賈歡歡, 曾業(yè)文, 羅 挺, 龔寶勇, 麥冬梅, 潘迎春, 趙維波

(廣東省實驗動物監(jiān)測所, 廣東省實驗動物重點實驗室, 廣州 510663)

墊料是實驗動物長期接觸的物質(zhì)，可通過皮膚、呼吸道、消化道等途徑進入動物體內(nèi)，墊料質(zhì)量的優(yōu)劣與實驗動物質(zhì)量密切相關(guān)。近年來，北京、江蘇及河北相繼出臺了關(guān)于實驗動物墊料的地方標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)容僅涵蓋了性狀、水分、微生物、農(nóng)殘及部分重金屬，如砷、鉛、鎘、汞。由于研究數(shù)據(jù)的缺乏, 導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)中要求控制的重金屬指標(biāo)相對較少。目前研究[1-4]表明，金屬鉻的過量攝入會導(dǎo)致機體出現(xiàn)肝腎毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性及致癌性。我們前期對廣東省10家單位的墊料進行了抽檢[5]，發(fā)現(xiàn)墊料中鉻的含量在1.2～21.4 mg/kg[81]。鑒于鉻可能對實驗動物產(chǎn)生一定的毒性反應(yīng)，本研究擬通過配制含不同濃度六價鉻墊料，以BALB/c裸小鼠和KM小鼠為研究對象，分析含鉻墊料對小鼠血液學(xué)及臟器的毒性反應(yīng)，以期確定其安全濃度，推進實驗動物墊料標(biāo)準(zhǔn)化的建立。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3～4 周齡 SPF 級 BALB/c 裸小鼠 48 只, 雌雄各半, 體質(zhì)量15～17 g, 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011]； 3～4 周齡SPF級KM小鼠48只, 雌雄各半, 體質(zhì)量15～17 g,購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[SCXK(粵)2018-0002]； 動物飼養(yǎng)于廣東省實驗動物監(jiān)測所屏障設(shè)施[SYXK(粵)2016-0122]，本試驗的動物使用經(jīng)廣東省實驗動物監(jiān)測所IACUC委員會批準(zhǔn)(IACUC2017031)，試驗過程接受IACUC的監(jiān)督檢查。動物飼養(yǎng)于IVC籠具(長×寬×高為35 cm×14.5 cm×14 cm)，每籠6只，每周更換1次墊料。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20.0～26.0℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h明暗交替。

1.2 實驗用墊料

玉米芯墊料購自沈陽新鴻騰生物科技有限公司。對墊料中的微生物、重金屬(砷、鉛、鎘、汞、鉻)及農(nóng)藥殘留進行了檢測, 結(jié)果符合河北省(DB13/T 2547-2017)和江蘇省(DB32/T 2129-2012)關(guān)于墊料的地方標(biāo)準(zhǔn)，其中鉛、鎘、汞未檢出，砷為(0.13±0.01) mg/kg，低于上述地方標(biāo)準(zhǔn)要求，鉻含量為(2.30±1.12) mg/kg。

1.3 實驗試劑和儀器

重鉻酸鉀購自天津市大茂化學(xué)試劑廠(AR，規(guī)格500 g/瓶，批號P7778-50-9)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒均購自廣州科方。血細胞分析儀(Sysmex XT-2000iv, 日本)，血生化分析儀(日立7020, 日本)，EG1150H+C石蠟包埋機、RM2255輪轉(zhuǎn)切片機、DM2500生物顯微鏡均購自德國Leica。

1.4 方法

1.4.1 含鉻墊料的制備 配制不同濃度的重鉻酸鉀水溶液，1 kg墊料浸泡于3 L不同濃度的重鉻酸鉀溶液中, 室溫條件下浸泡24h, 過濾后自然晾干, 經(jīng)高壓滅菌后提供動物使用, 于每次更換墊料前一天制備。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13088-2006/3中火焰原子吸收光譜法進行墊料中鉻含量的測定。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 mg/100 mL、15 mg/100 mL和60 mg/100 mL重鉻酸鉀溶液浸泡空白墊料24 h，高壓滅菌處理后墊料中鉻含量分別為(15.50±0.71) mg/kg、(71.50 ±3.54) mg/kg 和(347.00±35.36) mg/kg。

1.4.2 分組 48只BALB/c裸小鼠及48只KM小鼠分別根據(jù)體重隨機分為4組，每組動物12只，雌雄各半。4組分別為對照組[墊料中含鉻2.30±1.12 mg/kg]、低劑量組[墊料中含鉻15.50±0.71 mg/kg]、中劑量組[墊料中含鉻71.50±3.54 mg/kg]、高劑量組[墊料中含鉻347.00±35.36 mg/kg]，2種小鼠均分別飼養(yǎng)于不同鉻含量的墊料中15周，每周更換1次墊料。

1.4.3 動物一般觀察 每日觀察動物的一般狀態(tài),包括行為活動、被毛、呼吸、飲食、反應(yīng)等。

1.4.4 動物血常規(guī)檢查 試驗結(jié)束前1 d動物禁食不禁水過夜，動物麻醉后眼眶采血，EDTA2Na抗凝采血，采集后立即上下顛倒混勻，1 h內(nèi)上機測定，使用小鼠血常規(guī)模塊進行分析。

1.4.5 血液生化檢測 試驗結(jié)束時，動物眼眶采血，血液不抗凝，在室溫下放置 30～50 min 后，3 500 r/min離心10 min，取血清，生化分析儀檢測生化相關(guān)指標(biāo)，包括ALT、ALP、Crea、Urea、TBIL、DBIL、ALB、Urea、TCHO、TG、HDL-C、LDL-C等。

1.4.6 大體解剖觀察 所有動物都經(jīng)大體解剖檢查，記錄每只動物的大體病理學(xué)變化。

1.4.7 臟器系數(shù)檢測 試驗結(jié)束時，取心、肝、脾、肺、腎、腦、卵巢、子宮等臟器稱重，并計算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器重量/動物體質(zhì)量×100%。

1.4.8 病理學(xué)檢查 試驗結(jié)束時，取大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺殘基、腹側(cè)皮膚、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸組織等組織進行病理學(xué)檢查。臟器固定于體積分數(shù)10 %甲醛固定液，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片等程序行HE染色，鏡檢。

1.4.9 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件，實驗結(jié)果采用±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般觀察

BALB/c裸小鼠及KM小鼠分別飼養(yǎng)于不同含量鉻墊料中15周，均未出現(xiàn)動物死亡，且試驗期間動物精神狀態(tài)良好，體格健壯，飲食及反應(yīng)均正常。

2.2 動物血常規(guī)

BALB/c裸小鼠及KM小鼠分別飼養(yǎng)于不同鉻含量墊料中15周，與對照組比較，2種小鼠外周血血常規(guī)各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，且各劑量組間比較差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表 1，2)。

2.3 動物血液生化

與對照組比較，低、中、高劑量組血清中ALT及 BUN水平均顯著升高(P＜0.05), 中、高劑量組血清中ALP、Crea水平均顯著升高(P＜0.05),低、高劑量組血清中TG水平顯著下降(P＜0.05)，其他血液生化指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)； KM小鼠飼養(yǎng)于不同鉻含量墊料中15周，與對照組比較, 各劑量組血液生化指標(biāo)差異無顯著性(P＞0.05),各指標(biāo)低、中、高劑量組間比較差異無顯著性(P＞0.05)(表 3，表 4)。

表1 不同鉻含量墊料中飼養(yǎng)15周BALB/c裸小鼠血常規(guī)指標(biāo)

表2 不同鉻含量墊料中飼養(yǎng)15周KM小鼠血常規(guī)指標(biāo)

表3 不同鉻含量墊料中飼養(yǎng)15周BALB/c裸小鼠血生化指標(biāo)

表4 不同鉻含量墊料中飼養(yǎng)15周KM小鼠血生化指標(biāo)

2.4 大體解剖

BALB/c裸小鼠及KM小鼠飼養(yǎng)于不同鉻含量墊料中15周，各劑量組小鼠解剖后，大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺殘基、腹側(cè)皮膚、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸組織與對照組比較，其臟器位置、大小、形狀、硬度、外觀顏色未見明顯異常改變，均未見明顯滲出、增生、水腫、萎縮等病變。

2.5 動物臟器系數(shù)

BALB/c裸小鼠及KM小鼠飼養(yǎng)于不同鉻含量墊料中15周，2種小鼠各組間不同臟器系數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表5，6)。

2.6 組織病理學(xué)

組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，BALB/c裸小鼠及KM小鼠經(jīng)不同鉻含量墊料飼養(yǎng)15周，2種小鼠肝、腎、睪丸及卵巢均表現(xiàn)出不同程度的病理學(xué)改變。大腦、小腦、腦干、脊髓、心臟、脾臟、肺臟、胸腺殘基、腹側(cè)皮膚、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、附睪、子宮等鏡下結(jié)構(gòu)正常，未見明顯的病理學(xué)改變。

BALB/c裸小鼠病理學(xué)改變： 對照組動物肝、腎、睪丸及卵巢病理學(xué)檢查未見異常； 低、中、高劑量組部分動物出現(xiàn)肝臟局灶性炎細胞浸潤(低劑量組3例, 中劑量組4例, 高劑量組8例), 肝細胞水腫(低劑量組4例, 中劑量組8例, 高劑量組10例),腎臟炎細胞浸潤(低劑量組5例, 中劑量組7例, 高劑量組10例), 睪丸曲細精管萎縮(低劑量組3例,中劑量組3例, 高劑量組3例), 黃體減少(低劑量組1例, 中劑量組2例, 高劑量組4例)(圖1)。

表5 不同鉻含量墊料中飼養(yǎng)15周BALB/c裸小鼠臟器系數(shù)

表6 不同鉻含量墊料中飼養(yǎng)15周KM小鼠臟器系數(shù)

圖1 不同含鉻墊料飼養(yǎng)15周BALB/c裸小鼠部分臟器病理變化

KM小鼠病理學(xué)改變： 對照組動物肝、腎、睪丸及卵巢病理學(xué)檢查未見異常； 低、中、高劑量組部分動物出現(xiàn)肝臟局灶性肝細胞水腫(低劑量組2例，中劑量組2例，高劑量組4例)，腎臟腎小管透明管型(對照組3例, 低劑量組4例, 中劑量組1例，高劑量組1例)應(yīng)為自發(fā)性病變, 腎臟炎細胞浸潤(低劑量組4例, 中劑量組11例, 高劑量組7例), 睪丸曲細精管萎縮(低劑量組2例, 中劑量組2例, 高劑量組1例), 卵巢中、高劑量組黃體數(shù)量減少(中劑量組2例, 高劑量組3例)(圖2)。

圖2 不同含鉻墊料飼養(yǎng)15周KM小鼠部分臟器病理學(xué)觀察

3 討論

鉻是機體不可或缺的微量元素，鉻的缺乏會引起糖、脂、核酸及蛋白質(zhì)代謝的紊亂[6-9], 而過量鉻的攝入可導(dǎo)致肝腎毒性、免疫毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性和致癌性[1-4]。自然界鉻以零價、三價和六價的形式存在, 目前研究[4]表明三價鉻不易進入細胞內(nèi)因而毒性較小，六價鉻易于進入細胞內(nèi)且在代謝的過程中產(chǎn)生毒性較大的中間產(chǎn)物，因而六價鉻具有較強的生物毒性，因此本研究選擇重鉻酸鉀(六價鉻)浸泡墊料。

本文研究結(jié)果顯示，同含鉻墊料中飼養(yǎng)BALB/c裸小鼠15周，可導(dǎo)致小鼠肝功能指標(biāo)ALT和ALP升高，TG下降，其中ALT和ALP反映炎癥的活動程度，是診斷中毒性肝炎及肝細胞損傷的的重要指標(biāo), 而TG是肝功能下降的特異性指標(biāo)。此外, BALB/c裸小鼠各劑量組BUN及Crea水平也有不同程度的升高，這2個指標(biāo)直接反映腎臟炎癥。病理檢查發(fā)現(xiàn)，BALB/c裸小鼠各劑量組出現(xiàn)肝腎炎細胞浸潤、肝細胞水腫等改變，病理學(xué)改變與血生化指標(biāo)的變化相一致。付婧等[10]連續(xù)灌胃小鼠1個月重鉻酸鉀溶液后小鼠活動減少，精神狀態(tài)變差，病理檢查出現(xiàn)明顯的肝腎損傷?？紤c君等[11]研究表明雌性Wistar大鼠經(jīng)口灌胃攝入31.6 mg/kg劑量和雄性攝入21.5 mg/kg劑量的重鉻酸鉀90 d均可導(dǎo)致外周血ALT、Crea、BUN升高，肝竇擴張、淤血及肝細胞壞死等病理改變。此外不同劑量組BALB/c裸小鼠出現(xiàn)睪丸曲細精管萎縮、卵巢黃體減少等病理學(xué)改變，此結(jié)果與文獻報道一致，王亞東等[12]研究表明六價鉻對雄性動物性腺、精子形態(tài)、性功能和生育能力均有一定的影響，Pereira 等[13]研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射六價鉻可導(dǎo)致大鼠睪丸、精囊及包皮腺重量明顯下降。李紫等[14]研究認為六價鉻可導(dǎo)致雄性動物睪丸組織器質(zhì)性損害，嚴重影響小鼠睪丸的正常發(fā)育。

應(yīng)用不同含量的鉻墊料飼養(yǎng)KM小鼠15周，血常規(guī)、血生化等指標(biāo)未見明顯改變，而病理學(xué)檢查表現(xiàn)出與BALB/c裸小鼠相似的改變，如肝細胞水腫、腎臟炎性細胞浸潤、睪丸曲細精管萎縮、卵巢黃體減少等，但出現(xiàn)病變的動物數(shù)量低于BALB/c裸小鼠。與KM小鼠相比，BALB/c裸小鼠無毛，皮膚可直接接觸墊料，導(dǎo)致體內(nèi)攝入的鉻含量高于KM小鼠，且KM小鼠免疫能力明顯優(yōu)于BALB/c裸小鼠，這些原因可能是導(dǎo)致BALB/c裸小鼠與KM小鼠毒性反應(yīng)程度不同的原因。此外KM小鼠包括對照組在內(nèi)的動物均出現(xiàn)了腎臟腎小管透明管型，考慮為其他因素導(dǎo)致的病理改變。

綜上所述，墊料中六價鉻含量達到(15.50±0.71) mg/kg及以上時可導(dǎo)致BALB/c裸小鼠及KM小鼠出現(xiàn)不同程度的肝、腎、睪丸及卵巢的毒性, 這將有助于推進實驗動物墊料的標(biāo)準(zhǔn)化建立。