柳小波, 楊 梅, 宋 佳

(1. 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系, 武漢 430065；2. 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)教研室, 武漢 430065；3. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢精神衛(wèi)生中心中醫(yī)病區(qū), 武漢 430022 4. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢精神衛(wèi)生中心精神科, 武漢 430022)

藥物成癮是作用于中樞系統(tǒng)的藥物被反復(fù)大量使用后此類藥物產(chǎn)生的一種依賴狀態(tài)[1]。藥物成癮是一種慢性腦病, 長期服用會(huì)使其中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生某種病理改變, 具有一定的精神依賴性[2]。氯胺酮是一種常用的非巴比妥類麻醉藥，近年來研究[3]表明，服用氯胺酮后會(huì)使血壓升高、心跳加快，還可出現(xiàn)譫妄、幻覺等，使人成癮。因此，建立相應(yīng)的動(dòng)物模型，尋找保護(hù)藥物成癮所致腦組織損傷的藥物，具有重要意義。中醫(yī)藥可以在一定程度上緩解藥物成癮癥狀，但其對腦組織的保護(hù)作用及機(jī)制研究報(bào)道較少。腦心通膠囊成分包含黃芪、赤芍、丹參等，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)功效，主治氣滯血虛、脈絡(luò)瘀阻所致中風(fēng)[4]。有研究[5]顯示，腦心通膠囊可以改善苯巴比妥成癮大鼠的戒斷癥狀，保護(hù)腦細(xì)胞組織損傷，但對氯胺酮成癮大鼠的作用尚未見有報(bào)道。因此，本研究探索了腦心通膠囊對氯胺酮成癮大鼠腦細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，旨在分析腦心通膠囊保護(hù)腦組織損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要儀器、試劑

SPF級SD雄性大鼠60只, 體質(zhì)量250～280 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2017-0022]，飼養(yǎng)于本動(dòng)物中心屏障設(shè)施[SYXK(鄂)2017-0150]，自由攝食與飲水，12 h明暗交替，保持室溫恒定為25℃。腦心通膠囊購自陜西步長制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z20025001，以生理鹽水制成濃度為50 mg/mL的混懸液； l-四氫巴馬汀購自陜西小草科技有限公司,純度99%； 即刻早期基因(c-fos)免疫組織化學(xué)染色試劑盒，購自中國Boster生物工程有限公司； 兔抗大鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)多克隆抗體，均購自美國Santa Cruz公司； 辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG，購自美國Dako公司。

1.2 觀察大鼠行為學(xué)

實(shí)驗(yàn)前測試每只大鼠的條件位置偏愛(conditional position preference，CPP)[6]，CPP 箱由黑、灰、白3個(gè)箱體組成, 體積為 450mm×140 mm×160 mm，白箱靠右邊，黑箱靠左邊，灰箱在中間，將CPP箱的隔板打開讓3個(gè)箱體相通，記錄900 s內(nèi)小鼠在每個(gè)箱內(nèi)停留時(shí)間，計(jì)算CPP值(白箱停留時(shí)間減去黑箱停留時(shí)間的絕對值), 去除位置偏愛較大的大鼠(相差150 s以上)，將剩下大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、腦心通膠囊高、中、低劑量組和陽性對照組，各10只。每組內(nèi)分為白箱給藥(n=5)和黑箱給藥(n=5)，保證白箱給藥與黑箱給藥的CPP平均相差接近于零。分組后進(jìn)行為期8d的CPP訓(xùn)練，用隔板把CPP隔為3個(gè)室，分別為白色箱、灰色箱、黑色箱。訓(xùn)練時(shí)按0.1mL/10g劑量腹腔給藥，給完藥后放入指定的箱內(nèi)訓(xùn)練30 min，時(shí)間為早上8∶00和下午16∶00。模型組訓(xùn)練時(shí)在規(guī)定箱色內(nèi)給予氯胺酮(10 mg/kg)，相反箱色給予生理鹽水； 腦心通膠囊高中低劑量組在規(guī)定箱色內(nèi)給予氯胺酮(10 mg/kg)和腦心通膠囊(500 mg/kg、250 mg/kg、100 mg/kg), 相反箱色給予生理鹽水；陽性對照組在規(guī)定箱色內(nèi)給予氯胺酮(10 mg/kg)和l-四氫巴馬汀(20 mg/kg)，相反箱色給予生理鹽水； 對照組均給予等量的生理鹽水。對照組上下午都給予生理鹽水，模型組、腦心通膠囊組和陽性對照組第1日上午給予相應(yīng)藥物，下午給予生理鹽水，第2日上午給予生理鹽水，下午給予相應(yīng)藥物，依此類推。訓(xùn)練結(jié)束后第2日進(jìn)行CPP值測試，去掉隔板讓小鼠在3個(gè)箱體自由運(yùn)動(dòng)，測試小鼠在每個(gè)箱內(nèi)停留時(shí)間，計(jì)算CPP值。

1.3 動(dòng)物造模及給藥

模型組、腦心通膠囊組和陽性對照組大鼠制作氯胺酮成癮模型[7], 模型組、腦心通膠囊組和陽性對照組經(jīng)腹腔注射濃度為50 mg/mL的鹽酸氯胺酮注射液(10 mg/kg), 腦心通膠囊高、中、低劑量組灌胃濃度為50 mg/mL腦心通膠囊(500 mg/kg、250 mg/kg、100 mg/kg)，陽性對照組大鼠在腹腔注射氯胺酮前30 min，腹腔注射l-四氫巴馬汀(20 mg/kg)[5]； 對照組給予等量的生理鹽水, 1次/d,連續(xù)7 d，給藥后模型組大鼠表現(xiàn)出呼吸加快、活動(dòng)增多等興奮癥狀，且隨用藥次數(shù)增多，興奮癥狀(站立、跳躍、轉(zhuǎn)圈等)明顯增多，則為造模成功[7]。造模成功后處死大鼠，迅速斷頭取腦，無菌取大腦皮層額葉組織。

1.4 HE染色觀察腦組織病灶的病理變化

取大鼠大腦皮層額葉組織進(jìn)行石蠟切片制作，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定，進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明、包埋和切片，進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理變化，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野拍照。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測腦組織c-fos基因的表達(dá)

取制作好的切片，采用常規(guī)方法脫蠟至水，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%H2O2-CH3OH溶液37 ℃處理30 min, 封閉，37 ℃孵育30 min，加一抗4 ℃孵育過夜。再加辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG, 37 ℃孵育30 min, 顯色, 鏡下控制DAB顯色程度, 水洗后經(jīng)蘇木素復(fù)染, 二甲苯透明后采用中性樹膠封片。每張切片在同一條件下隨機(jī)取15個(gè)視野, 采用北航醫(yī)學(xué)圖像管理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.6 Western blotting測定腦組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)

無菌取大腦皮層額葉組織及腹側(cè)海馬組織約50 mg，勻漿，用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液溶解, 使用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將50 μg提取的總蛋白樣品經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉后，分別加入一抗抗體(1∶1 000)和β-actin蛋白單抗(1∶300), 4 ℃下孵育過夜，最后加二抗37 ℃下孵育2h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)監(jiān)測。采用Photoshop圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以x-±s表示，對計(jì)量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，如果各組均滿足正態(tài)性且兩組間方差齊，采用單因素方差分析比較組間差異性； 若以上條件不滿足則考慮非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察大鼠腦組織細(xì)胞的形態(tài)變化

對照組HE染色結(jié)果顯示，大鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見細(xì)胞液化壞死等病灶(圖1A)； 模型組HE染色結(jié)果顯示，胞質(zhì)濃縮，核固縮，細(xì)胞體積減小(圖1B)； 腦心通膠囊低劑量組HE染色結(jié)果顯示，胞質(zhì)濃縮，核固縮，與模型組無明顯差異(圖1C)； 腦心通膠囊組中劑量組HE染色結(jié)果顯示，腦組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相對較完整，病變程度明顯低于模型組(圖1D)； 腦心通膠囊組高劑量組HE染色結(jié)果顯示，腦組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相對較完整，病變程度明顯低于模型組(圖1D)； 陽性對照組HE染色結(jié)果顯示，腦組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相對較完整，病變程度明顯低于模型組，與腦心通膠囊高劑量組無明顯差異(圖1D)。

2.2 腦心通膠囊對氯胺酮成癮大鼠條件位置偏愛的影響

與對照組相比，模型組、腦心通膠囊高、中、低劑量組和陽性對照組大鼠CPP值明顯升高(P＜0.05)； 與模型組相比，腦心通膠囊高、中劑量組和陽性對照組大鼠CPP值明顯降低(P＜0.05),且隨著劑量升高，作用越明顯(P＜0.05)(表1)。

表1 腦心通膠囊對氯胺酮成癮大鼠條件位置偏愛的影響

2.3 腦心通膠囊對氯胺酮成癮大鼠腦組織中c-fos表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組、腦心通膠囊高、中、低劑量組和陽性對照組大鼠腦組織c-fos表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)； 與模型組比較，腦心通膠囊高、中劑量組和陽性對照組大鼠c-fos表達(dá)量明顯降低(P＜0.05), 且隨著劑量升高, 作用越明顯(P＜0.05)(圖 2、表 2)。

2.4 腦心通膠囊對氯胺酮成癮大鼠腦組織凋亡蛋白的影響

與對照組比較, 模型組、腦心通膠囊高、中、低劑量組和陽性對照組大鼠腦組織Caspase-3、Bax表達(dá)量明顯升高(P＜0.05), Bcl-2表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)； 與模型組相比, 腦心通膠囊高、中劑量組和陽性對照組大鼠Caspase-3、Bax表達(dá)量明顯下降(P＜0.05), Bcl-2表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)，且隨著劑量升高，作用越明顯(P＜0.05)(表3)。

3 討論

圖1 大鼠腦組織細(xì)胞的形態(tài)變化觀察 (HE×400倍)

表2 腦心通膠囊對氯胺酮成癮大鼠腦組織c-fos基因表達(dá)的影響

氯胺酮是一種分離麻醉藥物，是苯環(huán)己哌啶的衍生物，可抑制大腦聯(lián)絡(luò)徑路和丘腦新皮層系統(tǒng)，長期反復(fù)服用會(huì)出現(xiàn)致幻作用與成癮性[8]。l-四氫巴馬汀是是中藥延胡索乙的左旋物，近年來研究[9]顯示，l-四氫巴馬汀可以保護(hù)氯胺酮依賴大鼠的神經(jīng)元損傷。因此，本研究采用氯胺酮建立了相應(yīng)的動(dòng)物模型，以l-四氫巴馬汀為陽性對照，來分析氯胺酮成癮對腦細(xì)胞的損傷作用。本研究中，氯胺酮成癮大鼠的CPP明顯高于正常大鼠，腦組織細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病理變化。CPP是一種常用的評價(jià)藥物或環(huán)境對精神依賴性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，運(yùn)用成癮藥物來改變實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自主行為，以此評估藥物的成癮性，提示氯胺酮可以改變大鼠的自主行為，使大鼠成癮[10]。臨床觀察表明[11]，長期使用氯胺酮的病人會(huì)出現(xiàn)幻覺、譫妄、惡夢等類似精神分裂癥的精神癥狀，本研究結(jié)果與其基本一致，提示氯胺酮可以使大鼠產(chǎn)生成癮現(xiàn)象。腦心通膠囊是一種中藥制劑, 可用于治療氣虛血滯、脈絡(luò)瘀阻所致中風(fēng), 臨床表現(xiàn)為半身不遂、口眼歪斜、胸悶、腦梗塞等癥候者[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的腦心通膠囊可明顯降低氯胺酮成癮大鼠的CPP，減輕腦組織細(xì)胞的病理變化，且隨著劑量升高, 作用逐漸增強(qiáng)。王喬悅等[13]的研究顯示，腦心通膠囊可改善神經(jīng)功能, 保護(hù)腦組織損傷, 本研究結(jié)果與其基本一致, 提示腦心通膠囊可以呈濃度依賴性的顯著降低氯胺酮成癮大鼠的腦組織損傷, 改善神經(jīng)癥狀。

表3 腦心通膠囊對氯胺酮成癮大鼠腦組織凋亡蛋白的影響

本研究中, 中、高劑量腦心通膠囊可明顯降低氯胺酮成癮大鼠過高的c-fos基因的表達(dá)。c-fos原癌基因是即刻早期基因(IEG)的一種，正常生理情況下，c-fos基因在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)水平極低，一旦受到各種外界刺激，c-fos基因出現(xiàn)快速大量表達(dá)，發(fā)揮其細(xì)胞核內(nèi)第三信使的作用，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化和損傷修復(fù)[14]。研究[15]顯示，c-fos基因的表達(dá)與神經(jīng)損傷程度密切相關(guān)，可作為神經(jīng)元接受傷害性刺激激活的標(biāo)志，傳遞傷害性刺激信息，提示腦心通膠囊可通過調(diào)節(jié)機(jī)體的信號通路，降低c-fos基因的表達(dá)，保護(hù)氯胺酮成癮大鼠的腦組織損傷。朱華強(qiáng)等[16]的研究表明，藥物濫用導(dǎo)致的成癮是一種慢性腦損傷，可引起腦組織細(xì)胞損傷，其分子機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡信號通路主要包括線粒體介導(dǎo)的內(nèi)部細(xì)胞凋亡信號通路和死亡受體介導(dǎo)的外部細(xì)胞凋亡信號通路。Bcl-2/Bax蛋白可以調(diào)控線粒體膜通透性，釋放凋亡激活因子來激活凋亡執(zhí)行分子Caspase，活化的Caspase可以降解細(xì)胞內(nèi)的多種重要蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。本研究中，中、高劑量腦心通膠囊可明顯下調(diào)氯胺酮成癮大鼠Caspase-3、Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，與王海燕等[18]的研究基本一致，提示腦心通膠囊可能通過參與調(diào)節(jié)機(jī)體的凋亡機(jī)制，保護(hù)腦組織損傷。

綜上所述，腦心通膠囊可呈濃度依賴性的下調(diào)氯胺酮成癮大鼠Caspase-3、Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，降低c-fos基因的表達(dá)，保護(hù)腦組織損傷，改善神經(jīng)癥狀。本研究為臨床上腦心通膠囊改善氯胺酮成癮的腦組織損傷提供了一定的理論依據(jù)，但腦心通膠囊保護(hù)腦組織損傷的具體機(jī)制目前尚不清楚，有待與進(jìn)一步研究。