義。

1 方法

1.1 不同成瘤性細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所選取的不同成瘤性細(xì)胞株是由課題組在前期實(shí)驗(yàn)中馴化所得。前期裸鼠成瘤性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：從ATCC引進(jìn)的貼壁型MDCK-A和由其馴化所得懸浮型MDCK-B在裸鼠成瘤性實(shí)驗(yàn)中的成瘤率均高達(dá)100%（10/10）；而將MDCK-A通過有限稀釋法制備得到的貼壁型單克隆細(xì)胞株MDCK-C的裸鼠成瘤率為10%（1/10）；MRC-5細(xì)胞由蘭州民海生物工程有限公司贈送，其裸鼠成瘤率為0%（0/10）。因此，選用MRC-5作為陰性對照。

將本實(shí)驗(yàn)室已有的不同成瘤性MDCK細(xì)胞從液氮罐中取出，置于37℃溫水中直至完全融化，將懸浮型MDCK-B用無血清培養(yǎng)基置于37℃，5%二氧化碳，轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床上培養(yǎng)，并將貼壁型細(xì)胞MDCK-A，MDCK-C，用含10%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，對照組MRC-5細(xì)胞含10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基，用置于37℃，5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 TRIzol Reagent 總RNA提取

棄掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，并吸去殘余的PBS。加入TRIzol試劑，用槍尖用力吸打裂解細(xì)胞，室溫放置5 min以徹底解離蛋白復(fù)合體。將細(xì)胞與裂解液分裝至2個1.5 ml的已高壓的無RNA酶PE管中，加入氯仿使其與TRIzol的體積比為1：5。用力上下?lián)u20 s左右，室溫靜置3～5 min，再用4℃離心機(jī)12 000×g離心10～15 min，并小心吸取上層水相到新的已高壓的無RNA酶PE管中，加入100%異丙醇到水相中，使得異丙醇與TRIzol的體積比為1：2。室溫放置8～10 min以沉淀RNA。再用4℃離心機(jī)12 000×g離心8～12 min后，小心棄上清，防止將RNA沉淀一并棄掉。同1 ml75%的無水乙醇漂洗RNA沉淀，即無水乙醇與TRIzol的體積比為1：1。將無水乙醇中的RNA在4℃離心機(jī)中以7 500～8 000×g離心5～6 min。小心吸去無水乙醇，并打開EP管的蓋子，室溫干燥RNA沉淀5～8，注意不可完全干燥。用DEPC水30～50μl溶解RNA沉淀，用槍尖反復(fù)吹打以徹底增加RNA溶解。吸取1～3μl RNA測量所提RNA樣品A260/A280的OD值。

1.3 Real Time PCR

在做Real Time PCR 之前，需要將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，艾科瑞生物公司的EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體反應(yīng)體系見表1、表2。

表1 去除gDNA試劑及反應(yīng)體系

混勻后短暫的離心，再將樣品放入PCR 儀中42 ℃2 min。取出樣品放置在冰上加入發(fā)轉(zhuǎn)錄試劑。

表2 反轉(zhuǎn)錄試劑及反應(yīng)體系

混勻后短暫的離心，再將樣品放入PCR 儀中37℃15 min，85℃5 s，以上過程就是將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的全過程。將得到的cDNA保存于零下20℃。利用Primer 5.0軟件根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)所需要的引物，基因引物信息見表3。

表3 基因引物序列信息

將引物系列送到甘肅一棵樹生物有限公司合成后，再用GeneCopoeia,Inc.的All-in-OneTMqPCR Mix-實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒對目的基因進(jìn)行檢測。其反應(yīng)體系見表4。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，95℃10 s到72℃ 15 s 40個循環(huán)，溶解曲線分析為65 ℃ 10 s，95 ℃ 20 s，每個樣品至少做了3個平行組。隨后搖勻，瞬時離心后，用BIO-RAD CFX96TMReal-Time System 分析目的基因在不同成瘤性MDCK 細(xì)胞中的表達(dá)量。2 h后可以根據(jù)反應(yīng)結(jié)果使用相對定量分析 F=2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其計(jì)算方法為ΔCt=目的基因 Ct 值 - 內(nèi)參基因 Ct 值 ；-ΔΔCt=對照組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；最后2-ΔΔCt反映各樣品相對對照組樣品目的基因的相對表達(dá)水平。利用GraphPad Prism 5作圖分析目的基因的表達(dá)量并作差異性分析。

表4 熒光定量PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 不同成瘤性細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

根據(jù)細(xì)胞生長條件需要，對不同細(xì)胞采用不同的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)48 h后置于顯微鏡下用4倍目鏡觀察細(xì)胞的生長狀況，如圖1所示，發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞輪廓清晰，懸浮細(xì)胞的活力高、結(jié)團(tuán)少、均一性好。其中MRC-5（圖A）成纖維狀生長；貼壁型MDCK-A（圖B）成上皮樣生長；懸浮型MDCK-B（圖C）呈圓形懸浮生長于無血清培養(yǎng)基中，MDCK-C（圖D）成上皮樣生長；可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)結(jié)果

2.2 TRIzol Reagent 提取不同成瘤性細(xì)胞總RNA的純度分析

將提取的RNA進(jìn)行純度分析發(fā)現(xiàn)，所有樣品OD值均在1.8～2.0之間，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。具體結(jié)果見表5。

表5 樣品純度檢測結(jié)果

2.3 不同成瘤性細(xì)胞中SQSTM1基因表達(dá)量的分析

圖2 引物特異性結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果顯示：所設(shè)計(jì)的引物特異性高，定量結(jié)果重復(fù)性好（見圖2），以MRC-5為對照組，發(fā)現(xiàn)SQSTM1在高成瘤性MDCK-A和MDCK-B中高表達(dá)，而在低成瘤性細(xì)胞株MDCK-C中較高成瘤性組大大降低（見圖3）。說明SQSTM1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量可能與細(xì)胞成瘤性成正相關(guān)，可為進(jìn)一步研究SQSTM1在MDCK細(xì)胞成瘤性的作用機(jī)制研究提供理論參考。

圖3 不同成瘤性細(xì)胞中SQSTM1的表達(dá)結(jié)果

3 討論

在本研究中，挑選了前期實(shí)驗(yàn)室凍存的不同成瘤性細(xì)胞，旨在探究SQSTM1在不同成瘤性細(xì)胞中的表達(dá)量關(guān)系，進(jìn)而為利用基因工程手段構(gòu)建穩(wěn)定的低成瘤細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：SQSTM1在高成瘤性MDCK細(xì)胞株MDCK-A和MDCK-B中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于低成瘤性細(xì)胞株MDCK-C。這由MDCK細(xì)胞群的多樣性擴(kuò)展到了其成瘤性蛋白表達(dá)的差異，并為進(jìn)一步開展SQSTM1在MDCK細(xì)胞中的成瘤性機(jī)制研究提供了參考信息。

MDCK細(xì)胞的成瘤性包括多個成瘤相關(guān)基因和抑癌基因的參與，從而導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)制發(fā)生改變。據(jù)報(bào)道，將癌基因v-src轉(zhuǎn)染到MDCK細(xì)胞后下調(diào)了細(xì)胞間的粘附，并刺激膠原凝膠的侵襲，導(dǎo)致細(xì)胞表型發(fā)生上皮-間充質(zhì)的轉(zhuǎn)變[11]。檢測細(xì)胞表面明膠酶A其受體MT1-MMP的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)MDCK細(xì)胞中原明膠酶A由潛伏狀態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，進(jìn)而促進(jìn)裸鼠成瘤[12]。另外ADAMTS12在MDCK細(xì)胞中可通過阻斷Ras-MAPK信號通路的激活來阻止肝細(xì)胞生長因子（HGF）的成瘤作用，并且該調(diào)控涉及金屬蛋白酶的血小板反應(yīng)蛋白域。揭示ADAMTS12金屬蛋白酶通過調(diào)節(jié)依賴于Ras的ERK信號通路顯示抗腫瘤作用[13]。Galectin-8是在人類組織和癌癥中表達(dá)最廣泛的半乳糖凝集素之一。在之前的研究中Galectin-8具有抗腫瘤作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長停滯和凋亡或抑其遷移和腫瘤的生長。但是將Galectin-8轉(zhuǎn)染至MDCK中發(fā)現(xiàn)，Galectin-8可以通過FAK/EGFR/蛋白酶體途徑誘導(dǎo)部分上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，具有侵襲性成瘤能力[14]。

SQSTM1 在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中高表達(dá)，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲表型，其過表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，干擾 SQSTM1可抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，并降低體內(nèi)成瘤性[15]。SQSTM1的過表達(dá)可導(dǎo)致異常信號的激活和包括腫瘤發(fā)生的疾病。在生長因子誘導(dǎo)的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞EMT中積累。SQSTM1增加了參與EMT的TGFb信號和轉(zhuǎn)錄因子介體的穩(wěn)定性[9]。但SQSTM1在MDCK細(xì)胞成瘤性的研究中少有報(bào)道。本研究結(jié)果可用于將來表征不同MDCK細(xì)胞的克隆及馴化，為研究MDCK細(xì)胞腫瘤生物學(xué)特征，以及評估MDCK細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)的試劑等目的提供了基礎(chǔ)。