查蒙，管維良，茅林春

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）（又稱南美白對(duì)蝦）營(yíng)養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美，是我國(guó)最主要的養(yǎng)殖蝦類。2016年我國(guó)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦總產(chǎn)量超過(guò)93萬(wàn)噸，比2015年增長(zhǎng)4.38%[1]。我國(guó)地域廣闊，水產(chǎn)品運(yùn)輸耗時(shí)長(zhǎng)，?；铍y度大。目前市場(chǎng)鮮活魚蝦等水產(chǎn)的運(yùn)輸方式主要為有水運(yùn)輸，受季節(jié)、溫度、運(yùn)輸距離影響較大，運(yùn)輸?shù)某杀靖?、效率低[2]。

采用無(wú)水運(yùn)輸可以減輕運(yùn)輸重量，減少容器體積，有效降低運(yùn)輸成本，特別適用于快遞和航空運(yùn)輸[3]。無(wú)水運(yùn)輸時(shí)，水產(chǎn)品暴露在空氣和低溫環(huán)境中，受到刺激和脅迫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[4-5]。短暫的應(yīng)激很快能恢復(fù)，但長(zhǎng)期的應(yīng)激會(huì)損傷機(jī)體的免疫、代謝系統(tǒng)，甚至危害健康，導(dǎo)致死亡，更影響水產(chǎn)品的品質(zhì)。目前，緩解水產(chǎn)運(yùn)輸應(yīng)激的方法主要為麻醉處理，比如用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸（3-Aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate，MS-222）[6-7]、丁香酚[8]和 CO2[9]等，但這些方法存在藥物劑量難以控制，有殘毒等弊端。

不同甲殼動(dòng)物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理代謝調(diào)節(jié)功能不同，在無(wú)水條件下存活時(shí)間差異很大。有研究表明，相比多數(shù)甲殼動(dòng)物，有些蟹類在無(wú)水的條件下可以存活更長(zhǎng)時(shí)間，這與它們的體型和鰓結(jié)構(gòu)的進(jìn)化密不可分[10]。這些蟹的鰓和甲殼的結(jié)構(gòu)能夠有效防止水分蒸發(fā)，保持鰓的濕潤(rùn)，使其在空氣中依然可以正常獲取氧氣[11-12]。山梨醇是一種由葡萄糖還原生成的小分子糖醇，易溶于水，水溶液為透明黏稠的液體。山梨醇的分子結(jié)構(gòu)中含有親水基團(tuán)羥基，具有一定的吸濕性。前期研究表明，3.5%山梨醇溶液浸泡處理可以有效提高凡納濱對(duì)蝦的無(wú)水存活率。本試驗(yàn)分析凡納濱對(duì)蝦在模擬無(wú)水?；钸\(yùn)輸中血清和肝胰腺生理生化變化規(guī)律，重點(diǎn)從呼吸和能量代謝的角度研究山梨醇對(duì)凡納濱對(duì)蝦的影響，為有效減緩凡納濱對(duì)蝦的應(yīng)激脅迫傷害，提高無(wú)水?；钸\(yùn)輸效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對(duì)蝦購(gòu)于杭州市蕭山喬四養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量（12.86±0.80）g，體長(zhǎng)（13.94±2.55）cm。試驗(yàn)前連續(xù)充氣暫養(yǎng)12 h[水溫（18±2）℃，鹽度 35 g/L]，棄用死蝦和活力差的蝦。

山梨醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉二水合物（EDTA-2Na-2H2O）、蔗糖、鹽酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）試劑盒、血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、乳酸試劑盒、肝糖原試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

722E型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；MB16-414酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司；S-20氧氣泵：浙江寧波賽爾電氣有限公司；氧氣罐：杭州電化集團(tuán)燃?xì)庥邢薰?；M10557全自動(dòng)氣調(diào)包裝機(jī)：北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；CP II O2/CO2氣體分析儀：丹麥丹圣（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

凡納濱對(duì)蝦隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組30尾對(duì)蝦，設(shè)置4個(gè)平行。分別在13℃的3.5%山梨醇溶液或清水（對(duì)照）中浸泡（冷擊）3 min，至全部對(duì)蝦側(cè)臥水底呈休眠狀態(tài)。休眠的對(duì)蝦每30只一組裝入聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）袋（220 mm×320 mm）充純氧后密封，置于恒溫箱（15℃）中模擬無(wú)水運(yùn)輸。10 h后將全部對(duì)蝦轉(zhuǎn)移至20℃～25℃的清水中復(fù)蘇至能夠游動(dòng)。

1.4 取樣與指標(biāo)測(cè)定

血淋巴采集及血清的制備：用吸水紙吸干對(duì)蝦體表水分，用一次性1 mL無(wú)菌注射器從對(duì)蝦的頭胸甲與第一腹節(jié)間插入至心臟抽取血淋巴，每10只對(duì)蝦的血淋巴合并，注入1.5mL離心管中。4℃靜置過(guò)夜后于4℃、800×g離心10 min，去除血細(xì)胞，取上層清液即為血清，分裝并儲(chǔ)存于-80℃冰箱中，用于測(cè)定血藍(lán)蛋白、乳酸和血糖含量及LDH活力。

肝胰腺采集以及勻漿制備：用吸水紙吸干對(duì)蝦體表水分，在冰盤上迅速解剖取出肝胰腺，用少量冰冷的生理鹽水（0.86%）漂洗去除血液，濾紙吸干水分后放入1.5 mL離心管中，迅速放入液氮中，保存于-80℃冰箱中待測(cè)。取解凍的肝胰腺0.2 g～1.0 g至小燒杯，加入9倍肝胰腺重量的預(yù)冷勻漿介質(zhì)（pH7.4，0.01 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%氯化鈉溶液）。冰浴下用均漿機(jī)研磨制成10%組織勻漿（勻漿時(shí)間10 s/次，間隙30 s，連續(xù)3次～5次）。取勻漿在4℃以3 000 r/min～5 000 r/min離心10 min～15 min，棄沉淀，取上清液測(cè)定SDH活力和肝糖原含量。

SDH和LDH的活力、乳酸、肝糖原濃度采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。血糖送樣至浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院附屬醫(yī)院檢測(cè)。血漿血藍(lán)蛋白含量的測(cè)定參考Nickerson等[13]的方法并加以改進(jìn)[14]。取解凍的血清樣品10 μL加入990 μL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）混勻，充分震蕩，避免產(chǎn)生氣泡，在波長(zhǎng)334 nm處測(cè)量其吸光度。以PBS緩沖液為空白對(duì)照。

血藍(lán)蛋白濃度用下式計(jì)算：

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用Duncan氏檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 凡納濱對(duì)蝦無(wú)水運(yùn)輸?shù)拇婊盥?/h3>

模擬無(wú)水運(yùn)輸10小時(shí)后，山梨醇組對(duì)蝦的存活率為88.89%，對(duì)照組為71.11%，山梨醇浸泡顯著提高了凡納濱對(duì)蝦無(wú)水運(yùn)輸?shù)拇婊盥剩≒＞0.05）。

2.2 凡納濱對(duì)蝦琥珀酸脫氫酶活力和血藍(lán)蛋白含量的變化

無(wú)水運(yùn)輸過(guò)程中凡納濱對(duì)蝦肝胰腺琥珀酸脫氫酶SDH活力和血清血藍(lán)蛋白含量的變化見圖1。

圖1 無(wú)水運(yùn)輸過(guò)程中凡納濱對(duì)蝦肝胰腺琥珀酸脫氫酶SDH活力和血清血藍(lán)蛋白含量的變化Fig.1 Hepatopancreas SDH activity and serum hemocyanin concentration in L.vannamei during transportation without water

由圖1（A）可知，短時(shí)低溫刺激后，山梨醇組和對(duì)照組間SDH活力差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)蝦休眠10小時(shí)內(nèi)，各組SDH活力逐漸下降；休眠5 h，山梨醇組SDH活力由新鮮狀態(tài)的3.556 U/mg prot降低至2.588 U/mg prot，顯著高于對(duì)照組的1.482 U/mg prot（P＜0.05）；休眠10 h，山梨醇組SDH活力雖繼續(xù)降低，但仍高于對(duì)照組，兩組間差異不顯著（P＞0.05）。復(fù)蘇1 h后，山梨醇組SDH活力恢復(fù)至正常狀態(tài)，對(duì)照組SDH活力未完全恢復(fù)，仍低于新鮮水平。

凡納濱對(duì)蝦血清血藍(lán)蛋白含量變化如圖1（B）所示。新鮮狀態(tài)下凡納濱對(duì)蝦的血清血藍(lán)蛋白含量為17.85 mg/mL；低溫冷擊后，兩組血藍(lán)蛋白含量都顯著升高（P＜0.05），但組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。休眠過(guò)程中，凡納濱對(duì)蝦血清血藍(lán)蛋白含量繼續(xù)升高，并保持在較高水平。休眠5 h，山梨醇組血藍(lán)蛋白含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；休眠10 h兩組血藍(lán)蛋白含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；復(fù)蘇1小時(shí)后，兩組血藍(lán)蛋白含量下降，均恢復(fù)到正常水平。

2.3 凡納濱對(duì)蝦乳酸脫氫酶活力和乳酸濃度的變化

山梨醇對(duì)模擬無(wú)水運(yùn)輸過(guò)程中對(duì)蝦血清LDH活力和乳酸濃度的影響見圖2。

圖2 無(wú)水運(yùn)輸過(guò)程中凡納濱對(duì)蝦血清乳酸脫氫酶LDH活力和乳酸濃度的變化Fig.2 Hepatopancreas LDH activity and serum lactate concentration in L.vannamei during transportation without water

由圖2可知，低溫冷擊后，兩組對(duì)蝦LDH活力都顯著升高（P＜0.05），乳酸濃度升高但變化不顯著（P＞0.05）；休眠5 h，LDH保持升高趨勢(shì)，山梨醇組LDH活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；休眠10 h，山梨醇組和對(duì)照組LDH活力略有下降，但仍為新鮮狀態(tài)的2.63倍和2.59倍。休眠過(guò)程中對(duì)蝦血清乳酸濃度不斷上升，第10小時(shí)達(dá)到最大值，山梨醇組乳酸濃度為2.70 mmol/L，顯著高于對(duì)照組（2.08 mmol/L）（P＜0.05）。在常溫清水中復(fù)蘇1小時(shí)后，兩組對(duì)蝦LDH活力恢復(fù)到正常狀態(tài)，乳酸濃度略有下降但仍高于新鮮水平。整個(gè)模擬運(yùn)輸過(guò)程中，乳酸濃度的變化比LDH活力變化滯后。

2.4 凡納濱對(duì)蝦血糖濃度和肝糖原含量的變化

無(wú)水?；钸\(yùn)輸過(guò)程中凡納濱對(duì)蝦血清葡萄糖濃度和肝糖原含量的變化見圖3。

圖3 無(wú)水?；钸\(yùn)輸過(guò)程中凡納濱對(duì)蝦血清葡萄糖濃度和肝糖原含量的變化Fig.3 Serum glucose level and hepatic glycogen concentration in L.vannamei during transportation without water

從圖3（A）可以看出，無(wú)水運(yùn)輸過(guò)程中凡納濱對(duì)蝦的血糖濃度先升高后下降。新鮮狀態(tài)和短時(shí)冷擊后凡納濱對(duì)蝦的血糖濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）；休眠5 h血糖濃度升高，山梨醇組血糖濃度為對(duì)照組的69.5%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；休眠10 h對(duì)蝦血糖濃度降低，接近正常水平，山梨醇組仍顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。凡納濱對(duì)蝦肝糖原含量的變化見圖3（B）。新鮮狀態(tài)時(shí)，對(duì)蝦的肝糖原含量為5.419 mg/g，冷擊和休眠狀態(tài)時(shí)對(duì)蝦肝糖原含量下降，始終低于新鮮水平。休眠5 h和10 h，山梨醇組肝糖原含量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。恢復(fù)1小時(shí)后，兩組對(duì)蝦肝糖原含量均回升，基本恢復(fù)正常狀態(tài)。

3 討論

3.1 山梨醇對(duì)呼吸代謝的影響

SDH是三羧酸循環(huán)的第一個(gè)脫氫酶，是有氧呼吸的標(biāo)志酶。鰓要與水直接接觸才能發(fā)揮呼吸功能[15]。無(wú)水運(yùn)輸過(guò)程中凡納濱對(duì)蝦暴露于空氣中，會(huì)損傷鰓上皮細(xì)胞等鰓結(jié)構(gòu)，擾亂對(duì)蝦正常攝取氧氣，造成缺氧脅迫。缺氧可調(diào)節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)酶活力，使對(duì)蝦的主要代謝形式由有氧代謝轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧代謝[16]，還會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），引起氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞[17]。無(wú)水運(yùn)輸過(guò)程中，凡納濱對(duì)蝦在休眠的10小時(shí)內(nèi)，山梨醇組SDH活力始終高于對(duì)照組，推測(cè)這一階段山梨醇組對(duì)蝦有氧呼吸強(qiáng)度高，機(jī)體對(duì)氧氣攝取、運(yùn)輸和利用的效率更高。

LDH是生物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無(wú)氧呼吸的關(guān)鍵酶[18]，調(diào)節(jié)乳酸和丙酮酸的相互轉(zhuǎn)化參與能量代謝。乳酸是無(wú)氧代謝的終產(chǎn)物[19]，其含量常被用于評(píng)價(jià)動(dòng)物的無(wú)氧代謝[20]。Maruo等[21]的研究表明，受到缺氧脅迫的羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）氧氣消耗量降低，血淋巴內(nèi)乳酸和CO2積累。試驗(yàn)中對(duì)蝦休眠過(guò)程中，山梨醇組LDH活力和乳酸含量均高于對(duì)照組，說(shuō)明此時(shí)對(duì)蝦無(wú)氧呼吸加速進(jìn)行，代謝終產(chǎn)物在血液中積累。有研究發(fā)現(xiàn)甲殼動(dòng)物從無(wú)水環(huán)境回到水環(huán)境時(shí)需要經(jīng)歷一個(gè)適應(yīng)過(guò)程。這與試驗(yàn)兩組對(duì)蝦復(fù)蘇1小時(shí)后，LDH活力恢復(fù)到正常狀態(tài)，乳酸濃度略有下降但仍高于新鮮水平這一結(jié)論相符。

對(duì)照組SDH活力在回到正常水環(huán)境后恢復(fù)緩慢、LDH活力在休眠過(guò)程中始終低于山梨醇組，可能是由于缺氧脅迫嚴(yán)重導(dǎo)致了部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損。凡納濱對(duì)蝦最終可能因鰓功能異常無(wú)法充分利用溶解氧，使代謝受阻，細(xì)胞內(nèi)離子代謝紊亂，破壞細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致對(duì)蝦死亡[22]。

3.2 山梨醇對(duì)能量代謝的影響

無(wú)水運(yùn)輸過(guò)程中低溫和缺氧脅迫引起凡納濱對(duì)蝦生理代謝紊亂，造成供能不足[22]。缺氧條件下，LDH催化丙酮酸還原生成乳酸和少量能量。Holman等[23]發(fā)現(xiàn)，美人蝦（Lepidophthalmus louisianensis）在缺氧的情況下能通過(guò)提高無(wú)氧代謝的強(qiáng)度，增加三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的合成以滿足機(jī)體對(duì)能量的需求。本試驗(yàn)中，山梨醇組在休眠狀態(tài)時(shí)SDH活力雖高于對(duì)照組，但低于新鮮狀態(tài)，有氧代謝產(chǎn)能可能不足以維持對(duì)蝦的代謝消耗。環(huán)境脅迫刺激凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行無(wú)氧代謝，生成的ATP能在一定程度上彌補(bǔ)因有氧代謝強(qiáng)度降低所導(dǎo)致的能量短缺[17]。山梨醇組的有氧呼吸和無(wú)氧呼吸強(qiáng)度高，意味著機(jī)體產(chǎn)生更多能量用于維持基本的代謝和其他生命活動(dòng)，并有利于抵抗環(huán)境中持續(xù)出現(xiàn)的脅迫。

血藍(lán)蛋白是甲殼動(dòng)物血液中協(xié)助運(yùn)輸氧的主要呼吸蛋白，占血淋巴總蛋白含量的60%～95%[24]。缺氧時(shí)加速合成血藍(lán)蛋白是甲殼動(dòng)物的一種生理代償機(jī)制[25]。試驗(yàn)中，凡納濱對(duì)蝦休眠過(guò)程中，兩組對(duì)蝦的血藍(lán)蛋白含量都呈上升趨勢(shì)，這與Taylor等[26]對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物血藍(lán)蛋白動(dòng)態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，缺氧會(huì)加速血藍(lán)蛋白的合成一致。Cheng等[27]對(duì)羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）的研究指出環(huán)境氧濃度降低時(shí)，儲(chǔ)存在羅氏沼蝦肝胰腺囊泡中的預(yù)蛋白在ATP協(xié)助下迅速合成血藍(lán)蛋白，血藍(lán)蛋白含量及其氧親和力提高能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)氧氣的吸收和利用能力[28]。Paschke等[29]關(guān)于捕蟹（Lithodes santolla）在低溶解氧下代謝的研究表示，捕蟹是通過(guò)調(diào)節(jié)氧合血藍(lán)蛋白的含量和激活無(wú)氧代謝，來(lái)加強(qiáng)自身對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)能力。試驗(yàn)中，山梨醇組對(duì)蝦呼吸代謝加強(qiáng)，加速ATP的生成。其中一部分ATP可能用于血藍(lán)蛋白的合成，進(jìn)而增加血淋巴的氧容量，提高對(duì)蝦對(duì)氧氣的利用率，又在一定程度上促進(jìn)有氧呼吸，形成良性循環(huán)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

葡萄糖是甲殼動(dòng)物一般代謝過(guò)程中主要的能量底物，有氧條件下，機(jī)體通過(guò)三羧酸循環(huán)氧化分解葡萄糖釋放大量能量。動(dòng)物體內(nèi)的糖類水平可以用于分析動(dòng)物的能量代謝[30]，血糖濃度可于評(píng)價(jià)動(dòng)物體所受生理應(yīng)激的強(qiáng)度[4]。低溫或缺氧等刺激容易導(dǎo)致動(dòng)物血液內(nèi)葡萄糖含量快速升高[31]。Padinhare等[6]關(guān)于觀賞魚（Puntius filamentosus）的研究表明，運(yùn)輸過(guò)程中低死亡率處理組的魚血糖濃度相對(duì)較低，表明該過(guò)程中魚體受到周圍環(huán)境的脅迫較小。根據(jù)Webster[32]的研究，黃道蟹（Cancer pagurus）血淋巴內(nèi)高血糖激素含量在其暴露于空氣的前1 h～4 h會(huì)迅速升高，造成癥急性缺氧和高血糖等脅迫。本試驗(yàn)?zāi)M運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，山梨醇組對(duì)蝦的血糖濃度始終低于對(duì)照組，且變化幅度更為平穩(wěn)，沒(méi)有出現(xiàn)血糖過(guò)高的情況，說(shuō)明該組受到的應(yīng)激脅迫較小，對(duì)氧氣的利用率提高，缺氧脅迫得到緩解。

肝糖原在短期儲(chǔ)存和維持葡萄糖水平中有重要的作用[33]。Axelrod等[34]關(guān)于應(yīng)激激素的研究表明，在無(wú)水過(guò)程中溫度和氧氣含量等環(huán)境因素改變，會(huì)調(diào)節(jié)機(jī)體分泌激素，分解肝糖原，使血糖濃度升高。儲(chǔ)藏在肝胰腺的能量可以轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)其他組織用于生長(zhǎng)和繁殖[35]。本試驗(yàn)中凡納濱對(duì)蝦血糖濃度先增后降，肝糖原含量持續(xù)降低，可能是凡納濱對(duì)蝦受到低溫和缺氧刺激前期，動(dòng)用肝糖原，以葡萄糖的形式釋放至血液中為機(jī)體供能。休眠后期，對(duì)蝦血糖濃度降低，可能是缺氧脅迫加劇，機(jī)體主要通過(guò)無(wú)氧代謝供能，血液中葡萄糖大量消耗所致。

4 結(jié)論

山梨醇具有吸水保濕性，可以降低凡納濱對(duì)蝦體表液體的表面張力，有助于增加液體的擴(kuò)散和滯留。在長(zhǎng)時(shí)間無(wú)水過(guò)程中，山梨醇有助于保持凡納濱對(duì)蝦體表和鰓的濕潤(rùn)，一定程度減少鰓絲等組織的失水損傷，保持呼吸上皮細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和功能。降低鰓損傷程度有利于對(duì)蝦維持一定強(qiáng)度的氣體交換，提高血淋巴中的氧濃度，促進(jìn)細(xì)胞中線粒體參與有氧代謝，為機(jī)體提供能量。山梨醇處理使凡納濱對(duì)蝦的呼吸和能量代謝更加充分，減少機(jī)體因缺氧和能量不足造成的代謝紊亂及細(xì)胞損傷，加強(qiáng)應(yīng)對(duì)無(wú)水和低溫脅迫的能力，提高凡納濱對(duì)蝦無(wú)水運(yùn)輸?shù)拇婊盥省?/p>