賽鬧汪青,冉瑞蘭,張牡丹,曹佳鑫,馮漢青,龐海龍,賈凌云

銅脅迫對黃芪幼苗的生理學毒性與凹凸棒黏土的緩解作用

賽鬧汪青,冉瑞蘭,張牡丹,曹佳鑫,馮漢青*,龐海龍,賈凌云

(西北師范大學生命科學學院,甘肅 蘭州 730070)

為探究黃芪幼苗對銅離子(Cu2+)脅迫的耐性機理以及凹凸棒黏土對Cu2+污染的緩解作用,研究了不同濃度CuSO4(2~20mmol/L)脅迫對黃芪幼苗的生理學毒性與凹凸棒黏土的緩解作用.結(jié)果表明,2mmol/L CuSO4脅迫使得根系Cu2+含量、H2O2(過氧化氫)含量、MDA(丙二醛)含量分別較對照顯著上升1.82倍、1.04倍、2.14倍. CuSO4脅迫濃度達8mmol/L時,根系SOD(超氧化物歧化酶)活性、根尖膜損傷程度和葉片Cu2+含量分別較對照顯著上升1.13倍、1.12倍和2.62倍;同時,葉片PS Ⅱ(光系統(tǒng)II)實際光化學效率[Y(II)]、光化學淬滅系數(shù)(qP)、PS Ⅱ電子傳遞速率(ETR)和葉綠素含量較對照分別顯著降低22.88%、24.44%、21.49%和28.31%,而NPQ和qN (非光化學熒光猝滅系數(shù))則較對照分別顯著上升2.35倍和1.58倍.根系 POD(過氧化物酶)和 CAT(過氧化氫酶)活性、可溶性糖和可溶性蛋白含量在8mmol/L CuSO4處理下達到最高值后呈下降趨勢. CuSO4濃度為15~20mmol/L時,根系APX活性和葉片光適應下PS II潛在最大光化學效率(v￠/m￠),以及幼苗全株鮮重、全株干重、地下部鮮重、地下部干重較對照顯著下降.在非CuSO4脅迫條件下,基質(zhì)中凹凸棒黏土的存在使得幼苗根系MDA含量較對照顯著降低15.93%,但未對其它所測生理學指標產(chǎn)生顯著影響;在20mmol/LCuSO4脅迫條件下,基質(zhì)中凹凸棒黏土的存在使得幼苗根系和葉片中Cu2+含量分別顯著下降30.78%和23.12%;同時顯著緩解了20mmol/LCuSO4脅迫對根系活性氧水平、抗氧化酶活性、膜脂質(zhì)過氧化程度、根尖膜損傷程度、可溶性蛋白和可溶性糖含量,葉片PS II光化學活性和葉綠素含量的不良影響,以及對幼苗生長的抑制作用.研究結(jié)果表明,培養(yǎng)基質(zhì)中凹凸棒黏土的存在能夠顯著降低幼苗組織中Cu2+的生物有效性,繼而緩解CuSO4脅迫對黃芪幼苗的生理學毒性作用.

銅離子；黃芪幼苗；凹凸棒黏土；緩解

隨著工業(yè)含銅離子(Cu2+) “三廢” 和垃圾排放量的增加,以及含Cu2+飼料添加劑和殺菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用,使得環(huán)境Cu2+污染問題日益嚴重.已有研究表明,Cu2+脅迫會誘導植物體內(nèi)活性氧(ROS)過量積累,破環(huán)植物體內(nèi)活性氧代謝動態(tài)平衡,損傷光合細胞器,影響植物原初光化學反應和PS II光合電子傳遞,進而導致植物體水分代謝,光合作用,呼吸作用等各種生理代謝發(fā)生紊亂[1-4].

黃芪(.)為我國主要常用藥用植物之一;近年來,黃芪人工栽培量不斷增加,但農(nóng)藥殘留、重金屬含量超標等問題嚴重限制黃芪產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的綠色發(fā)展[5].目前,盡管針對單一黃芪產(chǎn)地土壤Cu2+污染和黃芪藥用部分Cu2+含量超標的報道極少,但是研究指出我國甘肅等 27省、自治區(qū)和直轄市道地藥材產(chǎn)地中黃芪等8種中藥材Cu2+超標率達11.10%,而且Cu2+污染情況因產(chǎn)地不同而呈現(xiàn)一定的差異[6];現(xiàn)有藥用植物栽培基地多數(shù)都是在傳統(tǒng)農(nóng)田基礎上改造形成,這些農(nóng)田在傳統(tǒng)的生產(chǎn)中存在使用污水灌溉和施用 Cu2+基農(nóng)藥等現(xiàn)象[7].當植物體病害發(fā)生時,農(nóng)民可能通過提高重金屬基農(nóng)藥如波爾多液(Cu2+濃度達1.5g/L[8])等的施加量和施用次數(shù)來緩解和控制病害對植物的不良影響,這導致植物處于一種短期高濃度重金屬離子脅迫狀態(tài)[4].此外,研究指出在某些重金屬污染區(qū)域如遇暴雨等極端天氣將會導致大量Cu2+等重金屬離子通過水體等媒介進入植物體培養(yǎng)基質(zhì),繼而使植物體處于一種短期高濃度重金屬離子脅迫狀態(tài)[9].因此,控制栽培基質(zhì)中Cu2+的生物有效性,最大程度減少其向植物藥用部分轉(zhuǎn)移是一個亟待解決的問題.

凹凸棒黏土(Attapulgite,APT)為具獨特層鏈狀多孔結(jié)構(gòu)的天然非金屬黏土礦物(圖1),其儲量豐富、價格低廉[10-11].研究發(fā)現(xiàn), APT作為植物栽培基質(zhì)外源添加劑能夠有效改善基質(zhì)團粒結(jié)構(gòu)、提高持水量,優(yōu)化植物體生長,并且對作物連作誘發(fā)的自毒作用具有良好的修復作用[12-14].此外,因APT優(yōu)越的膠體和吸附性質(zhì),能夠誘導環(huán)鏡中重金屬離子發(fā)生水解沉淀,通過正負電荷膠體顆粒的相互作用等途徑吸附和絡合基質(zhì)中的重金屬離子[15-16];在受重金屬污染的栽培基質(zhì)中添加APT能夠顯著提高栽培基質(zhì) pH 值、陽離子交換量和基質(zhì)細顆粒含量,并且顯著減少植物對重金屬離子的富集程度,同時抑制植物對Zn和Ni等重金屬的吸附[17].因此, APT有望作為栽培基質(zhì)的外源添加劑,進一步優(yōu)化植物體的生長,并且在栽培基質(zhì)受到重金屬污染時減少重金屬污染對藥用植物生長的不良影響.

本文探究了不同濃度CuSO4脅迫對黃芪幼苗生理學特性和生長的影響,以及培養(yǎng)基質(zhì)中APT的存在對緩解黃芪幼苗受CuSO4脅迫的影響,以期豐富Cu2+對黃芪幼苗作用機理研究,拓展APT在藥用植物栽培領域的應用,為預防黃芪苗期遭受重金屬污染提供一定的借鑒和參考.

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

取健康飽滿的種子,濃硫酸處理[90%(/),浸泡2min],蒸餾水沖洗(30min)至表面無殘留濃硫酸溶液,置于蒸餾水中浸泡12h,繼而將種子置于90mm培養(yǎng)皿(鋪有多層紗布且用蒸餾水浸濕,每皿放置50粒種子)中,在28℃、黑暗條件下進行萌發(fā)并觀察萌發(fā)狀況.選擇萌發(fā)狀態(tài)一致的種子(胚根突破種皮),點播至塑料盆缽[內(nèi)為蛭石或APT:蛭石=1:80(/),盆缽外徑90mm、高80mm]中,每盆點播6~7粒種子,然后置于培養(yǎng)室(晝夜溫度:27℃/23℃,濕度:(40±3)%,光照強度:(150±5)μmol/(m2·s),光照周期:12h光照/ 12h黑暗)進行培養(yǎng);待幼苗長至兩葉一芯時開始每周施加(根施)一次1/2Hoagland營養(yǎng)液,其余時間施加蒸餾水以確保幼苗生長所需的水肥充足.幼苗生長至四葉一芯時(自培養(yǎng)皿移栽至盆缽30d),選取長勢基本一致幼苗進行實驗.

1.2 材料處理及方法

第一組實驗:選取生長于蛭石中的黃芪幼苗,分別用2,8,15,20mmol/L的CuSO4溶液施加于培養(yǎng)基質(zhì)中,對照組施加等量蒸餾水,在培養(yǎng)室培養(yǎng)24h后進行生理學指標的測量.

第二組實驗:選取生長于蛭石或APT:蛭石=1:80(/)中的黃芪幼苗,用20mmol/L的CuSO4溶液施加于基質(zhì)中,對照組施加等量蒸餾水,繼而在培養(yǎng)室培養(yǎng)24h后進行生理學指標的測量.

圖1 APT掃描電鏡成像

1.3 Cu2+ 含量的測定

黃芪幼苗根系與葉片分離,將根系置于10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)中15min,用去離子水將根系表面雜質(zhì)洗凈,用濾紙吸干表面水分,繼而將根系和葉片在70℃烘干48h至恒重,最后將植物樣品用70%(/) HNO3消解,通過電感耦合等離子體—原子發(fā)射光譜法測定Cu2+含量[18].

1.4 生長指標測定

取不同處理組植株,用蒸餾水反復沖洗3次,然后用濾紙吸干水分,測定全株鮮重(根莖葉混合)、地下部(根系)鮮重;同時,拍照記錄,用ImageJ 2.1.4.7軟件測量根長及株高.然后將鮮植株置于烘箱105℃殺青20min,75℃烘干至恒重,稱全株干重和地下部干重[19-20].

1.5 可溶性蛋白、可溶性糖含量的測定

用去離子水將黃芪幼苗根系表面雜質(zhì)洗凈,用濾紙吸干表面水分,繼而置于研缽中加入3mL蒸餾水研磨成勻漿,離心(8000r/min,10min),靜置1h,取1mL上清液,加入5mL考馬斯亮藍G-250試劑充分混勻,靜置2min后,記錄595nm處吸光值,根據(jù)標準曲線計算蛋白含量,單位為mg/gFW[4].

黃芪幼苗根系(鮮樣)加入4mL 80%(/)乙醇,研磨至勻漿,80℃水浴30min,離心(5000r/min,10min),取上清液(1mL)與5mL蒽酮(將150mg蒽酮溶于100mL 80%(/)硫酸中)混合,沸水浴中10min,記錄620nm處吸光值,根據(jù)標準曲線測定可溶性糖的含量,單位為mg/gFW[21].

1.6 過氧化氫(H2O2)含量的測定、抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX)活性與丙二醛(MDA)含量的測定

參照文獻[22]所報道方法,取黃芪幼根加入1mL 0.1%(/)的三氯乙酸(TCA),研磨至勻漿,離心(12000r/min,10min);取0.7mL上清液,加入0.7mL磷酸緩沖液(PBS,10mmol/L, pH值7.0)和1.4mL碘化鉀[KI, 1mol/L,用PBS (10mmol/L、pH值7.0)配制],記錄390nm處吸光值,并根據(jù)標準曲線計算過氧化氫含量,單位為μmol/gFW.

SOD(超氧化物歧化酶)活性的測定采用氮藍四唑(NBT)法進行,SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位(U/mg FW·min); POD(過氧化物酶)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法進行,POD活性以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個POD活性單位[U/(mgFW·min)];CAT(過氧化氫酶)活性采用紫外分光光度法進行,CAT活性以1min內(nèi)A240減少0.1為1個CAT活性單位[U/(mgFW·min)]; APX(抗壞血酸過氧化物酶)活性的測定采用紫外分光光度法進行,以2min內(nèi)A290的變化計算APX活性[U/(mgFW·min)][23].

參照文獻[24]所報道的硫代巴比妥酸法進行MDA含量的測定,如式(1):

MDA(μmol/L)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450 (1)

再將樣品提取液中MDA濃度換算為植物單位質(zhì)量中MDA的含量,單位為μmol/g FW.

1.7 根尖膜損傷程度的測定

根尖膜損傷程度的測定參照文獻[25]等報道的伊文思藍染色法進行.

1.8 葉片葉綠素熒光參數(shù)與葉綠素含量的測定

采用葉綠素熒光成像儀(PAM-2500Waltz, Germany),參照文獻[4]所報道的方法進行葉綠素熒光參數(shù)的測定:v￠/m￠為光適應下PS II潛在最大光化學效率;Y(II)為PS II實際光化學量子效率,反映PS II反應中心的原初光能捕獲效率;qP為光化學淬滅系數(shù),反映PS II反應中心的開放程度和電子傳遞活性;ETR為PS II的相對電子傳遞速率;NPQ為非光化學淬滅系數(shù),表征PS II反應中心吸收過量光能后的熱耗散能力以及光合機構(gòu)的損傷程度.

取剪碎的黃芪去葉脈葉片,加入3mL 80%(/)的丙酮,于4℃冰箱密閉遮光放置24h以上,待葉片完全變白為止,于663、645nm下測定吸光值,計算葉綠素濃度,再換算成質(zhì)量(mg/gFW)[4].

1.9 統(tǒng)計學分析

以上測量取3次以上獨立實驗結(jié)果的平均值,并將數(shù)值表示為平均值±標準偏差(SD).使用Origin 9.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行雙總體檢驗和圖表的繪制(差異顯著,<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 CuSO4脅迫下黃芪幼苗根系和葉片中Cu2+含量的變化

由表1可見,隨著CuSO4脅迫濃度的增加,黃芪幼苗根系與葉片中Cu2+含量逐漸升高,并且呈現(xiàn)一定的劑量效應關系.此外,根系中Cu2+含量明顯高于葉片.與對照相比,20mmol/LCuSO4脅迫24h后,根系和葉片中Cu2+含量相較對照分別顯著提高了12.83倍和6.11倍.

表1 CuSO4脅迫下黃芪幼苗根系與葉片中Cu2+ 含量的變化

注:數(shù)值為至少3次獨立實驗的平均值±標準差,不同字母表示每列各處理數(shù)值間在<0.05水平上存在顯著性差異;CK:對照,T1: 2mmol/L CuSO4處理,T2:8mmol/L CuSO4處理,T3:15mmol/L CuSO4處理,T4:20mmol/L CuSO4處理,下同.

2.2 CuSO4脅迫對黃芪幼苗根系活性氧水平、抗氧化酶活性和膜損傷程度的影響

表2 CuSO4脅迫對黃芪幼苗根系過氧化氫含量、抗氧化酶活性、膜脂質(zhì)過氧化程度及膜損傷程度的影響

與對照相比(表2),2mmol/L CuSO4脅迫處理未對黃芪幼苗根系SOD活性、POD活性、APX活性和根尖膜損傷程度造成顯著影響,但是顯著提高了CAT活性、H2O2和MDA含量.當CuSO4濃度達8mmol/L時,根系SOD活性、POD活性、CAT活性、H2O2含量、MDA含量和根尖膜損傷程度顯著上升,但未對APX活性產(chǎn)生顯著影響.隨著CuSO4濃度的進一步升高,根系SOD活性、H2O2含量、MDA含量和根尖膜損傷程度進一步提高,而POD,CAT和APX活性則顯著降低.與對照相比,20mmol/L CuSO4脅迫處理24h后,根系SOD活性、H2O2含量、MDA含量和根尖膜損傷程度較對照分別顯著提高了6.41倍、1.73倍、3.37倍、1.31倍,而POD、CAT和APX活性則分別顯著降低了21.15%、50.00% 和77.55%.

2.3 CuSO4脅迫對黃芪幼苗葉片PS II光化學活性和葉綠素含量的影響

與對照相比(表3),2mmol/L CuSO4處理未對黃芪幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)v'/m'、Y(II)、qP、ETR、NPQ和qN以及葉綠素含量造成顯著影響.當CuSO4脅迫濃度達8mmol/L時,Y(II)、qP、ETR和葉綠素含量較對照顯著降低,而葉片NPQ和qN水平則顯著升高.隨著CuSO4處理濃度進一步增加,葉片PS II 光化學活性和葉綠素含量進一步降低.相較對照組,20mmol/L CuSO4處理 24h 后,葉片v'/m'、Y(II)、qP、ETR和葉綠素含量較對照分別顯著下降了13.04%、49.88%、43.76%、48.32%和46.98%,而NPQ 和 qN則分別顯著提高了3.18倍和1.89倍.

表3 CuSO4脅迫對黃芪幼苗葉片 PS II 光化學活性和葉綠素含量的影響

2.4 CuSO4脅迫對黃芪幼苗生長、根系可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

由表4可見,15~20mmol/L CuSO4處理使得黃芪幼苗全株干重和鮮重較對照顯著降低;與對照相比,8~20mmol/L CuSO4處理使得地下部干重和鮮重顯著降低;20mmol/L CuSO4脅迫24h后,黃芪幼苗全株干重、全株鮮重、地下部干重、地下部鮮重較對照分別顯著下降了64.15%、61.19%、59.53%、71.42%;此外,與對照相比,2~ 20mmol/L CuSO4處理未引起幼苗株高和根長的顯著變化.

相較對照組,2~8mmol/L CuSO4處理使得黃芪幼苗根系可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著上升,且在8mmol/L CuSO4處理下達最大值;其后隨CuSO4脅迫濃度的進一步提高,可溶性蛋白和可溶性糖含量低于對照水平.20mmol/L CuSO4脅迫24h后,根系可溶性蛋白和可溶性糖含量較對照分別顯著降低了71.67%和71.91%(表4).

表4 CuSO4脅迫對黃芪幼苗生長、根系可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

2.5 CuSO4脅迫下APT對黃芪幼苗根系和葉片中Cu2+含量的影響

圖2 CuSO4脅迫下APT對黃芪幼苗根系與葉片中Cu2+含量的影響

數(shù)值為至少3次獨立實驗的平均值±標準差,不同字母表示各處理數(shù)值間在<0.05水平上存在顯著性差異;+或–表示基質(zhì)中有無APT或CuSO4;下同

由圖2A~B可見,20mmol/L CuSO4脅迫24h后,黃芪幼苗根系和葉片中Cu2+含量較之對照顯著上升.與對照相比,基質(zhì)中APT的存在未對幼苗根系和葉片中Cu2+含量造成顯著影響;CuSO4脅迫條件下,基質(zhì)中APT的存在則使得幼苗根系和葉片中Cu2+含量顯著降低了30.78%和23.12%.

2.6 CuSO4脅迫下APT黃芪幼苗根系活性氧水平、抗氧化酶活性和質(zhì)膜損傷程度的影響

由圖3A-G可見,與對照相比,基質(zhì)中APT的存在未對黃芪幼苗根系H2O2含量,SOD、POD、CAT和APX活性以及根尖質(zhì)膜損傷程度造成顯著影響,但使得MDA含量顯著降低了15.93%. 20mmol/L CuSO4脅迫條件下,基質(zhì)中APT的存在使得幼苗根系H2O2含量、MDA含量、根尖質(zhì)膜損傷程度和SOD活性分別顯著降低了12.07%、19.74%、11.62%和32.79%,而POD、CAT和APX活性則分別顯著提高了1.26倍、3.33倍和2.25倍.

2.7 CuSO4脅迫下APT對黃芪幼苗葉片PS II光化學活性和葉綠素含量的影響

由圖4A~G可見,基質(zhì)中APT的存在未對黃芪幼苗葉v'/m'、Y(II)、qP、ETR、qN、NPQ及葉綠素含量造成顯著影響.20mmol/L CuSO4脅迫下,基質(zhì)中APT的存在使得葉片v'/m'、Y(II)、qP、ETR、葉綠素含量分別顯著提高了1.15倍、1.43倍、1.28倍、1.49倍和1.28倍,而qN和NPQ則分別顯著下降了12.77%和27.59%.

2.8 CuSO4脅迫下APT黃芪幼苗生長、根系可溶糖和可溶性蛋白含量的影響

與對照相比,基質(zhì)中APT存在使得幼苗全株鮮重、全株干重、地下部鮮重、地下干重、根系可溶性蛋白和可溶性糖含量雖有一定程度的提高,但影響不顯著(圖5B-C, E-H).20mmol/L CuSO4脅迫條件下,基質(zhì)中APT的存在使得幼苗全株鮮重、全株干重、地下部鮮重、地下部干重、根系可溶性蛋白和可溶性糖含量分別顯著提高了1.53倍、1.42倍、1.63倍、1.37倍、2.34倍和1.50倍(圖 5B-C, E-H).然而,不同處理之間黃芪幼苗株高和根長較對照組未發(fā)生顯著變化(圖5A,D).

3 討論

Cu2+作為植物體必需的微量元素和許多生化酶的組成成分,低濃度下有利于植物體的生理代謝,而高濃度Cu2+對植物體具有一定的毒性[26].已有研究表明,Cu2+對植物體的毒害作用主要表現(xiàn)為通過Fenton或Haber-Weiss反應或刺激NAPDH氧化酶誘導ROS的產(chǎn)生[27],ROS的過量積累,會對植物體產(chǎn)生氧化脅迫,繼而造成細胞膜質(zhì)過氧化,生物膜透性增大,甚至生長抑制;而SOD,POD,CAT,APX作為植物體活性氧清除系統(tǒng)中的關鍵酶,能防止ROS引起的膜脂質(zhì)過氧化,保護細胞膜系統(tǒng)免受氧化脅迫的損傷;同時,其活性的變化也是表征植物氧化脅迫的重要指標[28].在本實驗中,隨著CuSO4脅迫濃度的增加,幼苗根系(植物體接觸環(huán)境脅迫因素的最初器官,也是黃芪主要的藥用部位)Cu2+含量顯著上升并呈現(xiàn)一定的劑量效應關系(表1);同時,根系H2O2含量、MDA含量、根尖膜損傷程度和SOD活性逐漸升高;POD和CAT活性隨著CuSO4脅迫濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,其活性在8mmol/L CuSO4脅迫處理下達最大值;APX活性則隨著CuSO4脅迫濃度的提高而降低(表2).這表明:1)幼苗根系Cu2+含量的提高,使得H2O2過量積累,對幼苗根系造成了氧化脅迫,繼而導致根系細胞膜透性增大;2)H2O2的過量積累使得幼苗通過啟動體內(nèi)抗氧化酶防御系統(tǒng)來提高對Cu2+脅迫環(huán)境的抗性.研究表明,Cu2+對抗氧化酶活性的影響可能同時表現(xiàn)為促進和抑制兩個方面[29].一方面,Cu2+通過提高抗氧化酶在轉(zhuǎn)錄水平的表達,誘導同工酶的表達,以及對酶蛋白結(jié)構(gòu)進行加工與修飾等途徑,提高酶的活性;另一方面,Cu2+脅迫下ROS的過量積累會通過破壞DNA、RNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),繼而破壞抗氧化酶的表達系統(tǒng)和結(jié)構(gòu),造成酶活性降低.因此,推測本實驗中SOD,POD,CAT活性的提高可能與幼苗根系適應Cu2+誘導ROS增加有關,而隨著CuSO4脅迫濃度的提高POD,CAT以及APX活性下降則可能是細胞中過量Cu2+可能直接作用于酶蛋白或影響基因表達的結(jié)果.此外,可溶性蛋白和可溶性糖作為植物體的主要構(gòu)成組分之一,是植物體進行新陳代謝的主要原料和貯存物質(zhì),其含量是評價植物總代謝水平的重要指標;同時,可溶性蛋白和可溶性糖也是植物體應對逆境的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[30-31].研究發(fā)現(xiàn),逆境條件下植物體內(nèi)可溶糖和可溶性蛋白含量的提高與其參與ROS 清除有關[32-33],而在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)其含量的變化并未與ROS變化趨勢保持一致,具體表現(xiàn)為幼苗根系可溶性蛋白與可溶性糖含量在CuSO4脅迫為8mmol/L時達最大值,其后隨著CuSO4脅迫濃度的上升,可溶性蛋白與可溶性糖含量下降至低于對照水平(表4).這表明當CuSO4脅迫濃度低于8mmol/L時,幼苗通過調(diào)節(jié)根系可溶性蛋白與可溶性糖含量來維持幼苗根系細胞滲透濃度和保水力,繼而提高幼苗對Cu2+脅迫環(huán)境的抗性,而當CuSO4濃度超過8mmol/L時,CuSO4脅迫可能造成了對可溶性蛋白與可溶性糖合成部位的不可逆損傷.

研究表明,根系中過量的H2O2會被轉(zhuǎn)移至葉片中,對葉片造成氧化脅迫,繼而導致光合作用能力下降[29],而PS II光化學活性的變化可以積極反映環(huán)境因素對植物體光合作用內(nèi)在過程造成的影響[4].因此,本研究探究了CuSO4脅迫對黃芪幼苗葉片PS II光化學活性和葉綠素含量的影響.研究發(fā)現(xiàn),隨著幼苗葉片中Cu2+水平的提高,葉片PS II光化學活性被顯著抑制,具體表現(xiàn)為隨CuSO4脅迫濃度的升高,葉片v'/m'、Y(II)、qP 和 ETR 顯著降低,而qN和NPQ則顯著升高(表1,3),表明CuSO4脅迫使黃芪幼苗葉片PS Ⅱ容量下降,對光能的吸收和運行效率降低,PS Ⅱ接受和傳遞電子的能力下降,同時用于光化學反應的光能比例減少,而以熱的形式耗散掉的比例顯著增加.前人的研究表明,過量的Cu2+會通過改變植物體PS II氧化側(cè)或PS II還原側(cè)一些電子傳遞相關蛋白的結(jié)構(gòu),破環(huán)PS II電子正常傳遞[34-36],繼而導致PS II光化學活性降低.因此,CuSO4脅迫可能通過上述機制引起了幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的變化.此外,研究發(fā)現(xiàn)[1,37]過量的 Cu2+會干擾與葉綠素生物合成有關的酶活性,造成葉綠體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)遭破壞,葉綠素氧化分解加快,從而降低植物PS II光化學活性;研究指出,Cu2+能夠取代葉綠體中蛋白質(zhì)上的Fe2+或Mg2+來破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能,造成葉綠素的降解,從而導致PS II對光能利用率的降低,造成光抑制的發(fā)生[38].本研究結(jié)果表明,隨著CuSO4脅迫濃度的提高,幼苗葉片葉綠素含量顯著下降(表3),這說明CuSO4脅迫下幼苗葉片PS II光化學活性降低是Cu2+對PS II中電子傳遞體的功能以及葉綠素含量綜合作用的結(jié)果.

植物幼苗期生物量的變化是判斷種苗生長狀況的重要指標,而Cu2+脅迫對幼苗產(chǎn)生的氧化壓力以及對光合作用的抑制,最終將引起幼苗生長抑制.本實驗發(fā)現(xiàn),15~20mmol/LCuSO4脅迫24h后,黃芪幼苗全株鮮重和干重以及地下部干重和鮮重顯著下降,說明該濃度范圍內(nèi)CuSO4脅迫引起了黃芪幼苗的生長抑制;而在受試CuSO4脅迫濃度范圍(2~20mmol/L),黃芪幼苗生長指標(株高和根長)未受明顯影響,推測可能與CuSO4脅迫時間過短有關(表4).

上述研究結(jié)果表明,CuSO4脅迫提高了黃芪幼苗根系和葉片中Cu2+含量,誘導了幼苗根系ROS過量積累,干擾了根系抗氧化酶正常活性水平,破環(huán)了根系細胞膜系統(tǒng)完整性,降低了葉片PS II光化學活性和葉綠素含量,最終影響了幼苗生長.已有研究表明, APT能夠有效改善基質(zhì)團粒結(jié)構(gòu),增加基質(zhì)保水透水能力,并且能夠通過陽離子交換、表面絡合、靜電作用等多種形式吸附環(huán)境中游離的Cu2+[12-17].本實驗結(jié)果表明,非CuSO4脅迫條件下,基質(zhì)中APT的存在顯著降低了根系膜脂質(zhì)過氧化程度(圖3B),但未對其它所測生理學指標產(chǎn)生顯著影響,推測這可能是APT優(yōu)異的物理化學性質(zhì)使得黃芪在幼苗生長階段的代謝廢物被有效吸附且在一定程度上增強了栽培基質(zhì)的通氣性和透水性所致;在20mmol/LCuSO4脅迫下,基質(zhì)中APT的存在使得黃芪幼苗根系和葉片中的Cu2+含量顯著降低,繼而緩解了CuSO4脅迫對黃芪幼苗的生理學毒性作用(圖2-5),這表明CuSO4脅迫下APT對黃芪幼苗生理學代謝的保護作用歸因于其降低了組織中Cu2+的生物有效性.

4 結(jié)論

4.1 2mmol/L CuSO4脅迫24h后顯著提高了黃芪幼苗根系Cu2+水平,并且使得根系H2O2含量和丙二醛含量也顯著上升,說明Cu2+脅迫對黃芪幼苗的早期毒害響應主要為誘導ROS的過量積累.在CuSO4脅迫濃度達8mmol/L,根尖膜損傷程度、根系抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性以及可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著上升;同時,8mmol/LCuSO4脅迫下葉片Cu2+水平顯著上升,并且使得葉片PS II光化學活性和葉片葉綠素含量開始顯著下降;說明該濃度對幼苗形成了氧化脅迫,并引起了光合抑制.在CuSO4脅迫濃度高達15~20mmol/L時,顯著降低了根系APX活性,并且引起了幼苗生長抑制.綜上,短期高濃度Cu2+脅迫環(huán)境對黃芪幼苗生理學代謝的主要毒害機制為引起ROS的過量積累,繼而使其生理學代謝反應發(fā)生紊亂,最終影響幼苗生長,并且CuSO4脅迫濃度為20mmol/L時對幼苗生理學反應和生長的影響最顯著.

4.2 基質(zhì)中APT的存在通過降低幼苗組織中Cu2+的生物有效性緩解了CuSO4對幼苗的生理學脅迫作用.此外,APT作為一種天然的非金屬黏土礦物,儲量豐富,價格低廉,且本身就是生態(tài)系統(tǒng)中的自身組分而不具有毒性,因此其有望作為一種植物栽培基質(zhì)的外源添加劑,應用于黃芪等藥用植物的生態(tài)種植中.

[1] Vinit-Dunand F, Epron D, Alaoui-Sosse B, et al. Effects of copper on growth and on photosynthesis of mature and expanding leaves in cucumber plants [J]. Plant Science, 2002,163(1):53-58.

[2] Alaouisosse B, Genet P, Vinitdunand F, et al. Effect of copper on growth in cucumber plants (Cucumis sativus) and its relationships with carbohydrate accumulation and changes in ion contents [J]. Plant Science, 2004,166(5):1213-1218.

[3] Zhao S L, Liu Q, Qi Y T, et al. Responses of root growth and protective enzymes to copper stress in turfgrass[J]. Acta Biologica Cracoviensia, 2010,52(2):7-11.

[4] Zhang M D, Ran R L, SaiNao W Q, et al. Physiological effects of short-term copper stress on rape (Brassica napus L.) seedlings and the alleviation of copper stress by attapulgite clay in growth medium [J]. Ecotoxicology and Environmental safety, 2019,171(30):878-886.

[5] 姜志艷,王建英,楊雪梅.銅、鉛、鋅對黃芪生長及其DNA損傷的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報, 2013,44(2):205-209. Jiang Z Y, Wang J Y, Yang X M. Effect of copper, lead and zinc on growth of(Fisch.) Bge.Varmongholicus (Bge.) Hsiao and its DNA damage [J]. Journal of Southern Agriculture, 2013,44(2):205-209.

[6] 趙 蓉.我國8種中藥材重金屬污染的系統(tǒng)評價[D]. 北京:北京中醫(yī)藥大學, 2016. Zhao R. Systematic evaluation of heavy metal pollution of eight chinese herbal medicines in china [D]. Beijing: BeiJing University of Chinese Medicine, 2016.

[7] 武 征.重金屬脅迫對夏枯草主要生理特性和內(nèi)在品質(zhì)的影響[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學, 2009. Wu Z. Effects of heavy metals stress on primary physiological characteristics the internal quality of Prunella vulgaris L [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2009.

[8] Baurand P E, Capelli N, De V A. Genotoxicity assessment of pesticides on terrestrial snail embryos by analysis of random amplified polymorphic DNA profiles [J]. Journal of Hazardous Materials, 2015, 298:320-327.

[9] Liu H, Cao Y, Li W, et al. The effects of cadmium pulse dosing on physiological traits and growth of the submerged macrophyte Vallisneria spinulosa and phytoplankton biomass: a mesocosm study [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2017,24(18): 15308-15314.

[10] Rafiq M K, Joseph S D, Li F, et al. Pyrolysis of attapulgite clay blended with yak dung enhances pasture growth and soil health: characterization and initial field trials [J]. Science of Total Environment, 2017,607-608(31):184-194.

[11] 黎 珊,戴紅旗,孔 泳,等.凹凸棒土的應用研究進展[J]. 化工進展, 2013,32(12):2934-2939. Li S, Dai H Q, Kong Y, et al. Research progress of attapulgite's application [J]. Chemical Industry and Engineering Progress, 2013, 32(12):2934-2939.

[12] 范如芹,羅 佳,高 巖,等.凹凸土對無土栽培基質(zhì)性能及番茄育苗的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報, 2015,31(4):792-797. Fan R J, Luo J, Gao Y, et al. Effects of attapulgite on the properties of soilless substrate and performance of tomato seedling [J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2015,31(4):792-797.

[13] 任旭琴,高 軍,陳伯清,等.凹土對辣椒自毒作用修復的生理生化機制研究[J]. 土壤, 2014,46(5):908-912. Ren X Q, Gao J, Chen B Q, et al. Physiological and biochemical mechanisms of attapulgite clay on alleviation to autotoxicity in pepper [J]. Soils, 2014,46(5):908-912.

[14] 劉左軍,陳正宏,袁惠君,等.凹凸棒石黏土對土壤團粒結(jié)構(gòu)及小麥生長的影響[J]. 土壤通報, 2010,41(1):142-144. Liu Z J, Chen Z H, Yuan H J, et al. Effects of attapulgite clay on soil aggregate and wheat growth [J]. Chinese journal of Soil Science, 2010, 41(1):142-144.

[15] Xu Y, Liang X F, Xu Y M, et al. Remediation of heavy metal-polluted agricultural soils using clay minerals: a review [J]. Pedosphere, 2017, 27(2):193-204.

[16] 陳 浩.凹凸棒黏土改性及其吸附性能研究[D]. 蘭州:中國科學院蘭州化學物理研究所, 2007. Chen H. Study on modification of palygorskite clay and relevant absorption property [D]. Lanzhou: Lanzhou Institute of Chemical Physics, 2007.

[17] 任靜華,廖啟林,范 健,等.凹凸棒黏土對鎘污染農(nóng)田的原位鈍化修復效果研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 2017,26(12):2162-2168. Ren J H, Liao Q L, Fan J, et al. Effect of in-situ stabilizing remediation of Cd-polluted soil by attapulgite [J]. Ecology and Environment Sciences, 2017,26(12):2162-2168.

[18] Yang W D, Wang Y Y, Zhao F L, et al. Variation in copper and zinc tolerance and accumulation in 12willow clones: implications for phytoextraction[J]. Journal of Zhejiang University Science B, 2014, 15(9):788-800.

[19] Lin Y R, Schertz K F, Paterson A H. Comparative analysis of QTLs affecting plant height and maturity across the Poaceae, in reference to an interspecific sorghum population[J]. Genetics, 1995,141(1):391- 411.

[20] Elise S, Etienne-Pascal J, Fernanda C N D, et al. The medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1 -like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length[J]. Plant Molcular Biology, 2005,58(6):809-822.

[21] Anjorin F B, Adejumo S A, Agboola L, et al. Proline, soluble sugar, leaf starch and relative water contents of four maize varieties in response to different watering regimes[J]. Cercetari Agronomice in Moldova, 2016,49(3):51-62.

[22] Sergiev I, Alexieva V, Karanov E. Effect of spermine, atrazine and combination between them on some endogenous protective systems and stress markers in plants [J]. Compt Rend Acad Bulg Science, 1997, 51(3):121-124.

[23] Li X N, Yang Y L, Jia LY, et al. Zinc-induced oxidative damage, antioxidant enzyme response and proline metabolism in roots and leaves of wheat plants[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2013,89(11):150-157.

[24] Dogan M, Yumrutas O, SaygiDeger S D, et al. Effects of bisphenol A and tetrabromobisphenol A on chickpea roots in germination stage [J]. American-Eurasian Journal of Agricultural and Environmental Sciences, 2010,9(2):186-192.

[25] Hung W C, Huang D D, Chien P, et al. Protein tyrosine dephosphorylation during copper-induced cell death in rice roots [J]. Chemosphere, 2007,69(1):55-62.

[26] Thounaojam T C, Panda P, Mazumdar P, et al. Excess copper induced oxidative stress and response of antioxidants in rice [J]. Plant Physiology and Biochenmisry, 2012,53:33-39.

[27] Bai J Y, Feng H Q, Guan D D, et al. Extracellular ATP affects the copper-induced cell death and H2O2production [J]. Journal of East China Normal University (Natural Science), 2016,2016(3):103-113.

[28] Zhang F Q, Wang Y S, Lou Z P, et al. Effect of heavy metal stress on antioxidative enzymes and lipid peroxidation in leaves and roots of two mangrove plant seedlings (Kandelia candel and Bruguiera gymnorrhiza) [J]. Chemosphere, 2007,67(1):44-50.

[29] 胡筑兵,陳亞華,王桂萍,等.銅脅迫對玉米幼苗生長、葉綠素熒光參數(shù)和抗氧化酶活性的影響[J]. 植物學通報, 2006,23(2):129-137. Hu Z B, Chen Y H, Wang G P, et al. Effects of copper stress on growth chlorophyll fluorescence parameters and antioxidant enzyme activities of zea mays seedlings [J]. Chinese Bulletin of Botany, 2006, 23(2):129-137.

[30] Chai M W, Shi F C, Li R L, et al. Growth and physiological responses to copper stress in a halophyte Spartina alterniflora (Poaceae) [J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2014,36(3):745-754.

[31] 杜 曉,申曉輝.鎘脅迫對珊瑚樹和地中海莢蒾生理生化指標的影響[J]. 生態(tài)學雜志, 2010,29(5):899-904. Du X, Shen X H. Effects of cadmium stress on physiological and biochemical indices ofandseedlings [J]. Chinese Journal of Ecology, 2010,29(5):899-904.

[32] Hanson J, Smeekens S. Sugars perception signaling- an update [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2009,12(5):562-567.

[33] Wang H, Shan X Q, Wen B, et al. Responses of antioxidative enzymes to accumulation of copper in a copper hyperaccumulator of[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2004,47(2):185-192.

[34] Bohner H, Bohme H, Boger P. Reciprocal formation of plastocyanin and cytochrome c-553 and the influence of cupric ions on photosynthetic electron transport [J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 1980,592(1):103-112.

[35] Hsu B D. Toxic effects of copper on photosystem II of spinach chloroplasts [J]. Plant Physiology, 1988,87(1):116-119.

[36] Samuelsson G, Oquist G. Effects of copper chloride on photosynthetic electron transport and chlorophyll-protein complexes of Spinacia oleracea [J]. Plant and Cell Physiology, 2012,21(3):445-454.

[37] Singh D, Nath K, Sharma Y K. Response of wheat seed germination and seedling growth under copper stress [J]. Journal of Environmental Biology, 2007,28(2):409-14.

[38] Abadia J, Morales F, Abadía A. Photosystem II efficiency in low chlorophyll, iron-deficient leaves [J]. Plant and Soil, 1999,215(2): 183-192.

Physiological toxicity of copper stress onseedlings and mitigation of attapulgite clay.

SAINAO Wang-qing, RAN Rui-lan, ZHANG Mu-dan, CAO Jia-xin, FENG Han-qing*, PANG Hai-long, JIA Ling-yun

(College of Life Sciences, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China)., 2019,39(12)：5273~5284

In order to explore the mechanism of the resistance ofseedlings to stress of copper ion (Cu2+) and the mitigative effects of attapulgite clay on Cu2+pollution, the physiological toxicity of CuSO4(2~20mmol/L) toseedlings and the alleviative effects of attapulgite clay on such physiological toxicity were investigated. The results showed that, after treatment with 2mmol/L CuSO4, the Cu2+content, H2O2(hydrogen peroxide) content, and MDA (malondialdehyde) content of roots were significantly increased by 1.82, 1.04 and, 2.14 folds, respectively, compared to the controls. After treatment with 8mmol/L CuSO4, the SOD (superoxide dismutase) activity in the roots,the degree of damages on root apical membrane, and leaf Cu2+content were significantly increased by 1.13, 1.12, and 2.62 folds, respectively, compared to the controls. Under the stress of 8mmol/L CuSO4, the Y(Ⅱ) (photochemical quantum yield of PS Ⅱ), qP (photochemical quenching coefficient), ETR (the rate of non-cyclic electron-transport through PS Ⅱ), and chlorophyll content of the leaves significantly decreased by 22.88%, 24.44%, 21.49%, and 8.31%. While the NPQ and qN (non-photochemical quenching) of the leaves was significantly increased by 2.35 and 1.58 fold, respectively, compared with controls. The POD (peroxidase) activity, CAT (catalase) activity, and soluble protein and sugar content of roots reached maximum at 8mmol/L CuSO4and decreased afterwards. CuSO4at the concentrations as high as 15~20mmol/Lcaused the significant decreases of the APX (ascorbate peroxidase) activity of roots, maximum photochemical efficiency of PS II under light adaptation (v￠/m￠) of leaves, and fresh or dry weight of whole seedlings and below-ground parts. Under the condition without CuSO4stress, the presence of attapulgite clay in the growth substrate made the MDA content of roots significantly decreased by 15.93% but did not affect other physiological indicators. Under the stress of 20mmol/LCuSO4, attapulgite clay made the Cu2+content in roots and leaves significantly decreased by 30.78% and 23.12%, respectively. In addition, it alleviated the effects of CuSO4on the production of reactive oxygen species antioxidant enzyme activities, membrane lipid peroxidation, the degree of damage on root apical membrane, and the content of soluble protein and sugar of roots. The presence of attapulgite clay in the growth also effectively alleviated the inhibition ofPS II photochemical activity, chlorophyll content, and growth of the seedlings under CuSO4stress. These results suggested thatattapulgite clay in the growth medium could effectively alleviate the CuSO4- induced physiological toxicity toseedlings through reducing the bioavailability of Cu2+in seedlings.

copper ion；seedlings；attapulgite clay；alleviation

X53

A

1000-6923(2019)12-5273-12

賽鬧汪青(1993-),男,藏族,甘肅迭部人,西北師范大學生命科學學院碩士研究生,研究方向為逆境植物生理生態(tài).

2019-05-10

國家自然科學基金資助項目(31870246,31560070);甘肅省重點研發(fā)計劃項目(17YFINA064,18YF1NA051);甘肅省高校基本科研業(yè)務費;西北師范大學青年創(chuàng)新團隊項目

* 責任作者, 教授, 博導, fenghanq@nwnu.edu.cn