王元元, 鄧衛(wèi)平, 李曉強, 彭吉霞

(1. 十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗部)；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院； 十堰442000)

腦卒中后抑郁 (post-stroke depression，PSD)作為一種繼發(fā)于腦卒中后的心理障礙性疾病, 具有發(fā)生率、致殘率和病死率高的特點，患者的核心癥狀表現(xiàn)為疲勞、淡漠、興趣減退、情緒低落、反應(yīng)遲鈍及睡眠障礙等為主的心境障礙癥狀[1]。研究[2]表明，腦卒中病灶以丘腦、海馬損傷為主，顳葉、額葉及基底節(jié)受損次之。對其治療過程常伴有不同程度的腦缺血再灌注損傷，其中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)表達與腦缺血再灌注損傷后應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，其水平與PSD有一定的相關(guān)性[3]。另有研究[4]表明，PSD的發(fā)生與腦海馬組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)信號通路活性有關(guān)。NF-κB信號通路在腦缺血神經(jīng)損傷可塑性方面發(fā)揮著重要的作用，抑制NF-κB活性可減輕缺血性腦卒中大鼠抑郁癥狀[5]。也有研究[6]表明, 抑郁的嚴(yán)重程度與腦區(qū)的腦電振蕩電位相關(guān), 海馬CA1區(qū)自發(fā)性動作電位 (AP)和群峰電位(PS)電位降低, PSD抑郁癥狀明顯好轉(zhuǎn)。蒲榮等[7]研究表明, 針刺可顯著降低慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠前額葉皮層NF-κB。由此可見，NF-κB信號通路的活性及腦電振蕩電位與抑郁的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，抑制NF-κB信號通路的活性、降低AP和PS電位、糾正腦海馬CA1區(qū)異常電位可能有利于PSD的康復(fù)。基于這一設(shè)想，本研究以PSD模型大鼠為研究對象，研究黃芪多糖對NF-κB信號通路及海馬CA1區(qū)AP和PS電位的影響，分析其對PSD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及抑郁樣行為的影響，為開發(fā)新藥用于臨床治療PSD提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量(180±10) g, 大鼠由十堰市太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所提供[SCXK(鄂)2018-001]，在中心標(biāo)準(zhǔn)實驗室進行相關(guān)實驗 [SYXK(鄂)2018-001]，隨機均分為假手術(shù)組、抑郁模型組、黃芪多糖低劑量組(200 mg/kg)和高劑量組(400 mg/kg)，每組12只。在實驗時，遵守3 R原則，在造模和后期干預(yù)性治療期間給予動物人道關(guān)懷，使之充分享受動物福利。實驗期間自由飲水和進食，自然光照、保持墊料干燥、動物房恒溫(22～24 ℃)恒濕(50%～75%)。

1.2 主要藥品及設(shè)備

ZH-OM型O迷宮(Zero迷宮)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)； Anymaze分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)； 黃芪多糖標(biāo)準(zhǔn)品購自北京索萊寶科技有限公司； 麻醉用水合氯醛購自武漢博菜特化工有限公司； PP-83型玻璃電極拉制儀購自日本Narishige 公司； Bio-Rad酶聯(lián)檢測儀購自美國Bio-Rad公司； 振動切片機和膜片鉗放大器均購自英國Campden公司； NF-κB和PPAR-γ試劑盒購自上海超研生物科技有限公司(批號： H1107、H1093)； 白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均由上海信裕生物科技有限公司提供(批號： H5034、H5037)。

1.3 PSD模型構(gòu)建方法及分組

實驗前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周, 術(shù)前禁食不禁水。除假手術(shù)組12只外, 抑郁模型組、黃芪多糖低劑量組和高劑量組共36只大鼠，用水合氯醛腹腔注射麻醉, 腹部向上仰位固定大鼠, 剃去頸部被毛, 皮膚用碘伏消毒后鋪無菌巾, 切開皮膚, 用玻璃分針分離出左側(cè)頸總動脈和頸內(nèi)動脈，從頸總動脈(CCA)分叉處插入4-0尼龍線，經(jīng)頸內(nèi)動脈(ICA)進入大腦中動脈(MCA), 阻斷MCA血供2 h，然后將尼龍線拔出再灌注制備大腦中動脈閉塞(MCAO)模型[8]。在建立MCAO模型的基礎(chǔ)上，所有大鼠均單籠孤養(yǎng)，并于造模1周后，每日給予一次慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS), 連續(xù)刺激3周以構(gòu)建PSD模型。具體方法： 按禁食禁水24 h、4 ℃冰水游泳5 min、45 ℃烤箱烘烤5 min、夾尾1 min、水平高速振蕩30 min、燈光照射使之活動晝夜顛倒等順序交替進行應(yīng)激性刺激[9]。

1.4 干預(yù)方法

參考人與動物間藥物劑量的換算方法，經(jīng)計算，大鼠每日用藥劑量在200～400 mg。實驗人員預(yù)實驗表明，這一劑量對PSD模型大鼠均產(chǎn)生治療作用，故正式實驗時，黃芪多糖低劑量組(200 mg/kg)和高劑量組(400 mg/kg)大鼠用相應(yīng)劑量的黃芪多糖灌胃(1次/d)，在成功建立PSD模型后灌胃給藥治療 4 周。抑郁模型組和假手術(shù)組給予相同體積的生理鹽水灌胃對照。

1.5 PSD模型大鼠學(xué)習(xí)能力及行為學(xué)記錄

采用糖水?dāng)z取實驗及Zero水迷宮分析系統(tǒng)評價大鼠抑郁樣行為及學(xué)習(xí)記憶能力[10]。

1.6 腦電振蕩電位膜片鉗記錄

大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后處死, 去頭頂骨暴露腦組織，迅速取出后放入4 ℃通有體積分?jǐn)?shù)95%O2+5%CO2的飽和人工腦脊液中, 分離出大鼠海馬CA1區(qū)腦組織，修整后用振動切片機切成厚約300 μm的腦薄片。取其中2片于飽和人工腦脊液中孵育 1 h, 用膜片鉗放大器記錄海馬CA1區(qū)動作電位(AP)、群峰電位(PS)。

1.7 IL-1β、IL-6的ELISA試驗

處死大鼠前取尾靜脈血, 嚴(yán)格按ELISA檢測試劑盒說明書進行操作, 檢測出IL-1β、IL-6濃度。

1.8 CA1區(qū)海馬腦薄片NF-κB和PPAR-γ蛋白表達

NF-κB和PPAR-γ蛋白表達檢測采用Western blotting方法[12]。取未做膜片鉗的全部大鼠海馬CA1區(qū)腦組織制成組織勻漿液, 嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作，檢測上述標(biāo)本中NF-κB和PPAR-γ的吸光度(A)值，然后以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)、A值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 使用curve expert 1.3軟件計算出二者相應(yīng)濃度。

1.9 RT-PCR

采用實時定量-PCR技術(shù)檢測大鼠海馬CA1區(qū)腦組織 NF-κB 和 PPAR-γ基因表達[13]。

NF-κB mRNA

上游引物： 5'- AGCCAGTGGAACTGCATGGTAC-3'，

下游引物： 5'- GCTAGCCCTGCTAGCTGAG-3'，

PPAR-γ mRNA

上游引物： 5'- ACCGACTAAGCGTTCATCTTAC-3'，

下游引物： 5'- AGCACTGGCCTCATCTGAC-3'，

GAPDH引物： 5'- AGCTCCGATCGGTCCGATTCAG-3'，

RNA 抽提試劑盒提取腦組織標(biāo)本總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄，以GAPDH為內(nèi)參PCR擴增，然后對NF-κB和PPAR-γ基因進行半定量分析。PCR反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性2 min，然后95 ℃和52 ℃各30 s、72 ℃ 60 s, 擴增54個循環(huán)。以NF-κB和PPAR-γ灰度值/GAPDH灰度值表示NF-κB mRNA和PPAR-γ mRNA的相對值(/GAPDH)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，定量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Zero水迷宮及糖水?dāng)z取

與假手術(shù)組比, 抑郁模型組大鼠糖水?dāng)z取量明顯下降、逃避潛伏期延長, 越臺次數(shù)減少(P＜0.05)。與抑郁模型組比，低劑量組和高劑量組大鼠糖水?dāng)z取量明顯增多、逃避潛伏期縮短，越臺次數(shù)增多(P＜0.05)，且高劑量組與低劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表 1)。

2.2 大鼠CA1區(qū)海馬腦電振蕩電位變化

與假手術(shù)組比，抑郁模型組海馬CA1區(qū)AP和PS膜電壓明顯升高(P＜0.05)。與抑郁模型組比較，低劑量組和高劑量組 CA1區(qū)AP和PS膜電壓明顯降低(P＜0.05)。高劑量組較低劑量組變化更明顯(P＜0.05)(表 2)。

表1 4組大鼠Zero水迷宮及糖水?dāng)z取實驗結(jié)果比較

表2 大鼠CA1區(qū)海馬AP和PS比較 mV

2.3 黃芪多糖對大鼠血清IL-1β、IL-6濃度影響

與假手術(shù)組比, 抑郁模型組血清IL-1β和IL-6明顯升高(P＜0.05)； 與抑郁模型組比較，低劑量組和高劑量組血清IL-1β和IL-6明顯降低(P＜0.05)；高劑量組降低更明顯(P＜0.05)(表3)。

表3 大鼠血清IL-1β、IL-6濃度比較 ng/L

2.4 黃芪多糖對大鼠腦組織NF-κB和PPAR-γ蛋白及其基因表達的影響

與假手術(shù)組比，抑郁模型組NF-κB蛋白和NF-κB mRNA表達明顯升高，而PPAR-γ蛋白和PPAR-γ mRNA明顯降低(P＜0.05)。與抑郁模型組和低劑量組比較，Western blotting檢測結(jié)果顯示高劑量組PPAR-γ蛋白及PPAR-γ mRNA高表達、NF-κB 蛋白及NF-κB mRNA 低表達(P＜0.05)。高劑量組與低劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表 4)。

3 討論

PSD是缺血性卒中后最常見的精神病并發(fā)癥，研究[14]表明，腦卒中2周后27.47%的患者會出現(xiàn)不同程度的抑郁，PSD會延遲卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)，并可能增加卒中復(fù)發(fā)率和病死率。目前對其病理生理學(xué)的研究比較深入，但其發(fā)病機制仍然難以捉摸，似乎是多因素的，而不是“純粹的”心理社會學(xué)或生物學(xué)改變引起的，大量實驗證實, MCAO后創(chuàng)傷性應(yīng)激可能是造成動物抑郁的主要因素[15]。在PSD病理進程中，存在NF-κB高激活現(xiàn)象，NF-κB信號通路是機體炎癥反應(yīng)的重要體系，是能將信息從胞質(zhì)傳至髓核引起相應(yīng)基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，主要介導(dǎo)機體組織損傷、細胞分化和凋亡、創(chuàng)傷性應(yīng)激和防御反應(yīng)的信息傳遞，在缺血性腦卒中與血管壁炎癥損傷中發(fā)揮著重要作用[16]。當(dāng)機體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時, 處于高激活狀態(tài)的NF-κB誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達一系列趨化因子及黏附分子, 侵入血管內(nèi)膜形成泡沫細胞, 加速血管形成, 并進一步激活外周血單核細胞, 誘導(dǎo)產(chǎn)生和釋放細胞因子IL-1β、IL-6等, 刺激機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并加重腦損傷[17]。有研究[18]表明, IL-6作為一種重要的炎癥介質(zhì), 介導(dǎo)PSD病理演變過程中的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，其表達水平與腦損傷程度呈正相關(guān), 而腦損傷程度又與抑郁程度正相關(guān)。PPAR-γ具有清除分子氧和氫過氧化物等作用。同時，PPAR-γ可促進NF-κB的磷酸化反應(yīng), 從而抑制其活性，因PPAR-γ激活后可以抑制缺血再灌注損傷腦組織及血管中炎性細胞的免疫活性, 且PPAR-γ對巨噬細胞活化起負性調(diào)節(jié)作用，可抑制單核細胞產(chǎn)生炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6等, 從而實現(xiàn)缺血缺氧后對神經(jīng)元的保護[19]。因此，有理由相信, NF-κB信號通路在PSD的病理演變中具有重要的信號轉(zhuǎn)錄作用。調(diào)控NF-κB信號通路，提高PPAR-γ活性、抑制NF-κB信號通路的激活可減少IL-1β、IL-6等細胞因子的釋放，可降低腦組織炎癥反應(yīng)造成的腦損傷，在一定程度上降低腦卒中后抑郁的發(fā)生和發(fā)展。

表4 大鼠NF-κB和PPAR-γ蛋白及其基因表達比較

黃芪多糖除具有抗炎、抗腫瘤、增強免疫和降血糖等藥理學(xué)活性外, 還具有良好的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)功能恢復(fù)作用, 對改善神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病引起的不同類型的神經(jīng)損傷具有明顯治療作用[20]。本實驗觀察發(fā)現(xiàn), 在干預(yù)性治療4周后, 黃芪多糖低劑量組和高劑量組大鼠NF-κB蛋白和NF-κB mRNA表達均明顯降低, 而PPAR-γ蛋白和PPAR-γ mRNA明顯升高，且血清IL-1β和IL-6明顯降低。由此可見，黃芪多糖可能通過提高PPAR-γ活性來抑制NF-κB信號通路活性。NF-κB信號通路活性降低又會引起受其調(diào)控的IL-1β、IL-6的釋放減少, 這一級聯(lián)反應(yīng)對降低腦組織炎癥反應(yīng)造成的腦損傷, 減輕腦卒中后抑郁的發(fā)生起到重要的促進作用。這一結(jié)果與上述諸多研究結(jié)論及王煜等[21]的研究結(jié)果高度一致。研究[22]表明，PSD會造成腦組織持續(xù)性缺血缺氧，這會導(dǎo)致鈉氫通道開放，鈉氫通道對維持細胞內(nèi)pH值以及細胞體積穩(wěn)定至關(guān)重要。鈉氫通道過度激活和開放會導(dǎo)致細胞內(nèi)Na+超載，進而激活鈉鈣通道，使Ca2+內(nèi)流增加，這又可能引起細胞內(nèi)Ca2+超載并造成細胞嚴(yán)重損傷，Ca2+超載是引起PSD患者神經(jīng)細胞損傷的離子基礎(chǔ)。也是抑郁模型組大鼠CA1區(qū)海馬AP和PS膜電壓高于假手術(shù)組的離子基礎(chǔ)。從膜片鉗記錄結(jié)果看，黃芪多糖低劑量組和高劑量組CA1區(qū)AP和PS膜電壓較抑郁模型組低，黃芪多糖對離子通道和CA1區(qū)膜電位的影響還是首次發(fā)現(xiàn)，這一現(xiàn)象提示黃芪多糖具有維持膜電壓穩(wěn)定性的作用。黃芪多糖可能具促進持續(xù)開放的鈉氫通道關(guān)閉，使Na+、H+交換和Na+、Ca2+維持在正常水平，保證細胞內(nèi)pH值和Ca2+水平的平衡，防止細胞酸中毒并糾正Ca2+超載，促使神經(jīng)細胞功能得以恢復(fù)。黃芪多糖低劑量組和高劑量組大鼠糖水?dāng)z取量明顯增多、逃避潛伏期縮短,越臺次數(shù)增多，這一現(xiàn)象提示經(jīng)黃芪多糖治療,大鼠抑郁樣行為減輕，學(xué)習(xí)記憶能力增強。這一實驗結(jié)果提示，黃芪多糖可能是通過抑制NF-κB信號通路的激活而降低受其調(diào)控的細胞因子IL-1β和IL-6的釋放，減輕炎癥反應(yīng)并提高CA1區(qū)膜穩(wěn)定性，這可能是其治療PSD的機制之一。

前已述及，PSD引起的抑郁樣行為與CA1區(qū)海馬AP和PS膜電壓穩(wěn)定性有關(guān)，本研究的創(chuàng)新點在于在觀察黃芪多糖對NF-κB信號通路的影響的同時、結(jié)合電生理技術(shù)記錄其對離子通道和CA1區(qū)膜電壓的影響并系統(tǒng)分析了可能機制，為其在醫(yī)藥保健等領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用方面提供參考，也為研究其它藥物治療PSD提供了可行的研究方法。但PSD是一種“多機制、多因素”的精神病并發(fā)癥，本研究雖從行為、電生理、生化檢測和分子生物學(xué)等方面觀察黃芪多糖對PSD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及抑郁樣行為的影響，但也有不足之處，如未觀察MCAO后創(chuàng)傷性應(yīng)激引起抑郁癥狀有關(guān)的5-羥色胺水平及與機體興奮性有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)腎上腺素(Adr)和去甲腎上腺素(NE)水平， 也未觀察與神經(jīng)恢復(fù)相關(guān)的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)蛋白等，并且本實驗是在建立PSD模型后給藥治療，而不是在MCAO后和CUMS期間進行預(yù)防性給藥進行干預(yù)性治療，這不能完全反映黃芪多糖在PSD病理演變過程中的作用，故還不能完全揭示黃芪多糖對PSD的全部可能機制，這也是我們下一步工作的重點。