唐努爾·阿不力米提，帕提曼·米吉提，張璐，古扎麗努爾·阿布力孜

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦外科五科，烏魯木齊 830054

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前由于卵巢癌發(fā)病隱匿，又缺乏有效的早期診斷技術(shù)，導(dǎo)致卵巢癌患者病死率居高不下[1-3]。由于卵巢癌惡性程度高、早期易轉(zhuǎn)移，超過70%患者就診時均已處于晚期，導(dǎo)致手術(shù)后復(fù)發(fā)率高，5年生存率低[2,4-5]。因此探尋卵巢癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療方案和提高患者生活質(zhì)已成為醫(yī)務(wù)工作者面臨的重大挑戰(zhàn)。人類白細(xì)胞抗原-G（human leukocyte antigen-G，HLA-G）是機體內(nèi)一個重要的免疫耐受分子。HLA-G可通過與受體結(jié)合直接抑制多種免疫活性細(xì)胞的生物學(xué)功能，或通過誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞間接抑制機體的免疫應(yīng)答。HLA-G在惡性腫瘤患者血漿中表達(dá)水平明顯升高，腫瘤細(xì)胞表達(dá)HLA-G被認(rèn)為是其逃避宿主細(xì)胞免疫監(jiān)視策略的主要途徑[6-8]。研究顯示，HLA-G在卵巢癌及卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)[6,9-11]，但HLA-G在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制研究較少，本研究探討HLA-G在卵巢癌中的表達(dá)及對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為臨床中及時篩查卵巢癌發(fā)揮重要作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月至2014年12月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的卵巢癌患者。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療及生物治療等。本研究共納入70例卵巢癌患者，≤50歲36例，＞50歲34例；病理類型：漿液性卵巢癌25例，黏液性卵巢癌17例，卵巢子宮內(nèi)膜樣癌15例，透明細(xì)胞癌13例；分化程度：高分化20例，中分化17例，低分化33例。按2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期[12]：Ⅰ期17例，Ⅱ期15例，Ⅲ期20例，Ⅳ期18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例。收集卵巢癌患者的上皮性卵巢癌組織70例。另外，選取同期于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院因子宮肌瘤行全子宮及雙附件手術(shù)治療的40例正常卵巢組織。所有標(biāo)本均經(jīng)病理及影像學(xué)確診。

1.2 細(xì)胞、試劑及儀器

鼠抗人HLA-G單克隆抗體購自英國Serotec公司，ElivisionTM plus免疫組織化學(xué)試劑盒購自上海堃吉實業(yè)有限公司。卵巢癌SKOV-3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。四甲基偶氮唑鹽（MTT）、胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；pcDNA3.1 HLA-G真核表達(dá)載體及空白質(zhì)粒pcDNA3.1購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；Chemi-DocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測及結(jié)果評價

采用免疫組織化學(xué)法檢測HLA-G的表達(dá)情況。取上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織切片后行常規(guī)脫水，于二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ各浸泡10 min，置于枸櫞酸鈉緩沖液中熱修復(fù)抗原。3%H2O2溶液中消除內(nèi)源性的過氧化物酶。一抗孵育4℃過夜，二抗37℃孵育。二氨基聯(lián)苯胺顯色，并用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢。

光鏡下觀察結(jié)果，在細(xì)胞膜上和細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒樣反應(yīng)物為HLA-G陽性結(jié)果。每張切片隨機選擇10個視野，根據(jù)著色強度及范圍綜合評分。根據(jù)著色強度進(jìn)行評分：0分，無著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分：＜10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。著色強度與陽性細(xì)胞所占比例得分之積≥3分為陽性，0～2分為陰性。所有標(biāo)本均經(jīng)一位病理副主任醫(yī)師診斷和一位病理主任醫(yī)師審核。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將SKOV-3細(xì)胞接種于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

當(dāng)SKOV-3細(xì)胞融合度達(dá)到50%時候，利用LipofectamineTM3000脂質(zhì)體將pcDNA3.1 HLA-G真核表達(dá)載體及空白質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染到SKOV-3細(xì)胞中，分別記為過表達(dá)組和對照組，同時設(shè)立不轉(zhuǎn)染任何物質(zhì)的空白組，6 h后換液。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

采用Western blot法檢測過表達(dá)組、對照組和空白組細(xì)胞的HLA-G表達(dá)。裂解液提取3組細(xì)胞的總蛋白，參照標(biāo)準(zhǔn)裂解蛋白曲線來測定蛋白的濃度。取3組變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜后2%牛血清白蛋白室溫下孵育1 h。加入鼠抗人HLA-G單克隆抗體4℃過夜，加入二抗工作液，室溫下?lián)u床中孵育2 h后，加入堿性磷酸酶顯色劑20 min。掃描儀掃描條帶的灰度，自動圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，以空白組細(xì)胞蛋白的光密度值為參考標(biāo)準(zhǔn)1，過表達(dá)組和對照組細(xì)胞中目的蛋白與空白組細(xì)胞蛋白光密度值比值作為各蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 MTT 法檢測細(xì)胞活力

將過表達(dá)組、對照組和空白組細(xì)胞接種到96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入MTT孵育4 h，舍棄上清液，再加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩使結(jié)晶物溶解，于酶標(biāo)儀上測定OD560nm值。

1.7 Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

將Transwell小室放入6孔板中，將過表達(dá)組、對照組和空白組細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上，6孔板中不接種細(xì)胞加入10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，將小室取出來，多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，最后在倒置顯微鏡下觀察并取5個視野中的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取平均值。

將Transwell小室放入6孔板中，Matrigel膠平鋪于Transwell小室上，將過表達(dá)組、對照組和空白組細(xì)胞接種于平鋪Matrigel膠的Transwell小室上，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入MTT孵育4 h，舍棄上清液，再加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩使結(jié)晶物溶解，在倒置顯微鏡下觀察并取5個視野中的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-G陽性表達(dá)率比較

上皮性卵巢癌組織中HLA-G陽性表達(dá)率為82.86%（58/70），明顯高于正常卵巢組織的10.00%（4/40），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=54.937，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中HLA-G表達(dá)水平的比較

低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌患者的上皮性卵巢癌組織中HLA-G陽性表達(dá)率分別明顯高于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。不同年齡和病理類型的卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中HLA-G陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中HLA-G表達(dá)水平的比較

2.3 HLA-G蛋白相對表達(dá)量的比較

過表達(dá)組細(xì)胞的HLA-G蛋白相對表達(dá)量為（2.48±0.25），明顯高于對照組和空白組細(xì)胞的（0.88±0.09）和（0.89±0.09），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=323.266，P＜0.01）。

2.4 細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目的比較

過表達(dá)組、對照組及空白組細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目的比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；過表達(dá)組細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目均明顯高于對照組和空白組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 3組細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目的比較（±s）

表2 3組細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目的比較（±s）

注：a與空白組比較，P＜0.01；b與對照組比較，P＜0.01

組別 細(xì)胞活力 細(xì)胞遷移數(shù)目 細(xì)胞侵襲數(shù)目空白組對照組過表達(dá)組F值P值0.55±0.06 0.55±0.06 0.75±0.08a b 31.819 0.000 125.35±12.39 126.49±13.27 165.34±16.45a b 25.908 0.000 185.32±19.23 186.24±18.97 253.21±25.32a b 33.175 0.000

3 討論

HLA-G主要分布于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮、角膜、胸腺等健康組織或細(xì)胞表面。目前，研究認(rèn)為HLA-G與自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的抑制性受體結(jié)合，抑制NK及CTL細(xì)胞的殺傷作用；也可通過提高腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞免疫應(yīng)答作用，從而使腫瘤細(xì)胞免受宿主免疫細(xì)胞的識別，從而逃逸抗腫瘤免疫反應(yīng)[6,8]。自1998年在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了HLA-G的存在后，隨著研究的進(jìn)展發(fā)現(xiàn)HLA-G在宮頸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌等十幾種腫瘤組織中高表達(dá)[6,8]。Singer等[10]研究發(fā)現(xiàn)74例卵巢癌晚期患者中有45例患者中表達(dá)HLA-G抗原，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)有45例患者腹腔積液、33例患者原發(fā)灶、59例患者實體轉(zhuǎn)移灶均檢測到HLA-G的表達(dá)。本研究免疫組化法結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌組織中HLA-G陽性表達(dá)率明顯高于正常卵巢組織（P＜0.01），與以往研究一致結(jié)果[3,10]。低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌患者的上皮性卵巢癌組織中HLA-G陽性表達(dá)率分別高于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.01），與卵巢癌患者的年齡及病理類型無關(guān)。Jung等[13]采用免疫組織化學(xué)法、Western blot及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測了41例卵巢癌組織及8例正常卵巢組織中HLA-G的表達(dá)，研究表明晚期卵巢癌組織中HLAG蛋白相對表達(dá)量明顯高于正常卵巢組織及早期卵巢癌組織，而且HLA-G陽性患者具有較差的預(yù)后。Andersson等[14]研究表明HLA-G在轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量高于原發(fā)性腫瘤。從而說明HLA-G相對表達(dá)量越高的上皮性卵巢癌組織的惡性程度越高，并伴有轉(zhuǎn)移性，患者預(yù)后較差。

本研究進(jìn)一步探討HLA-G對卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 HLA-G到SKOV-3細(xì)胞中記為過表達(dá)組，同時設(shè)立對照組和空白組細(xì)胞，通過Western blot結(jié)果表明過表達(dá)組細(xì)胞的HLA-G蛋白相對表達(dá)量明顯高于對照組和空白組細(xì)胞（P＜0.01），提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。進(jìn)一步對3組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移及侵襲能力的比較，結(jié)果表明過表達(dá)組細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目均明顯高于對照組和空白組細(xì)胞（P＜0.01），表明HLA-G可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力。

綜上所述，HLA-G在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá)提示卵巢癌分化程度低、FIGO分期高及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，HLA-G的高表達(dá)能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。