王超 劉明慶 黃思杰 李妍 田偉 陳秋會(huì) 王磊 席運(yùn)官

摘要：在有機(jī)種植條件下，基于高通量測(cè)序分析復(fù)合微生物肥及有機(jī)肥的施用對(duì)有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤微生物區(qū)系的影響，結(jié)合土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性、有機(jī)冬瓜果實(shí)品質(zhì)作相關(guān)分析。結(jié)果顯示，復(fù)合微生物肥的施用顯著降低土壤真菌群落豐富度，施用有機(jī)肥提高真菌群落豐富度，二者均提高土壤真菌、細(xì)菌種群多樣性;根區(qū)土壤中變形菌門、厚壁菌門和放線菌門是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，子囊菌門是優(yōu)勢(shì)真菌;復(fù)合微生物肥和有機(jī)肥的施用均降低厚壁菌門和芽孢桿菌科的相對(duì)豐度，施用復(fù)合微生物肥提高結(jié)合菌門的相對(duì)豐度，降低毛殼菌科和肉座菌科的相對(duì)豐度，施用有機(jī)肥則相反。施肥顯著提高土壤過氧化氫酶、蔗糖酶活性;顯著提高冬瓜總氨基酸含量，顯著降低可溶性固形物含量。因此，施用復(fù)合微生物肥及有機(jī)肥可改變有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤微生物的豐富度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)，提高土壤酶活性，改善有機(jī)冬瓜品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：復(fù)合微生物肥;有機(jī)肥;有機(jī)冬瓜;高通量測(cè)序;微生物區(qū)系

中圖分類號(hào)： S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0266-07

健康的土壤是農(nóng)業(yè)種植生產(chǎn)的基礎(chǔ)，通過施肥培育健康土壤、提升土地質(zhì)量是當(dāng)前我國農(nóng)業(yè)種植生產(chǎn)中提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。相較于常規(guī)農(nóng)業(yè)中化學(xué)肥料的大量使用，施用復(fù)合微生物肥及有機(jī)肥是當(dāng)前有機(jī)種植生產(chǎn)中改良土壤、增加土壤肥力的重要手段。與傳統(tǒng)有機(jī)肥料不同，復(fù)合微生物肥含有特定微生物[1]，田間施用會(huì)將大量微生物引入土壤局部區(qū)域，對(duì)有機(jī)種植土壤中原有的微生物區(qū)系造成影響，甚至?xí)茐耐寥牢⑸鷳B(tài)平衡，須科學(xué)評(píng)價(jià)其對(duì)土壤微生態(tài)的影響。以往的研究主要探討了有機(jī)肥料施用對(duì)植物生產(chǎn)及土壤養(yǎng)分的影響，部分研究關(guān)注其對(duì)常規(guī)農(nóng)業(yè)種植土壤微生物區(qū)系的影響[2-3]，而針對(duì)有機(jī)肥料影響有機(jī)種植土壤微生物區(qū)系的研究極少。對(duì)于土壤微生物的研究，傳統(tǒng)的分析方法包括瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)法、Biolog平板法、磷脂脂肪酸法、PCR-變性梯度凝膠電泳（DGGE）和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）等，但均存在操作復(fù)雜、試驗(yàn)周期長、痕量微生物檢測(cè)困難等弊端，無法深入分析，而高通量測(cè)序技術(shù)通過檢測(cè)土壤微生物細(xì)胞內(nèi)特定遺傳物質(zhì)（原核微生物16S rDNA/rRNA、真核微生物18S rDNA/rRNA）的堿基序列，可以更全面、準(zhǔn)確地揭示土壤中微生物群落的復(fù)雜性和多樣性，已被廣泛應(yīng)用于土壤微生物區(qū)系研究[4-6]。

2015年農(nóng)業(yè)部制定了《到2020年化肥使用量零增長行動(dòng)方案》，明確了“有機(jī)肥替代化肥”的技術(shù)路徑，同時(shí)確立“一控兩減三基本”的目標(biāo)，力爭實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥化肥的零增長。在此背景下，有機(jī)肥料及微生物肥料的作用越來越凸顯。截至2016年7月，農(nóng)業(yè)部登記的微生物肥料產(chǎn)品達(dá)到2 780個(gè)，年產(chǎn)量已突破1 000萬t，應(yīng)用面積超過1 333萬hm2[7]。與之相對(duì)應(yīng)的是我國有機(jī)作物種植面積的快速增長，截至2015年年底，有機(jī)植物生產(chǎn)面積為222.4萬hm2，有機(jī)生產(chǎn)面積已達(dá)全國農(nóng)業(yè)耕地面積的0.77%[8]。隨著我國有機(jī)作物種植面積的不斷增長，有機(jī)肥及復(fù)合微生物肥必將被大量施用，然而其在提升有機(jī)種植耕作層土壤質(zhì)量中的作用尚缺乏明確的科學(xué)依據(jù)，因此需要科學(xué)評(píng)測(cè)二者對(duì)有機(jī)種植土壤微生物區(qū)系的影響。本研究基于Illumina新一代Miseq平臺(tái)的高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)方法，全面分析土壤細(xì)菌16S rRNA基因V3+V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)的多樣性指數(shù)及群落結(jié)構(gòu)，旨在研究江蘇省儀征市有機(jī)蔬菜田在輪作種植條件下，復(fù)合微生物肥及有機(jī)肥對(duì)有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，并結(jié)合土壤化學(xué)性質(zhì)、酶活性以及有機(jī)冬瓜果實(shí)品質(zhì)作相關(guān)分析，以期科學(xué)反映施用復(fù)合微生物肥及有機(jī)肥對(duì)有機(jī)種植土壤健康的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

田間試驗(yàn)選址在江蘇省儀征江揚(yáng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司四莊基地有機(jī)蔬菜田（119°7′4.3″E，32°22′59.8″N;有機(jī)認(rèn)證證書編號(hào)：134OP1200259），土壤類型為潮土，年平均氣溫 15.3 ℃，年日照時(shí)數(shù)2 054.1 h，無霜期224 d，年均降水量約994 mm。經(jīng)本研究種植前采樣分析測(cè)定得到，試驗(yàn)田0～20 cm 土壤基本性質(zhì)：pH值6.59，銨態(tài)氮含量12.67 mg/kg，速效磷含量 20.33 mg/kg，速效鉀含量201.06 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量33.27 g/kg，過氧化氫酶活性10.16 U/g，蔗糖酶活性 15.67 U/g，脫氫酶活性271.91 U/g，脲酶活性1 330.98 U/g，酸性磷酸酶活性17.42 U/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年5—10月進(jìn)行，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置3個(gè)處理，分別為復(fù)合微生物肥處理（B）、有機(jī)肥處理（O）和對(duì)照（C），每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共9個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為3 m×10 m=30 m2，保護(hù)行寬為1 m，走道寬及小區(qū)間排水溝寬均為0.5 m。試驗(yàn)作物為冬瓜[Benincasa hispida （Thunb.） Cogn.]，前茬作物為青菜（Brassica chinensis L.）。復(fù)合微生物肥處理和有機(jī)肥處理施肥作為基肥，施用量均為1 500 kg/hm2，對(duì)照組不施肥。田間管理及有害生物防治采取有機(jī)管理模式。

復(fù)合微生物肥[微生物肥（2017）準(zhǔn)字（2285）號(hào)]由作物秸稈制作而成，總養(yǎng)分含量為8%，有機(jī)質(zhì)含量為20%，有效活菌數(shù)為0.2億個(gè)/g，其中細(xì)菌數(shù)量為0.16億個(gè)/g，真菌數(shù)量為0.03億個(gè)/g，其他菌種數(shù)量為0.01億個(gè)/g。有機(jī)肥[蘇農(nóng)肥（2012）準(zhǔn)字0381號(hào)]的有機(jī)質(zhì)含量≥45%，總養(yǎng)分含量≥5%。

1.3 樣品采集

土壤樣品采集于第1次盛花期進(jìn)行，用土壤采樣器鉆取各處理小區(qū)0～20 cm根區(qū)土壤，按照“S”形多點(diǎn)取樣，每小區(qū)鉆取6鉆，去除根系、雜草、土壤動(dòng)物和石塊等雜質(zhì)后充分混勻作為1個(gè)根區(qū)土壤樣品，采用四分法平均分成2份，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，分別置于-80 ℃和-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

有機(jī)冬瓜樣品統(tǒng)一采集第2批進(jìn)入成熟期的冬瓜果實(shí)，每個(gè)處理隨機(jī)選取3個(gè)果實(shí)進(jìn)行品質(zhì)測(cè)定。

1.4 土壤性質(zhì)測(cè)定

土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干、研磨過篩（1 mm）后，參照文獻(xiàn)[9]的方法測(cè)定其理化性質(zhì)。其中，pH值使用pH計(jì)測(cè)定（土水比1 g ∶5 mL）;將土壤樣品用濃度為 0.5 mol/L 的K2SO4溶液浸提1 h后，用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定氨態(tài)氮含量;速效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-分光光度法測(cè)定;速效鉀含量采用1 mol/L CH3COONH4浸提-火焰光度法測(cè)定;有機(jī)質(zhì)含量采用油浴外加熱-K2Cr2O2容量法測(cè)定。土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、脫氫酶、脲酶和酸性磷酸酶的活性分別使用南京建成生物工程研究所提供的土壤酶試劑盒測(cè)定。

1.5 土壤微生物總DNA提取和高通量測(cè)序

采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit（OMEGA，美國）的試劑盒提取土壤微生物總DNA，采用NanoDrop-ND1000測(cè)定提取的DNA濃度，并經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，合格后用于構(gòu)建文庫;以各土壤樣品微生物總DNA為模板，以細(xì)菌V3+V4區(qū)（338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[10]和真菌ITS1區(qū)（ITS1F 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′;2043R 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）[11]特異性引物為擴(kuò)增引物進(jìn)行融合引物PCR;采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序分析，測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.6 有機(jī)冬瓜品質(zhì)測(cè)定

游離氨基酸含量測(cè)定參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》;可溶性固形物含量測(cè)定參照GB/T 8210—2011《柑桔鮮果檢驗(yàn)方法》;可溶性總糖含量測(cè)定參照NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的測(cè)定 銅還原碘量法》;總酸度測(cè)定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》;糖酸比以可溶性總糖含量與總酸度的比值表示;蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》;粗纖維含量測(cè)定參照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測(cè)定》;維生素C含量測(cè)定參照GB 5009.86—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中抗壞血酸的測(cè)定》;硝酸鹽含量測(cè)定參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性及有機(jī)冬瓜品質(zhì)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行整理和圖表制作，用DPS 7.05進(jìn)行方差分析（LSD法），顯著性水平設(shè)定為0.05。

測(cè)序數(shù)據(jù)采用FLASH[12]和Trimmomatic[13]軟件進(jìn)行過濾優(yōu)化和雙端序列連接，優(yōu)質(zhì)序列利用Usearch軟件基于97%的相似水平進(jìn)行OTU（operational taxonomic units）聚類，根據(jù)Silva細(xì)菌數(shù)據(jù)庫[14]和Unite真菌數(shù)據(jù)庫利用RDP Classifier進(jìn)行物種注釋和分類[15];基于OTU豐度信息，利用R語言工具制作稀釋曲線（rarefaction curve）、Venn圖和群落柱形圖，利用Mothur軟件計(jì)算α-多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson、Chao、ACE）[16-17]，并用Excel和DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物文庫測(cè)序結(jié)果評(píng)價(jià)

本研究對(duì)9個(gè)土壤樣品進(jìn)行了Illumina MiSeq高通量測(cè)序，數(shù)據(jù)經(jīng)過濾優(yōu)化，細(xì)菌文庫共得到392 525條有效序列，序列長度分布在267～516 bp之間，97%相似水平下聚類獲得21 528個(gè)OTU;真菌文庫共得到541 244條有效序列，序列長度分布在204～452 bp之間，97%相似水平下聚類獲得 5 694 個(gè)OTU。每個(gè)樣品的有效序列數(shù)量和OTU數(shù)量如表1所示，各處理組間細(xì)菌文庫的有效序列數(shù)和OTU數(shù)、真菌文庫的有效序列數(shù)差異不顯著，處理組B真菌文庫的OTU數(shù)顯著低于處理組O和對(duì)照組C（P<0.05）。

稀釋曲線反映了樣品文庫測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，可用于評(píng)價(jià)測(cè)序數(shù)據(jù)量能否覆蓋所有類群。細(xì)菌和真菌多樣性稀釋曲線（圖1）顯示，隨著測(cè)序量的不斷增大，各樣品OTU數(shù)目的增加趨勢(shì)趨于平緩，最終基本達(dá)到飽和，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理;在97%相似水平上計(jì)算各土壤樣品測(cè)序的覆蓋率，結(jié)果（表2）顯示，細(xì)菌文庫測(cè)序覆蓋率在98%以上，真菌文庫測(cè)序覆蓋率在99%以上，說明取樣合理，處理組間微生物文庫測(cè)序覆蓋率差異不顯著。因此，測(cè)序數(shù)據(jù)能夠真實(shí)地反映土壤樣品中的微生物群落，但可能仍有少量微生物種類未被發(fā)現(xiàn)。

2.2 施肥對(duì)根區(qū)土壤微生物群落豐富度和多樣性的影響

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于反映土壤樣品中微生物的多樣性，前者數(shù)值越大，表示群落多樣性越高;后者數(shù)值越大，表示群落多樣性越低[18]。表2數(shù)據(jù)顯示，施用肥料后，處理組B有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)下降，處理組O Shannon指數(shù)上升、Simpson指數(shù)下降，但與對(duì)照組C之間差異均不顯著。處理組B土壤真菌Shannon指數(shù)上升、Simpson指數(shù)下降，處理組O Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)上升，與對(duì)照組C之間差異均不顯著?？梢?，有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤施用復(fù)合微生物肥和有機(jī)肥可分別在一定程度上提高土壤真菌、細(xì)菌種群多樣性。

ACE指數(shù)和Chao指數(shù)可反映群落物種豐富度。由表2數(shù)據(jù)可知，有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤細(xì)菌ACE指數(shù)和Chao指數(shù)在施用復(fù)合微生物肥后上升，上升幅度分別為3.17%和3.98%，處理組O指數(shù)變化幅度不大，均與對(duì)照組C之間差異均不顯著。與對(duì)照組C相比，施用復(fù)合微生物肥顯著降低土壤真菌的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)（P<0.05），分別降低8.39%、9.39%;處理組O指數(shù)小幅上升，差異不顯著。結(jié)果表明，施用復(fù)合微生物肥在一定程度上豐富了有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，但顯著降低真菌群落豐富度;施用有機(jī)肥則提高了土壤真菌群落豐富度。

2.3 施肥后根區(qū)土壤微生物類群分析

在97%的相似水平上，對(duì)照組C、處理組B、處理組O土壤樣品分別得到2 373、2 422、2 380個(gè)細(xì)菌OTU（平均值），差異不顯著;得到631、595、672個(gè)真菌OTU（平均值），處理組O顯著高于對(duì)照組C和處理組B（表1）。可見，施用復(fù)合微生物肥和有機(jī)肥在一定程度上提高了有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤細(xì)菌類群的特異性;施用復(fù)合微生物肥顯著降低土壤真菌類群的特異性，施用有機(jī)肥則顯著提高土壤真菌類群的特異性。

Venn圖可直觀展現(xiàn)并反映組間或樣品之間的OTU數(shù)目組成相似性、重疊情況以及特異性[19]。由圖2-A可知，對(duì)照組C、處理組B和處理組O之間共有的細(xì)菌OTU數(shù)目為 2 257個(gè)，代表的物種分別屬于α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、放線菌綱（Actinobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteria）和芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）（占比超過1.5%的綱）。對(duì)照組C、處理組B、處理組O特有的OTU數(shù)分別為59、74、67個(gè)，說明施用復(fù)合微生物肥和有機(jī)肥會(huì)增加有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤特有細(xì)菌物種。

從圖2-B中可以看出，對(duì)照組C、處理組B和處理組O共有的真菌OTU數(shù)目為474個(gè)，主要共有物種分別屬于盤菌綱（Pezizomycetes）和糞殼菌綱（Sordariomycetes）（占比超過7%的綱）。對(duì)照組C、處理組B、處理組O特有的OTU數(shù)分別為74、74、127個(gè)，說明施用有機(jī)肥會(huì)增加根區(qū)土壤特有真菌物種。

2.4 施肥對(duì)根區(qū)土壤微生物群落分布特征的影響

在門分類水平上的細(xì)菌類群分布及相對(duì)豐度如圖3-A所示，有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤樣品中的細(xì)菌包含變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）等菌群，處理組B、處理組O和對(duì)照組C細(xì)菌群落組成相似;除了未分類的其他菌群，變形菌門、厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度較高，屬于優(yōu)勢(shì)細(xì)菌;施用復(fù)合微生物肥和有機(jī)肥不同程度地降低了根區(qū)土壤厚壁菌門的相對(duì)豐度，分別比對(duì)照組C降低18.55%、26.07%;處理組B根區(qū)土壤酸桿菌門相對(duì)豐度較對(duì)照組C降低25.09%，而處理組O則升高32.38%。從細(xì)菌科的分類水平（圖3-B）上看，除未確定科類外，有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤中芽孢桿菌科（Bacillaceae）、黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae）、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）和鞘酯菌科（Sphingomonadaceae）的相對(duì)豐度均較高（數(shù)值>3%），屬于優(yōu)勢(shì)細(xì)菌;施用復(fù)合微生物肥和有機(jī)肥分別使芽孢桿菌科相對(duì)豐度降低了18.09%、26.37%。

圖3-C為有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤真菌在門分類水平上的物種柱狀圖，子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）等在處理組B、處理組O和對(duì)照組C土壤樣品中均有分布，子囊菌門是優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度占比超過84%;受限于數(shù)據(jù)庫的原因，相對(duì)豐度排名第2的菌群未能分類;施用復(fù)合微生物肥使根區(qū)土壤接合菌門的相對(duì)豐度提高35.99%，施用有機(jī)肥則降低接合菌門的相對(duì)豐度，降幅為22.29%。圖 3-D顯示，有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤真菌在科水平上主要包括毛殼菌科（Chaetomiaceae）、肉座菌科（Hypocreaceae）、叢赤殼科（Nectriaceae）、發(fā)菌科（Trichocomaceae）和小囊菌科（Microascaceae）等，除了未確定科類的菌群外，子囊菌門中毛殼菌科的相對(duì)豐度在處理組B、處理組O和對(duì)照組C中均最大，是優(yōu)勢(shì)菌群;施用復(fù)合微生物肥降低了毛殼菌科、肉座菌科的相對(duì)豐度（比對(duì)照組C降低19.37%、46.02%），施用有機(jī)肥則提高了毛殼菌科、肉座菌科的相對(duì)豐度（比對(duì)照組C提高23.07%、42.00%）;施用復(fù)合微生物肥、有機(jī)肥均降低了叢赤殼科的相對(duì)豐度（比對(duì)照組C降低39.36%、22.95%）。

2.5 施肥對(duì)根區(qū)土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性的影響

本研究于有機(jī)冬瓜第1次盛花期測(cè)定了根區(qū)土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性，結(jié)果（表3）顯示，處理組B、處理組O和對(duì)照組C土壤銨態(tài)氮、速效鉀、速效磷含量均低于種植前，處理組B各項(xiàng)化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)略低于對(duì)照組C，處理組O則高于對(duì)照組C（除pH值外），差異均不顯著。施用有機(jī)肥和復(fù)合微生物肥顯著提高了根區(qū)土壤過氧化氫酶及蔗糖酶活性，對(duì)脫氫酶、脲酶和酸性磷酸酶活性影響不顯著（表4）。

2.6 施肥對(duì)有機(jī)冬瓜品質(zhì)的影響

本研究對(duì)第2批進(jìn)入成熟期的有機(jī)冬瓜果實(shí)進(jìn)行了營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定分析，結(jié)果（表5）顯示，施用復(fù)合微生物肥和有機(jī)肥均顯著提高有機(jī)冬瓜果實(shí)總氨基酸、總糖、總酸的含量（處理組B比對(duì)照組C分別上升15.38%、135.29%、14.29%;處理組O比對(duì)照組C分別上升7.69%、17.65%、14.29%），二者均顯著降低了可溶性固形物、蛋白質(zhì)、維生素C的含量（處理組B比對(duì)照組C分別下降13.31%、26.86%、34.27%;處理組O比對(duì)照組C分別下降17.34%、45.14%、14.77%）;施用有機(jī)肥可提高有機(jī)冬瓜果實(shí)硝酸鹽含量，較對(duì)照組C升高5.64%，影響不顯著;施用復(fù)合微生物肥可顯著降低有機(jī)冬瓜果實(shí)硝酸鹽含量（P<0.05），較對(duì)照組C降低 12.09%。

3 討論

當(dāng)前，高通量測(cè)序技術(shù)已被廣泛用于土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究[5]。針對(duì)復(fù)合微生物肥及有機(jī)肥施用對(duì)有機(jī)種植土壤微生物區(qū)系影響的研究鮮有報(bào)道，本研究基于Illumina Miseq平臺(tái)，對(duì)有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤細(xì)菌16S rRNA基因V3+V4區(qū)域和真菌ITS1區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，施用復(fù)合微生物肥會(huì)提高細(xì)菌群落多樣性，降低土壤真菌群落豐度，與顧欣等在設(shè)施田塊西瓜種植中應(yīng)用菌肥的研究結(jié)果[20]一致?；赟ilva和Unite數(shù)據(jù)庫分析顯示，有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤中變形菌門、厚壁菌門和放線菌門是主要細(xì)菌類群，與Schloss等利用16S rRNA對(duì)農(nóng)田土壤細(xì)菌進(jìn)行生態(tài)學(xué)分類的結(jié)果[21]一致;子囊菌門是主要真菌類群，與Roesch等對(duì)土壤微生物群落的研究結(jié)果[22]一致。

α-多樣性指數(shù)是有效評(píng)價(jià)土壤微生物群落多樣性和物種豐富度的指標(biāo)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)肥提高了有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤細(xì)菌多樣性Shannon指數(shù)，施用復(fù)合微生物肥提高了細(xì)菌豐富度ACE、Chao指數(shù)，游偲等同樣發(fā)現(xiàn)，采用枯草芽孢桿菌菌劑處理后的煙草根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均提高[24]。多數(shù)植物病原菌來自真菌，康捷等發(fā)現(xiàn)，麻山藥糊頭病和根莖腐病發(fā)病植株土壤真菌多樣性和豐富度均高于健康植株[25]，本研究顯示，施用復(fù)合微生物肥能顯著降低有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤真菌群落豐富度，表明它在一定程度上能減少有機(jī)種植作物受病原真菌侵害的概率。有機(jī)肥可為土壤微生物的活動(dòng)提供所需的碳源、氮源和能量，并可改善土壤微生態(tài)環(huán)境的理化性狀，促進(jìn)微生物的生長和繁殖，增加微生物數(shù)量[26];有機(jī)質(zhì)被認(rèn)為是影響土壤微生物動(dòng)態(tài)的主要因素[27];本研究同樣發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)肥會(huì)提高土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性及豐富度，土壤有機(jī)質(zhì)含量也相應(yīng)提高。

本研究發(fā)現(xiàn)，施用復(fù)合微生物肥和有機(jī)肥均會(huì)降低有機(jī)冬瓜根區(qū)土壤真菌叢赤殼科的相對(duì)豐度，同時(shí)，有機(jī)肥處理組土壤毛殼菌科真菌相對(duì)豐度升高。李發(fā)虎等發(fā)現(xiàn)，施用玉米秸稈生物炭后黃瓜結(jié)果期土壤子囊菌門毛殼菌科比例明顯提高[28]。毛殼菌通過重寄生和產(chǎn)生毛殼素等抗生素對(duì)病原菌產(chǎn)生拮抗作用，是重要的植物病害生防真菌[29]。子囊菌門叢赤殼科（Nectricaceae）菌多屬菌生真菌，可以寄生病原真菌[30]?？梢姡┯脧?fù)合微生物肥有助于控制有機(jī)種植作物病害發(fā)生。

有機(jī)肥有機(jī)質(zhì)含量高、養(yǎng)分全面、肥效長，在作物種植中發(fā)揮著改良土壤、改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、提高作物品質(zhì)等作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合微生物肥及有機(jī)肥的施用均能顯著提高土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性;與對(duì)照組相比，有機(jī)肥處理在一定程度上提高了有機(jī)冬瓜果實(shí)硝酸鹽含量，與汪峰等對(duì)大棚黃瓜施用有機(jī)肥的研究結(jié)果[32]一致;李瑞霞等研究表明，木霉NJAU4742生物有機(jī)肥處理的番茄果實(shí)硝酸鹽含量降低[33]，本研究同樣發(fā)現(xiàn)，施用復(fù)合微生物肥能顯著降低有機(jī)冬瓜果實(shí)硝酸鹽含量，可能與其中特定的微生物有關(guān);同時(shí)，有機(jī)肥處理在一定程度上提高了土壤銨態(tài)氮、速效鉀、速效磷和有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分含量。曲成闖等同樣發(fā)現(xiàn)，施用復(fù)合微生物肥能提高黃瓜不同生育期潮土土壤過氧化氫酶、脲酶活性[34]。研究表明，土壤微生物量關(guān)系到土壤肥力狀況是否良好，它們之間存在顯著相關(guān)性[35]。同樣，土壤酶活性與土壤微生物關(guān)系密切，影響土壤微生物的因素同樣影響土壤酶活性[31]。珊丹等發(fā)現(xiàn)，施用微生物菌肥的土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌菌落數(shù)量均顯著高于未施肥處理（P<0.05），而且細(xì)菌、真菌菌落數(shù)量與土壤蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶活性之間有一定的正相關(guān)性[36]。本研究中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化與過氧化氫酶、蔗糖酶活性顯著變化的相關(guān)性還需進(jìn)一步探討。

土壤微生物類群復(fù)雜，微生物群落特征是多種微生物種群協(xié)同作用的結(jié)果，不能依照單一或某幾個(gè)種群的變化闡釋施肥對(duì)有機(jī)種植土壤微生物區(qū)系的影響，后續(xù)研究將進(jìn)行長期定位連續(xù)觀測(cè)，并對(duì)微生物群落特征與土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步揭示其影響作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，根區(qū)土壤微生物中未分類或未確定種屬的物種受復(fù)合微生物肥和有機(jī)肥施用的影響，受限于數(shù)據(jù)庫原因，未能解釋，有待通過深度測(cè)序或利用其他先進(jìn)手段對(duì)這些微生物進(jìn)行更細(xì)致深入的分類研究。

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