顧嵐，陳穎，周仁民，林瓊

無錫市兒童醫(yī)院消化科，江蘇 無錫 214000

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）是一種革蘭陰性螺桿菌，主要在兒童時期經(jīng)糞-口、口-口、胃-口等途徑感染，感染后可引起胃黏膜急慢性炎癥、消化性潰瘍、胃癌等疾病[1-3]。細胞毒素相關(guān)基因A（cytotoxin associated gene A，CagA）編碼的CagA蛋白是Hp重要的毒力因素之一，而白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）作為Hp感染后急性胃炎的重要調(diào)節(jié)因子，與CagA的關(guān)系較為密切[4-6]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）參與機體的炎癥反應(yīng)過程，Hp感染可促進NF-κB活化，進而促進多種炎癥因子的表達，包括IL-8[7-8]。研究表明，多種激酶可調(diào)節(jié)NF-κB p65的磷酸化，包括蛋白激酶CK2[9-10]。CK2是一種多功能信使非依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可參與細胞增殖、癌基因調(diào)節(jié)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與自身免疫性疾病、病毒及寄生蟲感染和各種惡性腫瘤有關(guān)[11-13]。許多細胞系研究中已經(jīng)證實，CK2與NF-κB激活及趨化因子表達有關(guān)[10-13]。本研究探討了CK2介導(dǎo)CagA蛋白誘導(dǎo)人胃腺癌上皮細胞（human gastric adenocarcinoma cell，AGS）內(nèi)IL-8表達的可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人AGS細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，F(xiàn)12K培養(yǎng)基購自美國賽默飛世爾科技公司，胎牛血清、雙抗（青霉素/鏈霉素）混合液均購自美國Gibco公司，重組Hp CagA蛋白、p65、p65-p ser529兔單克隆抗體均購自英國Abcam公司，芹菜素（apigenin）購自英國Tocris公司，人IL-8酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自美國R&D公司，p65siRNA購自美國SantaCruz公司，β-肌動蛋白（β-actin）購自美國CST公司，山羊抗兔二抗購自美國Jackson公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液購自美國Millipore公司，Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、pNF-kB-luc質(zhì)粒、pRLSV40-C質(zhì)粒及雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和處理

將人AGS細胞置于含10%胎牛血清和1%雙抗的F12K培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取3～6代細胞進行實驗。根據(jù)不同實驗條件分組如下。S1組加入CagA，S2組未加入CagA[加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為空白對照]，實驗條件：將AGS細胞內(nèi)分別加入CagA、PBS孵育24 h。A1組未轉(zhuǎn)染p65siRNA且未加入CagA，A2組轉(zhuǎn)染p65siRNA但未加入CagA，A3組未轉(zhuǎn)染p65siRNA但加入CagA，A4組轉(zhuǎn)染p65siRNA且加入CagA，實驗條件：AGS細胞轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染p65siRNA 24 h后，再加入或不加入CagA蛋白孵育24 h。A組轉(zhuǎn)染ConsiRAN但未轉(zhuǎn)染p65siRNA，B組轉(zhuǎn)染p65siRNA但未轉(zhuǎn)染ConsiRAN，實驗條件：AGS細胞轉(zhuǎn)染p65siRNA或ConsiRAN 24 h。B1組未加入apigenin（CK2β抑制劑）和CagA，B2組加入apigenin但未加入CagA，B3組未加入apigenin但加入CagA，B4組加入apigenin和CagA，實驗條件：AGS細胞中加入或不加入apigenin 30 min后，再加入或不加入CagA蛋白孵育24 h。C組為加入CagA 0 min時，D組為加入CagA 20 min時，實驗條件：AGS細胞內(nèi)加入CagA蛋白0、20 min。上述所有分組中，CagA蛋白濃度為10 μg/ml，p65siRNA 濃度為 50 nmol/L，ConsiRNA濃度為 50 nmol/L，apigenin 濃度為 10 μmol/L。所有空白對照均為PBS。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測p65-p、p65蛋白表達

采用Western blot檢測不同條件下AGS細胞中p65-p ser529、p65、β-actin的表達情況。采用PBS洗滌細胞2次后，4℃下將細胞置于RIPA裂解液中裂解30 min，然后4℃ 15 000 r/min，離心20 min。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取40 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜后放入特異性抗體中4℃孵育過夜，然后采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗共孵育1 h，ECL法顯示結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)掃描，根據(jù)條帶灰度顯示情況判斷表達情況。

1.4 ELISA 檢測

采用ELISA試劑盒測定在不同實驗條件下AGS細胞質(zhì)IL-8蛋白的表達水平。

1.5 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測NF-κB轉(zhuǎn)錄活性

將細胞接種于24孔板中，2 h后換為Opti-MEN培養(yǎng)基。使用Lipofectamine2000將pNF-kB-luc與pRL-SV40-C按10∶1比例混合后轉(zhuǎn)染至AGS細胞。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，更換為F12K完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h。根據(jù)實驗分組在加入apigenin（10 μmol/L）30 min后再加入CagA（10 μg/ml）蛋白繼續(xù)培養(yǎng)24 h。去除培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入RIPA裂解液后充分裂解細胞，12 000g離心15 min，取上清液后置于96孔板中，按序加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑和海腎螢光素酶檢測試劑，以空白孔為參照測定每孔的相對熒光信號。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)3個復(fù)孔。相對熒光強度=（螢火蟲熒光素酶RLu實驗組／海腎熒光素酶RLu實驗組）/（螢火蟲熒光素酶RLu對照組／海腎熒光素酶RLu對照組）。RLu為相對熒光素酶活性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Excel 2010及GraphPadPrism 5軟件進行統(tǒng)計分析；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CagA誘導(dǎo)AGS細胞釋放IL-8

S1組AGS細胞中IL-8蛋白的表達水平為（871.25±12.89）pg/ml，高于S2組的（119.00±12.70）pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=83.125，P＜0.05）。

2.2 NF-κB p65參與CagA誘導(dǎo)AGS細胞表達IL-8

B組細胞的p65蛋白表達水平低于A組（圖1）。A1組和A2組細胞的IL-8蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；A4組細胞的IL-8蛋白表達水平明顯低于A3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=72.976，P＜0.01）（表1）。

圖1 Western blot 檢測不同組別AGS細胞中p65蛋白表達

表1 不同組別（p65 siRNA、CagA轉(zhuǎn)染或加入情況不同）AGS細胞中IL-8蛋白的表達水平（pg/ml，±s）

表1 不同組別（p65 siRNA、CagA轉(zhuǎn)染或加入情況不同）AGS細胞中IL-8蛋白的表達水平（pg/ml，±s）

組別IL-8蛋白表達水平A1組A2組A3組A4組668.25±11.09 656.25±5.91 1785.50±20.70 907.00±12.30

2.3 CK2參與CagA誘導(dǎo)AGS細胞表達IL-8

B1組和B2組細胞的IL-8蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；B4組細胞的IL-8蛋白表達水平明顯低于B3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.911，P＜0.01）。（表2）

2.4 CK2介導(dǎo)CagA誘導(dǎo)的AGS細胞內(nèi)NF-κB p65磷酸化及轉(zhuǎn)錄激活

D組細胞的p65-p蛋白表達水平高于C組（圖2）。B4組細胞的p65-p蛋白表達水平低于B3組（圖3）。B1組和B2組細胞的相對熒光強度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；B4組細胞的相對熒光強度明顯低于B3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=25.149，P＜0.01）（表3）。

表2 不同組別（apigenin和CagA加入情況不同）AGS細胞中IL-8蛋白的表達水平（pg/ml，±s）

表2 不同組別（apigenin和CagA加入情況不同）AGS細胞中IL-8蛋白的表達水平（pg/ml，±s）

組別IL-8蛋白表達水平B1組B2組B3組B4組52.75±7.18 45.00±6.22 893.75±37.72 469.75±37.65

圖2 Western blot 檢測不同組別（CagA 加入時間不同）p65-p蛋白表達

圖3 Western blot 檢測不同組別（CagA和apigenin加入情況不同）p65-p蛋白表達

表3 不同組別（CagA和apigenin加入情況不同）AGS細胞的相對熒光強度（±s）

表3 不同組別（CagA和apigenin加入情況不同）AGS細胞的相對熒光強度（±s）

組別 相對熒光強度B1組B2組B3組B4組1.00±0.06 0.95±0.04 2.63±0.06 1.47±0.07

3 討論

Hp感染可引起急慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌、黏膜相關(guān)淋巴瘤等，不同的轉(zhuǎn)歸狀態(tài)與多種因素有關(guān)，CagA是重要因素之一[14]。CagA基因編碼的CagA蛋白與Hp感染導(dǎo)致的胃黏膜損傷程度和臨床癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)[15]。CagA蛋白可以促進NF-κB激活，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄表達（包括IL-8）。CagA蛋白能夠誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞分泌IL-8，促進嗜中性粒細胞趨化至胃黏膜部位，導(dǎo)致胃黏膜產(chǎn)生較強烈的炎癥反應(yīng)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，CagA陽性菌株感染的AGS細胞中IL-8的表達水平高于CagA陰性菌株感染的細胞[16]。本研究中，CagA蛋白刺激AGS細胞后，IL-8的表達水平升高，與上述研究結(jié)果一致。

NF-κB是一種重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，調(diào)節(jié)機體感染后的炎癥反應(yīng)過程。在非活化狀態(tài)下，NF-κB在細胞質(zhì)內(nèi)與κB 抑制蛋白（inhibitor of κB，IκB）結(jié)合，IκB 激酶被激活后導(dǎo)致IκB蛋白被降解，NF-κB得到釋放，隨后NF-κB被進一步激活并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)與目的基因結(jié)合并促進其轉(zhuǎn)錄表達[17]。研究表明，Hp感染可以引起AGS細胞或胃癌患者胃黏膜中NF-κB活化，促進多種炎癥因子的表達，如IL-8、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）[18]。研究表明，AGS 細胞或患兒胃黏膜感染Hp后，CagA陽性菌株較CagA陰性菌株更能促進局部NF-κB的大量激活[18]。本研究證實，p65siRNA能夠沉默AGS細胞中p65的表達，進一步實驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CagA蛋白刺激后，IL-8表達水平升高，但在p65siRNA沉默的細胞中IL-8表達水平較低。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，與未加入CagA蛋白比較，CagA蛋白刺激后，NF-κB p65在ser529位點的磷酸化水平增加，表明NF-κB p65參與CagA誘導(dǎo)AGS細胞表達IL-8過程。

NF-κB亞基p65的磷酸化可增強NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活能力及其與p300的結(jié)合能力，從而誘導(dǎo)目的基因的表達。研究表明，CK2可調(diào)節(jié)NF-κB p65磷酸化[9-10]。CK2是一種多功能信使非依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由兩個催化亞基（α和α'）和兩個調(diào)節(jié)亞基（β）組成，參與多種病理過程[7]。研究表明，CK2能夠促進p65在ser529位點的磷酸化，而抑制這一過程后p65的轉(zhuǎn)錄活性下降[19]。本研究中，CagA蛋白刺激AGS細胞后IL-8表達增加，但使用apigenin抑制CK2β表達后，再使用CagA蛋白刺激AGS細胞，AGS細胞內(nèi)IL-8表達降低，表明CK2參與CagA誘導(dǎo)AGS細胞表達IL-8的過程。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，與加入CagA但未加入apigenin蛋白的AGS細胞相比，同時加入apigenin和CagA蛋白的AGS細胞中，p65在ser529位點的磷酸化水平下降，這表明CK2介導(dǎo)CagA誘導(dǎo)的NF-κB p65在ser529位點的磷酸化過程。本研究也檢測了NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，同時加入apigenin和CagA蛋白組中AGS細胞內(nèi)熒光素酶活性較加入CagA但未加入apigenin蛋白組顯著下降，表明CK2介導(dǎo)CagA誘導(dǎo)的AGS細胞內(nèi)NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活。

綜上所述，CK2可能參與了CagA誘導(dǎo)AGS細胞中NF-κB激活及IL-8表達的過程。