郭麗娜，馮法銘，韓禹婷，張紹廣，王家敏，喬自林，楊 琨*

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)簡稱VEGF，是具有高度特異性的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的因子，有增強(qiáng)血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖、增加細(xì)胞外基質(zhì)變形和血管形成等作用。VEGF家族成員以結(jié)合抗體的方式來激活血管生成信號通路，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖、分化的相關(guān)生理正常和生理異常微環(huán)境。有三個(gè)主要促進(jìn)血管生成的過程即血管發(fā)生、血管生成、動脈生成。VEGF對腫瘤血管結(jié)構(gòu)的生成、維持和改建具有重要意義，為腫瘤細(xì)胞在生長微環(huán)境中增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移提供有利條件[1]。與腫瘤的生長轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。

科學(xué)研究表明，造成惡性腫瘤患者死亡的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移。一項(xiàng)研究表明，大約90%的癌癥死亡是由轉(zhuǎn)移形成引起的[2]。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程包括從惡性腫瘤原發(fā)部位脫離侵入周圍的基質(zhì)，進(jìn)入淋巴管、體腔或血管，黏附在內(nèi)皮細(xì)胞壁并遷徙到其他部位繼續(xù)生長，導(dǎo)致血管增生并形成與原發(fā)部位同樣類型的腫瘤。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中新血管的形成是腫瘤生長轉(zhuǎn)移和傳播的一種基本活動。

腎臟組織中，血管內(nèi)皮生長因子主要由腎小管上皮細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞產(chǎn)生，在抗間質(zhì)纖維化，保證腎小管周圍毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定，以及腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)完整等方面起到了非常重要的調(diào)控作用[3]。血行轉(zhuǎn)移在腫瘤轉(zhuǎn)移中占重要地位，腎臟作為泌尿器官，以腎小球毛細(xì)血管球過濾血液的形式生成尿液，此時(shí)血液中腫瘤特異性生長因子通過腎小球過濾作用可能留在腎臟中，進(jìn)而形成轉(zhuǎn)移灶。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化染色方法定位分析血管內(nèi)皮生長因子在腎臟中的表達(dá)來反應(yīng)腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，研究VEGF在Hela細(xì)胞注射裸鼠腎臟中的表達(dá)分布情況，為進(jìn)一步揭示VEGF蛋白在裸鼠成瘤過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)動物用到免疫功能缺陷裸鼠：10只，4周齡雌性（BALB/c裸鼠，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司）。

1.2 試劑與儀器

購于國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺的Hela細(xì)胞懸液；購于北京索萊寶科技有限公司的免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（SP-0023）和DBA濃縮型顯色試劑盒，試驗(yàn)所用一抗（兔VEGF多克隆抗體）及二抗（山羊抗兔）均購自北京博奧森技術(shù)有限公司。主要儀器有病理組織切片機(jī)、溫箱、組織攤烤片機(jī)、顯微鏡照相系統(tǒng)等。

1.3 免疫功能缺陷裸鼠異種移植Hela細(xì)胞動物模型的建立

Hela細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)150代，建立并儲存于低溫保存介質(zhì)中。通過皮下注射免疫缺陷裸鼠（BALB/c裸鼠）建立10只動物模型。裸鼠初始體重為16～19 g，接種數(shù)10只，皮下接種200 ml Hela細(xì)胞懸液，相當(dāng)于1.0×107/ml活細(xì)胞，飼養(yǎng)時(shí)間60 d。

1.4 組織采集與固定

10只試驗(yàn)裸鼠均成瘤，瘤體直徑超過1cm或者滿60 d即處死，并迅速進(jìn)行病理解剖，收取瘤體，腎臟等組織器官樣本，及時(shí)放于4%多聚甲醛中固定12 h后更換固定液存放。

1.5 HE染色

組織固定好后，修割成1 cm3的小塊，進(jìn)行包埋。使用病理組織切片機(jī)對包埋好后的石蠟塊進(jìn)行切片，粗切厚度為20μm，細(xì)切厚度為5μm。將切好的組織于組織攤烤片機(jī)中展片，展片后用60℃烤片，烤至組織周圍石蠟融化即可進(jìn)行染色，包括脫蠟、染色、脫水透明一系列步驟，最后使用中性樹脂進(jìn)行封片。

1.6 免疫組化SP染色

石蠟切片（5 μm）烤片后脫蠟至水，蒸餾水和PBS（磷酸緩沖鹽溶液）分別浸泡5 min；經(jīng)抗原修復(fù)（檸檬酸鹽緩沖液-微波熱修復(fù)法）、阻斷、封閉后滴加一抗工作液孵育（37℃濕盒中）；隨后二抗（B液）、三抗（C液）反應(yīng)后，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察至顯色明顯立刻沖水停止反應(yīng)；接著用蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、自來水沖洗反藍(lán)、脫水、透明、封片即可。其中，阻斷用液、封閉用液、二抗和三抗工作液來自免疫組化SP試劑盒；一抗來自兔GnRH多克隆抗體（工作濃度1：400）。

2 結(jié)果

2.1 Hela細(xì)胞接種裸鼠腎臟組織學(xué)觀察

由圖1A所示，在HE染色100倍的視野下腫瘤裸鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，為腎臟被膜和實(shí)質(zhì)的皮質(zhì)部分。毛細(xì)血管充血。圖1B所示為HE染色200倍，可見視野中腎小體內(nèi)含有大量血細(xì)胞，靜脈管中充盈著大量血液，腎小管管腔狹窄，呈淀粉樣變性且出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。于腎間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)少量地從骨髓發(fā)育而來的B淋巴細(xì)胞，可能與腫瘤的生長、移植有關(guān)。

圖1 A和B為Hela細(xì)胞接種裸鼠腎臟組織HE染色圖片

2.2 Hela細(xì)胞接種裸鼠腎臟VEGF蛋白表達(dá)

由圖2C所示，免疫組化染色中所加兔VEGF多克隆抗體與腫瘤裸鼠腎臟中VEGF抗原結(jié)合呈棕黃色陽性反應(yīng)，在腎臟皮質(zhì)中VEGF蛋白主要于腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)，腎小體中弱表達(dá)。圖D同部位200倍視野下可見腎小管管腔變窄，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

圖2 C和D為Hela細(xì)胞接種裸鼠腎臟組織VEGF蛋白免疫組化染色

3 討論

本研究得出，HE染色下腫瘤裸鼠腎臟出現(xiàn)毛細(xì)血管充血，腎小管管腔狹窄、自溶及淀粉樣變性，病理變化可能與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移有關(guān)。免疫組化染色中，VEGF在Hela細(xì)胞腫瘤裸鼠模型腎臟的腎小管上皮細(xì)胞和腎小體中毛細(xì)血管球中均呈陽性表達(dá)，但在腎小管上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)表達(dá)，腎小體毛細(xì)血管球次之。這是因?yàn)閂EGF是腎臟血管形成的主要調(diào)節(jié)因子，并在腎小管上皮細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞中廣泛表達(dá)[4]，但足細(xì)胞數(shù)量少于腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量，因此視覺上腎小管上皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)量強(qiáng)于腎小囊毛細(xì)血管球的血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)量。

研究表明，在動物生理異?；蛘顟B(tài)下，血管通透性增加主要依賴于VEGF通過旁分泌方式來促進(jìn)，將刺激因素對內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用擴(kuò)大，血漿蛋白的外滲得到促進(jìn)，新生血管的臨時(shí)基質(zhì)在此時(shí)形成，為新血管生成創(chuàng)造條件。在腫瘤中，VEGF及其受體高度表達(dá)。通過引起一系列信號傳導(dǎo)來刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，多種腫瘤血管新生的起始和延續(xù)中均有VEGF參與，以促進(jìn)新血管和腫瘤的生長，與腫瘤新生血管的形成數(shù)目息息相關(guān)[5]。

VEGF家族的機(jī)制復(fù)雜，在體內(nèi)的作用多種多樣，VEGF生物學(xué)功能活性包括：一是增加血管通透性：VEGF在引起血管通透性增加的物質(zhì)中是作用最強(qiáng)烈的，血管通透性的增加為腫瘤細(xì)胞的生長以及新血管生成所需營養(yǎng)物質(zhì)和血管支持物創(chuàng)造了有利的條件；二是刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、重建和增殖；三是抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡；四是促進(jìn)形成血管外臨時(shí)基質(zhì)。因其在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中具有重要意義可以作為早期腫瘤檢測指標(biāo)之一。目前用于治療腫瘤的靶向藥物包含VEGF信號通路抑制劑，如可溶性VEGF-C、VEGFR-3和VEGF-3的中和抗體[1]。雖然VEGF信號通路抑制劑治療腫瘤取得良好效果，但VEGF的上游基因是否調(diào)節(jié)和控制VEGF的表達(dá)，以及腫瘤淋巴管、血管生成是否有VEGF對其下游基因表達(dá)影響的原因仍不完全清楚，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。