陳 超, 叢 薇, 楊文靜, 崔淑芳

(海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室, 上海 200433)

裸鼴鼠對(duì)癌癥具有天然抗性，無論是野生的裸鼴鼠還是人工飼養(yǎng)的裸鼴鼠，其腫瘤發(fā)生率都極低，僅極少數(shù)20歲以上的裸鼴鼠發(fā)生自發(fā)性腫瘤[1]。裸鼴鼠對(duì)癌癥的超強(qiáng)免疫力，極有可能為人類攻克癌癥這一醫(yī)學(xué)難題提供重要線索。此外，其抗腫瘤機(jī)制備受關(guān)注，甚至一度成為頂尖學(xué)術(shù)雜志《Nature》的封面主角[2]。因此，對(duì)裸鼴鼠生物學(xué)特性的研究受到廣泛關(guān)注，其抗腫瘤等特性有望為相關(guān)疾病的研究和藥物研發(fā)提供新的動(dòng)物模型材料和研究策略[3]。目前，腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的第一殺手[4]，而肺癌是發(fā)病率、病死率居首的惡性腫瘤，患者總的5年生存率不到15%，在我國(guó)則更低[5]。烏拉坦(urethane)又名氨基甲酸乙酯，常用于肺癌疾病動(dòng)物模型的建立，借助烏拉坦對(duì)肺癌的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究及對(duì)肺癌治療藥物篩選已成為目前非常重要的研究手段。世界衛(wèi)生組織下屬國(guó)際癌癥研究中心于2007年將其劃分為2A級(jí)致癌物。亞胺基偶氮甲苯(OAAT)被廣泛應(yīng)用于染料制造及醫(yī)藥行業(yè)，其中的苯環(huán)與胺基的氮原子相連接，分子比較活躍，進(jìn)入人體后會(huì)破壞正常細(xì)胞中DNA，引起人體病變[6]。同時(shí)，OAAT在還原條件下不穩(wěn)定，會(huì)進(jìn)一步分解成鄰甲苯胺，鄰甲苯胺具有高毒性和致癌性，是環(huán)境污染的重要物質(zhì)[7]。本研究使用以上2種常用的化學(xué)致癌劑作為腫瘤誘導(dǎo)劑，分別對(duì)裸鼴鼠和常用實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行致病誘導(dǎo)，觀察2組動(dòng)物的生存及病理變化，可以直觀、系統(tǒng)地觀察裸鼴鼠抗化學(xué)藥物致癌的現(xiàn)象，為進(jìn)一步研究其抗癌機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

52周齡普通級(jí)封閉群雄性裸鼴鼠, 由本實(shí)驗(yàn)室自行繁殖飼養(yǎng)(第6世代)； 8周齡SPF級(jí)雄性ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠, 購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2013-016]。動(dòng)物均飼養(yǎng)在屏障設(shè)施[SYXK(滬)2017-0004]。

1.2 主要儀器與試劑

光學(xué)顯微鏡購自德國(guó)Leica公司； 全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司； 烏拉坦、OAAT均購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司,通用型組織固定液購自武漢谷歌生物科技有限公司,蘇木精、伊紅染液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 烏拉坦對(duì)裸鼴鼠的影響 烏拉坦誘導(dǎo)裸鼴鼠組、ICR小鼠組、C57BL/6J小鼠組和BALB/c小鼠組每組各20只，均為雄性。 參照烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌模型制備方法，配制10%烏拉坦生理鹽水溶液(10 g/100 mL)[8]。每只動(dòng)物每次按每克體質(zhì)量0.01 mL烏拉坦溶液的劑量進(jìn)行腹腔注射，每周注射2次，持續(xù)3個(gè)月。每月每組處死4只動(dòng)物觀察腫瘤發(fā)生情況，每月對(duì)動(dòng)物的體質(zhì)量進(jìn)行記錄，停藥后每月進(jìn)行外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物若發(fā)生死亡則對(duì)其進(jìn)行解剖，觀察肺部情況，并計(jì)入每月處死動(dòng)物數(shù)中。誘導(dǎo)結(jié)束后2個(gè)月，采用安死術(shù)處死所有未死亡動(dòng)物，進(jìn)行解剖并觀察肺部情況。

1.3.2 OAAT對(duì)裸鼴鼠的影響 OAAT誘導(dǎo)裸鼴鼠組、ICR小鼠組、C57BL/6J小鼠組和BALB/c小鼠組每組各10只，均為雄性。將1% OAAT溶液分別涂抹于裸鼴鼠和小鼠兩肩胛間皮膚上(每周對(duì)涂藥部位進(jìn)行一次剃毛)，隔日1次，每次2～3滴。3個(gè)月后采用安死術(shù)處死動(dòng)物，觀察胸腺、脾臟、肝臟、腸系膜淋巴結(jié)、骨髓等組織臟器變化情況，并進(jìn)行組織切片染色觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 烏拉坦對(duì)裸鼴鼠的影響

小鼠在烏拉坦誘導(dǎo)3個(gè)月后開始發(fā)生肺腫瘤，誘導(dǎo)結(jié)束后2個(gè)月肺部腫瘤平均發(fā)生率大于50%，而裸鼴鼠在烏拉坦誘導(dǎo)結(jié)束后2個(gè)月仍然未見腫瘤發(fā)生(圖1、表1)； 小鼠平均體質(zhì)量總體呈下降趨勢(shì)，而裸鼴鼠體質(zhì)量無顯著下降(表2)；小鼠外周血中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞等白細(xì)胞的含量顯著下降，而裸鼴鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著變化(表3)。

表1 烏拉坦誘導(dǎo)后動(dòng)物成瘤率

2.2 OAAT對(duì)裸鼴鼠的影響

OAAT誘導(dǎo)3個(gè)月，病理檢查見小鼠肝竇中橢圓細(xì)胞廣泛增生，肝細(xì)胞廣泛腫脹，部分肝細(xì)胞發(fā)生點(diǎn)狀脂肪變性，細(xì)胞內(nèi)充滿小而密的脂滴。胸腺組織中散布有多量吞噬有藍(lán)色顆粒狀細(xì)胞碎片的巨噬細(xì)胞，血管輕度擴(kuò)張，且充滿紅細(xì)胞。紅髓脾竇中大量含鐵血黃素沉積，白髓散布較多吞噬有細(xì)胞碎片和含鐵血黃素的巨噬細(xì)胞。腸黏膜絨毛固有層有少量漿細(xì)胞浸潤(rùn)。骨髓腔靠近關(guān)節(jié)位置，造血組織減少、缺失，被脂肪組織取代。裸鼴鼠各個(gè)器官組織病理切片未見明顯病變，其中裸鼴鼠的胸腺已基本退化，故病理圖中無裸鼴鼠胸腺染色圖(圖2)。

表2 烏拉坦誘導(dǎo)后動(dòng)物體質(zhì)量 g

表3 烏拉坦誘導(dǎo)后動(dòng)物白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) ×109/L

圖1 烏拉坦誘導(dǎo)結(jié)束后2個(gè)月不同動(dòng)物肺臟大體觀察

圖2 OAAT處理動(dòng)物組織病理學(xué)觀察(HE×400)

3 討論

裸鼴鼠本身具有較強(qiáng)的抗腫瘤特性[9]，以裸鼴鼠為模型研究其抗腫瘤機(jī)制的報(bào)道屢見不鮮。研究[10]發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠的成纖維細(xì)胞對(duì)接觸抑制非常敏感，這種細(xì)胞間“早期接觸抑制”能力可有效防止腫瘤細(xì)胞的過量增殖。進(jìn)一步研究[2]發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠細(xì)胞和組織產(chǎn)生的大量高分子量透明質(zhì)酸在參與細(xì)胞間接觸抑制過程中起到關(guān)鍵作用。同時(shí)，裸鼴鼠細(xì)胞對(duì)山中因子(Yamanaka factors)重編程具有很高的抵抗力，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPCS)克隆率極低，這種現(xiàn)象可以通過失活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb蛋白)來逆轉(zhuǎn)，并且裸鼴鼠IPCS體內(nèi)畸胎瘤形成率比小鼠低得多，經(jīng)組蛋白比較，發(fā)現(xiàn)裸鼴鼠染色質(zhì)在啟動(dòng)子區(qū)域具有更緊密得結(jié)構(gòu)，裸鼴鼠細(xì)胞具有更穩(wěn)定的表觀基因組[11]。另外，還有文章[12,13]報(bào)道裸鼴鼠特異性單氨基酸變化、高保真蛋白質(zhì)合成、活躍的抗氧化反應(yīng)途徑、通過自噬和蛋白質(zhì)酶體更活躍的蛋白水解均可能有助于裸鼴鼠抗癌性。這些研究報(bào)道說明以裸鼴鼠為模型研究其抗腫瘤機(jī)制，將為腫瘤的防治提供重要借鑒。本研究通過對(duì)裸鼴鼠和常用實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行化學(xué)致癌因素誘導(dǎo)的研究，發(fā)現(xiàn)裸鼴鼠對(duì)于致癌化學(xué)因子具有天然的抗性，其生活狀態(tài)、生化指標(biāo)、組織器官的形態(tài)與功能都未因外部化學(xué)藥物刺激而發(fā)生明顯改變。雖然關(guān)于裸鼴鼠的類似研究已有報(bào)道，但使用的均是模擬野生環(huán)境和真社會(huì)性生活飼養(yǎng)繁育的裸鼴鼠。本實(shí)驗(yàn)使用的裸鼴鼠為通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)后生產(chǎn)的裸鼴鼠，本研究結(jié)果證明這些裸鼴鼠具有與野生裸鼴鼠同樣天然的、良好的抗腫瘤特性。

同時(shí)，免疫系統(tǒng)與機(jī)體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系[14]。在本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)裸鼴鼠固有免疫反應(yīng)的研究中，發(fā)現(xiàn)其以巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答為主[15]。而通過單獨(dú)或聯(lián)合阻斷整合素相關(guān)蛋白(CD47)分子，可以釋放巨噬細(xì)胞的抗腫瘤能力[16-19]。這可能是裸鼴鼠對(duì)化學(xué)致癌因素產(chǎn)生抗性的原因之一。