国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

抗應(yīng)激添加劑對運輸后肉牛應(yīng)激蛋白mRNA和蛋白表達水平的影響

2019-12-25 07:44:00曹中贊王曉娜陳美月許建文欒新紅
關(guān)鍵詞:肌肉組織肉牛添加劑

曹中贊,王曉娜,李 靜,陳美月 ,許建文 ,欒新紅

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院,沈陽 110161;2.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟管理站,沈陽 110032)

在現(xiàn)代肉牛的集約化養(yǎng)殖過程中,引種、售賣、異地屠宰和繁育等需要肉牛的流轉(zhuǎn)運輸。而由于冷、熱、風(fēng)、雨、顛簸、擁擠、噪音、驚嚇、饑渴、體力耗費、環(huán)境變化及潛在疾病等應(yīng)激因素的影響,肉牛會在運輸過程中出現(xiàn)較為常見的應(yīng)激癥狀,表現(xiàn)為失重、致殘或致死、肉品質(zhì)和免疫力降低等,可見,運輸應(yīng)激對肉牛生產(chǎn)會造成重大經(jīng)濟損失。研究認為,機體在遭受應(yīng)激源刺激時,比如缺血[1]、缺氧[2]、中毒[3]、能量損失[4],以及紅外線輻射[5]、磁場[6],甚至心理方面的影響[7]等,都會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),并可能誘導(dǎo)產(chǎn)生一些具有不同生理功能的應(yīng)激蛋白(stress protein),其中研究最多的是熱應(yīng)激蛋白(heat shock protein,HSP)[8]。熱應(yīng)激蛋白對細胞的生存能力和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義[9-11]。之前很多研究人員通過給予豬只不同刺激來探究HSPs的表達及其變化,但在不同肌肉組織中并未發(fā)現(xiàn)HSPs表達的變化[12-15],有關(guān)動物運輸后肌肉組織HSPs表達的研究報道更少[12-13,16]。本研究以遼育白牛為研究對象,飼喂兩種抗應(yīng)激添加劑后進行運輸,探討運輸過程對肉牛機體應(yīng)激蛋白表達的影響,以及兩種抗應(yīng)激添加劑對肉牛運輸應(yīng)激是否有改善作用,以期為兩種抗應(yīng)激添加劑在肉牛生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及分組 選擇體重和體況相近的健康出欄育肥遼育白牛27頭,隨機分成3組:對照組、抗應(yīng)激1號組和抗應(yīng)激2號組,每組9個重復(fù),每個重復(fù)1頭牛,其中對照組飼喂常規(guī)基礎(chǔ)飼糧,抗應(yīng)激1號組飼喂添加劑1號,抗應(yīng)激2號組飼喂添加劑2號,每天1次,飼喂10d,在20℃、相對濕度51%的環(huán)境條件下,以50~60km·h-1的速度在公路上運輸5h,其他內(nèi)容同王曉娜等[17]的報道。

1.1.2 主要試劑及器械 HSP70酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 (南京建成生物工程研究所)、HSP90抗體和HSP70抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)及辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(巴基斯坦SANTA公司)、Prime Script RT Reagent Kit試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白提取試劑盒、麗春紅染色液及ECL化學(xué)發(fā)光染料(北京普利萊公司)等。酶標(biāo)儀(TECAN公司)、凝膠成像系統(tǒng)(以色列DNR Micro Chemi 4.2)、PCR擴增儀(S1000)和實時熒光定量PCR儀(iQ5)(美國Bio-Rad公司)等。

1.1.3 樣品采集 分別于運輸前和運輸后采集肉牛血液,制備血清,置于-20℃冰箱待測。運輸后進行屠宰,采集肉牛肌肉組織,液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 肉牛血清中HSP70含量的檢測 采用ELISA法檢測肉牛血清中HSP70的含量,具體操作根據(jù)HSP70酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書。

1.2.2 肉牛運輸后肌肉組織內(nèi)HSP27、HSP70和HSP90 mRNA表達量的檢測

1.2.2.1 組織樣本總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 從每組肉牛肌肉組織樣品中分別隨機選出3個,利用Trizol法進行總RNA的提取,然后進行反轉(zhuǎn)錄,具體操作方法參見Prime Script RT Reagent Kit試劑盒說明書,所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA用于后續(xù)反應(yīng)。

1.2.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中已有的牛的看家基因GAPDH(Genbank:XR_083674.4)及目的基因HSP27(Genbank:BT021550.1)、HSP70(Genbank:BT030673.1)和 HSP90(Genbank:NM_001012670.2)的序列信息,采用Primer6.0設(shè)計引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成,引物序列見表1。

1.2.2.3 實時熒光定量PCR 按20μL反應(yīng)體系進行qRT-PCR反應(yīng) (具體操作參照試劑盒說明書):SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL,上、下游引物各 0.8μL,cDNA 2μL,ddH2O 6.4μL。 一個組織樣品設(shè)定 3 個平行,并同時設(shè)置陰性對照(在陰性對照孔內(nèi)加入2μL ddH2O),利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量,其公式為:

表1 肉牛內(nèi)參基因及目的基因的引物序列Table 1 Primer sequence of reference gene and target gene in beef cattle

1.2.3 肉牛運輸后肌肉組織內(nèi)HSP70和HSP90蛋白表達水平的檢測

1.2.3.1 組織樣本總蛋白的提取 按照試劑盒說明書提取運輸后肉牛肌肉組織的總蛋白,并使用BCA試劑盒檢測總蛋白量。

1.2.3.2 HSP70和HSP90蛋白表達量的檢測及數(shù)據(jù)分析 分別配制分離膠(濃度10%,pH值8.8)和濃縮膠(濃度5%,pH值6.8),然后分別灌入分離膠和濃縮膠,蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液(5×loading buffer)按4∶1混勻,加入5μL彩色預(yù)染蛋白Marker后上樣,按上層膠電壓為80V,30min電泳;下層膠電壓為120V,直至溴酚蘭距離底端0.5cm時,電泳終止,進行轉(zhuǎn)膜。設(shè)置恒流300mA,恒壓15V,80min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,封閉過夜。用稀釋后的一抗(HSP70和HSP90抗體1∶500;GAPDH內(nèi)參抗體1:1000)孵育PVDF膜,4℃過夜或室溫水平搖床孵育1~2h 后,洗膜 4 次,每次 7min。 用 TBST(1∶3000~1∶5000)稀釋二抗,并孵育 2h,然后連續(xù)洗膜 5 次,每次 7min。將配制好的ECL化學(xué)試劑A液與B液滴到PVDF膜上,反應(yīng)3min后,應(yīng)用超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Gelcapture Chemi進行成像。用GelQuant分析軟件對目的蛋白灰度值進行半定量分析,取目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比(或灰度比值)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

對數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析,用 “平均值±標(biāo)準差”表示,利用SPSS17.0軟件中One-Way ANONA法的Tukey HSD和LSD進行統(tǒng)計分析,差異顯著用p<0.05表示,差異極顯著用p<0.01表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 運輸前后肉牛血清HSP70含量的檢測結(jié)果與分析

運輸前后肉牛血清HSP70含量的檢測結(jié)果見表2。由表2可知,抗應(yīng)激1號組運輸后和運輸前同對照組相比,血清中HSP70濃度均極顯著減少(p<0.01),抗應(yīng)激2號組運輸前較抗應(yīng)激1號組極顯著增加(p<0.01)。相對于運輸前,各組運輸后血清HSP70含量均有升高趨勢,其中抗應(yīng)激1號組運輸后的增加幅度極顯著高于抗應(yīng)激2號組(p<0.01),但與對照組相比差異不顯著(p>0.05)。由此可見,運輸使肉牛血清HSP70含量升高,而飼喂抗應(yīng)激添加劑1號可以明顯增加運輸后肉牛血清的HSP含量。

2.2 運輸后肉牛肌肉組織中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA的表達量

運輸后各組肉牛肌肉組織內(nèi)HSP27、HSP70和HSP90 mRNA表達水平的檢測結(jié)果見表3。由表3可知,運輸后,抗應(yīng)激添加劑組肉牛肌肉中HSP27 mRNA表達量均比對照組低,且抗應(yīng)激1號組較對照組和抗應(yīng)激2號組均顯著降低(p<0.05),抗應(yīng)激2號組與對照組差異不明顯(p>0.05)。兩個抗應(yīng)激添加劑組HSP70 mRNA表達量比對照組顯著降低 (p<0.05),抗應(yīng)激1號組同抗應(yīng)激2號組之間差異不大 (p>0.05)。抗應(yīng)激添加劑組HSP90 mRNA的表達量均較對照組明顯降低(抗應(yīng)激1號組:p<0.05;抗應(yīng)激2號組:p>0.05),兩個抗應(yīng)激添加劑組之間差異不顯著(p>0.05)。

2.3 運輸后各組肉牛肌肉組織中HSP70和HSP90蛋白的表達量

運輸后肉牛肌肉組織中HSP70和HSP90蛋白表達量的檢測結(jié)果見圖1和表4。

表2 運輸前后肉牛血清HSP70含量的檢測結(jié)果Table 2 Serum HSP70 content of beef cattle before and after transportation /ng·L-1

表3 運輸后肉牛肌肉組織中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA的表達量Table 3 The mRNA expression of HSP27,HSP70 and HSP90 in beef muscle tissue after transportation

由圖1和表4可知,運輸后,抗應(yīng)激添加劑組肉牛HSP70蛋白的表達量較對照組明顯減少(p<0.01),兩個抗應(yīng)激添加劑組之間表達量差異不明顯(p>0.05),但抗應(yīng)激添加劑2號組較抗應(yīng)激添加劑1號組略高;抗應(yīng)激添加劑組HSP90蛋白的表達量均較對照組明顯減少(p<0.05),抗應(yīng)激添加劑2號組表達量較抗應(yīng)激1號組略高,但差異不顯著(p>0.05)。

圖1 HSP70和HSP90蛋白相對表達量的檢測結(jié)果Figure 1 Relative expression of HSP70 and HSP90

表4 運輸后肉牛肌肉組織中HSP70和HSP90蛋白表達水平的檢測結(jié)果Table 4 Relative expression levels of HSP70 and HSP90 protein in muscle tissues of beef cattle after transportation

3 討論與結(jié)論

1962年,RITOSSA[18]在試驗中發(fā)現(xiàn),過熱的環(huán)境中果蠅唾液腺染色體會出現(xiàn)疏松部形態(tài)上的變化。到了1974年,TISSIERES等[19]才證實這種變化是因為過熱環(huán)境激發(fā)了染色體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄,合成了一組具有特殊功能的蛋白質(zhì),即HSPs,伴隨其合成,其余蛋白質(zhì)的合成將會受到相應(yīng)抑制。HSPs廣泛存在于生物界,保守性很高,當(dāng)細胞受到一系列不利刺激時(例如高溫、缺氧、缺血、感染等),它會迅速的大量合成,并和細胞內(nèi)一部分變性了的蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合,從而發(fā)揮保護作用。當(dāng)機體發(fā)生應(yīng)激時,HSPs的出現(xiàn)標(biāo)志著細胞啟動自我保護。有研究證明,HSP70結(jié)構(gòu)高度保守,具有很多生物學(xué)功能,除了對遭受應(yīng)激的動物機體具有一定的保護作用外,還可以作為佐劑[20-21],是機體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時生成量最多的應(yīng)激蛋白家族成員之一[22-23],能夠幫助新合成的多肽鍵的延展和折疊,并可糾正多肽鏈的錯誤折疊等。當(dāng)機體遭受應(yīng)激源刺激時,體內(nèi)的應(yīng)激蛋白會急劇升高,其含量會發(fā)生急劇變化,繼而穩(wěn)定改變的細胞內(nèi)環(huán)境,維持細胞的生存[24-25]。HSP的生物學(xué)作用非常多,涉及的方面也越來越廣,很多學(xué)者認為HSP可以作為應(yīng)激指征[26]。周京軍等[27]曾發(fā)現(xiàn),受應(yīng)激刺激的心肌細胞因HSP70表達量增加而受到保護,心肌細胞恢復(fù)其功能的時間會大大縮短,心肌梗死面積也會顯著縮小。本試驗發(fā)現(xiàn),運輸可導(dǎo)致肉牛血清HSP70含量和肌肉HSP70表達量明顯增加,這可能與機體對抗運輸應(yīng)激帶來的危害有關(guān)。

有資料顯示,HSP90和HSP70兩種應(yīng)激蛋白可以與其他分子一起行使調(diào)節(jié)功能,尤其在心肌細胞內(nèi),如果HSP90含量升高則可降低或者減少發(fā)生心梗的程度和范圍[28-29],而HSP90在心臟中含量的減少會增加發(fā)生心臟病的風(fēng)險,導(dǎo)致死亡率升高。本試驗中,運輸后肉牛肌肉組織中3種應(yīng)激蛋白HSP27、HSP70和HSP90在mRNA水平的表達量,以及HSP70和HSP90在蛋白水平的表達量均明顯增加,尤其是HSP70的蛋白表達量極顯著升高。由此推測,運輸可能通過誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)而明顯增加肉牛肌肉組織中3種應(yīng)激蛋白HSP27、HSP70和HSP90的含量。而飼喂抗應(yīng)激添加劑的兩組幾種應(yīng)激蛋白的含量均較對照組低,雖然運輸后應(yīng)激蛋白的增加可以緩解運輸導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)所帶來的機體損害,但機體短期迅速地合成應(yīng)激蛋白可能會過度消耗體內(nèi)的能源物質(zhì),飼喂抗應(yīng)激添加劑有望避免應(yīng)激反應(yīng)后應(yīng)激蛋白急劇大量合成所造成的過度消耗,而抗應(yīng)激1號組運輸前和運輸后血清HSP明顯均較其他組低,但其運輸后較運輸前增加幅度要高于其他兩組,尤其是顯著高于抗應(yīng)激2號組,顯然抗應(yīng)激1號添加劑抵抗應(yīng)激、減少機體消耗的效果較2號添加劑更明顯。本試驗結(jié)果顯示,屠宰前的運輸會導(dǎo)致肉牛血液和肌肉中應(yīng)激蛋白含量增加,從一定程度上可以緩解運輸應(yīng)激對機體造成的損害,但運輸過程中的驚恐和高度緊張狀態(tài)使畜體自身營養(yǎng)消耗加快,運輸應(yīng)激使機體快速合成大量應(yīng)激蛋白,從而導(dǎo)致體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的過度消耗。研究中運輸前飼喂抗應(yīng)激添加則可以有效緩解了這種狀況,這將有利于機體穩(wěn)態(tài)的維持,提高機體抗應(yīng)激能力。所以,養(yǎng)牛生產(chǎn)中可以考慮在運輸前飼喂抗應(yīng)激添加劑,以提高畜體抗應(yīng)激、保持機體穩(wěn)態(tài)的能力,有利于生產(chǎn)效益的提高。

綜上所述,運輸使肉牛血清和肌肉組織中應(yīng)激蛋白含量增加,而抗應(yīng)激添加劑可影響運輸后肉牛血清及肌肉組織中應(yīng)激蛋白的水平,尤以抗應(yīng)激1號作用更明顯。

猜你喜歡
肌肉組織肉牛添加劑
冬季肉牛咋喂精料
冬春如何提高肉牛采食量
贏創(chuàng)擴大在華涂料添加劑產(chǎn)能
上海涂料(2021年5期)2022-01-15 06:09:48
今日農(nóng)業(yè)(2021年21期)2021-11-26 05:07:00
蒙古斑點馬不同部位脂肪和肌肉組織中脂肪酸組成的比較研究
肉類研究(2020年9期)2020-12-14 04:26:26
高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立同時測定肌肉組織中4種藥物殘留的方法及其確認
科技資訊(2020年3期)2020-04-07 03:38:08
地理復(fù)習(xí)課的“添加劑”
高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定肌肉組織中4 種獸藥殘留
肉類研究(2017年8期)2017-11-16 12:03:49
食品添加劑有多可怕?
會變魔術(shù)的添加劑
中西区| 菏泽市| 保定市| 临海市| 克什克腾旗| 西丰县| 台中市| 安乡县| 宁远县| 景东| 宁国市| 安康市| 新昌县| 涟源市| 沁源县| 揭阳市| 张掖市| 南京市| 九江县| 长垣县| 老河口市| 津市市| 许昌县| 明溪县| 靖江市| 蒙城县| 山阴县| 洛川县| 望城县| 元氏县| 罗江县| 东乌珠穆沁旗| 西城区| 蕲春县| 罗城| 青岛市| 临夏市| 任丘市| 佳木斯市| 上思县| 随州市|