王子靖海 ，李家欣，朱運平，2*，鄭勝藍，3，喬支紅，張煒煒，李 會

（1.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；3.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048；4.北京聯(lián)合大學(xué) 旅游學(xué)院，北京 100101）

酸漿豆腐是我國特色的傳統(tǒng)食品，其制作的獨特之處在于用酸漿代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鹽鹵和石膏作為凝固劑。酸漿豆腐一直依靠工人多年經(jīng)驗進行生產(chǎn)的小作坊制作方式，先將酸漿老湯加入黃漿水，其中的乳酸菌在常溫下將黃漿水自然發(fā)酵為酸漿[1]，再使用酸漿作為酸性凝固劑，通過點漿使豆?jié){凝固制成酸漿豆腐。酸漿豆腐口感細膩，風(fēng)味獨特[1]，在我國山東等地已經(jīng)作為特色食品被列入“非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”。然而手工作坊式的生產(chǎn)方式具有酸漿質(zhì)量無法保障，生產(chǎn)效率低，貨架期不穩(wěn)定等缺點[2]。為了實現(xiàn)酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)，促進我國傳統(tǒng)食品的“食文化”廣泛傳播，對酸漿中的乳酸菌進行分離篩選，發(fā)掘產(chǎn)酸能力強的菌株并探究其性質(zhì)，為今后酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

部分學(xué)者對豆腐酸漿中的微生物開展了初步探索，喬支紅等[3]利用從豆腐酸漿老湯中篩選到的5株產(chǎn)酸菌發(fā)酵大豆黃漿水，以酸漿的pH值為考察指標，探討了單菌發(fā)酵、雙菌發(fā)酵、發(fā)酵溫度、菌種接種量及菌種的混合比例對酸漿pH值的影響，結(jié)果表明，酸漿純種發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為雙菌混合發(fā)酵，混合比例1∶9（1號菌∶3號菌），接種量5%，發(fā)酵時間24 h，發(fā)酵溫度42 ℃；賀云等[4]從云南牟定地區(qū)的10份自然發(fā)酵酸漿豆腐中分離篩選得到6種乳酸菌，并分別鑒定為類布氏乳桿菌（Lactobacillus parabuchneri）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、德式乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）和粘膜乳桿菌（Lactobacillus mucosa），其中植物乳桿菌產(chǎn)酸能力最強；劉倩等[5]從豆清發(fā)酵液中分離純化出3株產(chǎn)酸菌，經(jīng)生理生化和16S rRNA基因序列分析鑒定該菌株為產(chǎn)酸解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus）。但現(xiàn)有研究局限于單一產(chǎn)地，缺乏對全國酸漿菌種差異的整體研究。

本研究從云南建水、陜西榆林、山東鄒平、河北淶源、云南石屏以及北京延慶6個國內(nèi)具有代表性的酸漿豆腐產(chǎn)地中的7種豆腐酸漿老湯中篩選分離各樣品中的高產(chǎn)酸乳酸菌，通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)進行鑒定，并對其產(chǎn)酸能力、耐酸性、耐鹽性等生長特性進行研究，旨在對全國主要酸漿豆腐產(chǎn)地中的產(chǎn)酸菌構(gòu)成及特性進行探究，為酸漿中優(yōu)質(zhì)乳酸菌生物資源的篩選以及后續(xù)酸漿生產(chǎn)工業(yè)化奠定基礎(chǔ)、提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

豆腐酸漿老湯：云南建水、陜西榆林、山東鄒平、河北淶源、云南石屏以及北京延慶的酸漿豆腐加工作坊。

1.1.2 培養(yǎng)基

黃漿水培養(yǎng)基：為豆腐壓濾成型后的黃色瀝水，取自北京延慶豆腐廠。

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

以上培養(yǎng)基在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖、無水碳酸鈣、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（色譜純）：北京博奧拓達公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、回收試劑盒、DL3000 DNA Marker、TransTaq-T DNA Polymerase（250 U）、10×TransTaq-T Buffer、2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）、6×DNA Loading Buffer：美國TransTaq公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP20001電子天平：上海雷韻實驗儀器制造有限公司；PHS-3CpH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DL-CJ-2ND型超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；YQX-SG46-280S自動高壓滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TENSUC恒溫培養(yǎng)箱：上海天呈實驗儀器制造有限公司；TU-1900紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TGL-16aR高速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；1260series高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國Agilent科技有限公司；T1000聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸漿增殖培養(yǎng)

酸漿的活化與增殖培養(yǎng)采用喬支紅等[6]的方法。取5 mL酸漿接種于20 mL黃漿水培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。

1.3.2 產(chǎn)酸菌株的分離純化

將增殖培養(yǎng)的酸漿經(jīng)無菌生理鹽水梯度稀釋至10-4、10-5、10-6三個梯度，取100 μL梯度稀釋液于空白培養(yǎng)皿中，倒入融化并冷卻至45 ℃左右的含有2%CaCO3的MRS肉湯培養(yǎng)基[7]，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。挑取產(chǎn)生溶鈣圈的菌落于MRS固體培養(yǎng)基反復(fù)劃線分離直至出現(xiàn)單菌落，鏡檢后選取符合乳酸菌形態(tài)、無雜菌的菌落接種于MRS斜面培養(yǎng)基于4 ℃保存。

1.3.3 高產(chǎn)酸菌株的篩選

將每個樣品中分離純化得到的乳酸菌活化后接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)基pH值，選取每個樣品中pH值最低的菌株為該樣品中高產(chǎn)酸菌株。

1.3.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板對菌株的16S rDNA進行PCR擴增。PCR擴增引物為16S rDNA通用引物1492R、27F[8]；PCR擴增體系：10×buffer 5 μL，10×TransTaq-T 0.5 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，DNA模板1 μL，dNTPs 4 μL。PCR擴增程序：預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，29個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段。將PCR擴增產(chǎn)物用回收試劑盒回收，使用測序儀對PCR擴增產(chǎn)物進行測序。

將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA-X 10.1軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。

1.3.5 產(chǎn)酸量測定

將活化后的菌種按2%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)。取樣時間間隔為前12 h每隔2 h取樣測定；12 h后每隔4 h取樣測定；24 h后每隔12 h取樣測定。發(fā)酵液經(jīng)蒸餾水稀釋10倍后，滴加5滴酚酞溶液，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色出現(xiàn)，且30 s后不褪色即為滴定終點，記錄NaOH消耗體積，三組平行[10]。以滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)基作為空白對照，計算產(chǎn)酸量，其計算公式如下：

X為樣品產(chǎn)酸量（以乳酸計），g/100 mL；V1為樣品消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；V2為空白培養(yǎng)基消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；CNaOH為標定的氫氧化鈉濃度，g/L；0.09為乳酸的換算系數(shù)。

1.3.6 有機酸組成分析

將活化后的菌種接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)12 h。采用高效液相色譜（HPLC）進行有機酸組成分析[11]。液相色譜條件：色譜柱為Carbomix H-NP10：8%（10 μm，7.8×300 mm）；流動相為20 mmol/L NaH2PO4；進樣體積為10 μL；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為210 nm。

1.3.7 耐酸性測定

以自然pH值的MRS肉湯培養(yǎng)基（pH 6.83）作為空白對照，將預(yù)先活化好的菌株按2%（V/V）的接種量分別接種于pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，采用分光光度計在波長600 nm處測定其OD600nm值。

1.3.8 耐鹽性測定

將預(yù)先活化好的菌株按2%（V/V）的接種量接種于鹽濃度分別為0、1%、2%、3%、4%、5%的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，測定其OD600nm值。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

利用Excel與SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，使用MEGA-X 10.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集情況

于云南建水、陜西榆林、山東鄒平、河北淶源、云南石屏以及北京延慶等地的7個酸漿豆腐廠采集樣品，涵蓋我國主要酸漿豆腐產(chǎn)地。豆腐酸漿老湯樣品采集情況見表1。

表1 豆腐酸漿老湯樣品采集信息Table 1 Collection information of fermented soy-whey samples

由表1可知，我國不同地區(qū)的豆腐酸漿老湯的pH值存在一定差異，其中取自陜西榆林的2號樣品pH值最高，為3.63；取自山東鄒平的3號樣品pH值最低，為2.45。其余樣品pH值均在2.71～3.02之間，呈酸性。結(jié)果表明，采集的豆腐酸漿老湯樣品pH值范圍與趙貴麗等[12]采用黃漿水發(fā)酵制成的酸漿老湯pH值基本一致。

2.2 高產(chǎn)酸菌株的分離篩選

通過含2%CaCO3MRS培養(yǎng)基從7種豆腐酸漿老湯樣品中共分離篩選出31株溶鈣圈較明顯的產(chǎn)酸菌，通過菌落形態(tài)、顯微鏡鏡檢最終篩選出16株菌落形態(tài)差異較大的菌株。經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)酸能力測定后，每種樣品中選取發(fā)酵液pH最低的菌株視為該樣品中的高產(chǎn)酸菌株，共7株，分別編號為L1-02、L2-03、L3-01、L6-07、L7-01、L8-03、L10-01。

2.3 高產(chǎn)酸菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

7株高產(chǎn)酸菌株中，部分菌株在CaCO3-MRS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)分別見圖1、圖2。

圖1 部分高產(chǎn)酸菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of some high yield acid-producing strains

圖2 7株高產(chǎn)酸菌株的細胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology of 7 high yield acid-producing strains

由圖1可知，菌落均為乳白色，邊緣較為整齊，單個菌落半徑較小，呈圓形，半透明狀態(tài)。由圖2可知，經(jīng)過革蘭氏染色后，均為紫色革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀與短棒狀，符合乳酸菌菌落形態(tài)與菌體特征[13]。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

將7株高產(chǎn)酸菌株的DNA序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，并使用MEGA-X 10.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 基于16S rDNA序列7株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 7 strains based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，菌株L2-03、L3-01、L6-07、L7-01與玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae）聚于一支，菌株L1-02、L8-03、L10-01與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）聚于一支，親緣關(guān)系最近。因此，綜合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果[14]，將菌株L2-03、L3-01、L6-07、L7-01鑒定為玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae），菌株L1-02、L8-03、L10-01鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）[15]。

2.4 產(chǎn)酸能力分析

7株高產(chǎn)酸乳酸菌發(fā)酵過程中總酸產(chǎn)量及pH值的變化結(jié)果見圖4。

由圖4a可知，菌株L2-03、L3-01、L6-07、L7-01的產(chǎn)酸量在0～20 h內(nèi)增速基本維持不變，增幅明顯；菌株L1-02、L8-03、L10-01產(chǎn)酸量在14 h后增速逐漸放緩，曲線逐漸平穩(wěn)。最終在生長36 h后產(chǎn)酸曲線基本到達終點。其中，菌株L6-07產(chǎn)酸速度最快，產(chǎn)酸量最高，達25.69 g/L，產(chǎn)酸性能明顯高于其他菌株；菌株L3-01產(chǎn)酸量次之，達25.01g/L；菌株L1-02、L8-03產(chǎn)酸量較低，分別為17.51 g/L、17.15 g/L，產(chǎn)酸速率也較慢。其他研究者也從豆腐酸漿老湯中篩選出高產(chǎn)酸菌，如葉青等[16]從豆腐酸漿中篩選出高產(chǎn)酸的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），發(fā)酵48 h時，產(chǎn)酸量為27 g/L；王國良[17]分離出的高產(chǎn)酸菌發(fā)酵48 h后產(chǎn)酸量為24.9 g/L。本研究從陜西榆林豆腐酸漿老湯中篩選出的菌株L6-07發(fā)酵48 h后產(chǎn)酸量為25.69 g/L，相較于其他研究者所篩選出的產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸量處于較高水平。

圖4 發(fā)酵過程中7株高產(chǎn)酸乳酸菌的總酸產(chǎn)量（a）及pH值（b）變化Fig.4 Changes of total acid production (a) and pH (b) of 7 high yield acid-producing lactic acid bacteria during fermentation

由圖4b可知，在0～20 h內(nèi)，7株菌的pH值下降明顯；菌株L6-07的pH值下降最快，降至3.26，說明產(chǎn)酸能力最強；菌株L1-02的pH值下降最慢，降至4.01，說明產(chǎn)酸能力最弱；與圖4a結(jié)論相符。發(fā)酵液pH值在24 h后基本維持不變，說明乳酸菌在24 h后基本不再生長。

2.5 有機酸組成分析

因乳酸菌發(fā)酵24 h后產(chǎn)酸量基本不再增加，故采用HPLC法測定24 h后發(fā)酵液中有機酸的組成及含量，結(jié)果見表2。

表2 7株高產(chǎn)酸乳酸菌發(fā)酵液中有機酸分析Table 2 Analysis of organic acids in fermentation broth of 7 high yield acid-producing lactic acid bacteria g/L

由表2可知，從7株高產(chǎn)酸乳酸菌的發(fā)酵液中共檢測出7種有機酸，分別為丙酮酸、乳酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸、草酸、酒石酸，與胡欣欣[18]采用HPLC法測定黃漿水酸化過程中有機酸種類的結(jié)果基本一致。其中，乳酸與乙酸為菌株發(fā)酵產(chǎn)生的主要有機酸。7株菌株中，菌株L6-07的有機酸總量及乙酸生成量最高，分別為22.84 g/L、18.07 g/L；菌株L3-01的乳酸生成量最高，達7.32 g/L；除菌株L6-07發(fā)酵無法生成琥珀酸外，其余菌株在發(fā)酵過程中均能生成7種有機酸。

2.6 耐酸性能測定

因乳酸菌具有可以提高豆?jié){在人消化道生物可接受性等益生特性[19]，所以乳酸菌能否適應(yīng)胃腸道中的酸性環(huán)境十分重要。對7株高產(chǎn)酸乳酸菌的耐酸性進行測定，結(jié)果見圖5。

圖5 7株高產(chǎn)酸乳酸菌的耐酸性Fig.5 Acid tolerance of 7 high yield acid-producing lactic acid bacteria

由圖5可知，隨著培養(yǎng)基酸性增強，7株乳酸菌的生長均受到抑制。在pH值＜2.5的酸性條件下，7株乳酸菌菌體濃度均接近于0，幾乎停止生長。其中，菌株L6-07在pH 6.93（自然pH值）～4.5范圍內(nèi)OD600nm值下降比較緩慢，說明該菌株在pH值＞4.5的酸性條件下可以良好生長；并且在相同酸性條件下菌體濃度始終高于其他6株乳酸菌，耐酸性最強。菌株L1-02、L2-03、L3-01、L7-01、L8-03、L10-01在pH值＜5.5時菌體濃度大幅下降。當(dāng)pH值為2.5時，除了菌株L6-07之外，其他菌株的OD600nm值均為0，說明絕大部分乳酸菌不能夠在pH值為2.0與2.5的酸性條件下生長。培養(yǎng)基pH為4.0時，7株菌生長情況差異最為明顯，能夠體現(xiàn)7株菌的耐酸能力。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，培養(yǎng)基pH為4.0時菌株OD600nm值與菌株來源樣品pH值間的Pearson相關(guān)系數(shù)R2為0.481，呈中等程度相關(guān)，說明從酸性強的酸漿樣品中篩選出的乳酸菌耐酸能力相對更強。

2.7 耐鹽性能測定

在酸漿的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，發(fā)酵液離子強度可能會發(fā)生變化，并且工業(yè)化生產(chǎn)通常通過提升體系NaCl含量達到抑制雜菌生長的作用[20]，所以乳酸菌具有一定程度的耐鹽性是十分必要的。故對篩選出的7株高產(chǎn)酸菌株進行耐鹽性測定，結(jié)果見圖6。

圖6 7株高產(chǎn)酸乳酸菌的鹽耐受性Fig.6 Salt tolerance of 7 high yield acid-producing lactic acid bacteria

由圖6可知，隨著NaCl含量的升高，7株乳酸菌菌體濃度均呈下降趨勢，說明滲透壓會影響乳酸菌細胞內(nèi)水分及正常生理活動[21]。當(dāng)NaCl含量升高時，菌株L1-02菌體濃度下降最慢，并且在相同鹽濃度條件下，菌體濃度始終高于其他6株菌，說明環(huán)境滲透壓的提高對于該菌株的影響最小，甚至在NaCl含量為5%條件下該菌株的OD600nm值仍能維持在3.67，耐鹽性最強；菌株L3-01菌體濃度下降最快，受NaCl含量提升影響最為明顯，且在NaCl含量0～1%范圍內(nèi)該菌株菌體濃度下降顯著，在NaCl含量為5%時，OD600nm值僅為1.76，幾乎無法生長，耐鹽性最差。綜上所述，在相同滲透壓條件下，菌株L1-02比其余6株乳酸菌表現(xiàn)出更強的鹽耐受性，菌株L6-07次之，菌株L3-01耐鹽性最差。

3 結(jié)論

本實驗從采集于全國6大主要酸漿豆腐產(chǎn)地的7種豆腐酸漿老湯中共分離篩選得到7株高產(chǎn)酸乳酸菌，經(jīng)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株L2-03、L3-01、L6-07與L7-01為玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae），菌株L1-02、L8-03與L10-01為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。除菌株L6-07外，6株高產(chǎn)酸乳酸菌均能產(chǎn)草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、富馬酸及琥珀酸共7種有機酸，乙酸與乳酸為主要有機酸。其中，菌株L3-01乳酸含量最高，達7.32 g/L，菌株L6-07乙酸含量最高，為18.07 g/L。產(chǎn)酸能力方面，菌株L6-07發(fā)酵液pH下降速率最快，產(chǎn)酸量最高，達25.69 g/L，產(chǎn)酸能力最強；耐酸性方面，L6-07在pH 2.5的酸性條件下仍能保持生長，耐酸性最強；耐鹽性方面，菌株L1-02在5%NaCl條件下表現(xiàn)出較強的耐受性，耐鹽性最強，菌株L6-07次之。本研究結(jié)果在菌株特性方面為酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及優(yōu)質(zhì)菌種資源。