周琪，韋家輝，盛智麗，王金萍，劉俊梅，王君，李曉玉，楊雨春，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.吉林省林業(yè)科學研究院，吉林長春130033；3.吉林省露水河林業(yè)局，吉林白山134506）

紅松（Pinus koraiensis）是長白山闊葉紅松林生態(tài)系統(tǒng)建群樹種，東北主要經(jīng)濟樹種，具有較高的經(jīng)濟價值[1]。紅松籽仁含有豐富的蛋白質、膳食纖維、碳水化合物等多種營養(yǎng)成分，松仁總脂肪酸中不飽和脂肪酸約占90%，其中包括皮諾斂酸（Pinolenic）。研究表明，皮諾斂酸具有降脂作用，改變各種載脂蛋白基因的表達水平，同時攝入皮諾斂酸可降低血清中血清水平[2]。而且，它會起到一個食欲抑制效應，因為皮諾斂酸在胃腸道中的存在有效地觸發(fā)近端小腸（十二指腸）中的飽和性腸激素膽汁-囊激酶的釋放，并且胰高血糖素樣肽-1在遠端小腸（回腸）中[3]。此外，它還具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、對抗各種真菌、病痛感染，促進中老年人排泄等功能[4]。松籽油含有的總酚與VE使其具有較強的抗氧化能力，還含有角鯊烯、芝麻素、谷甾醇、蝦青素等甾醇類物質，具有優(yōu)良的營養(yǎng)價值[5-6]。然而，由于紅松結實存在大小年現(xiàn)象，導致年量不穩(wěn)，而且多以粗產(chǎn)品銷售為主，致使其利用度差、附加值低。因此，拓展其產(chǎn)品利用價值，成為突破其產(chǎn)業(yè)瓶頸的重要途徑[7]。

目前提取植物油方法主要有壓榨法、索氏抽提、冷浸法、超臨界、超聲波、水酶法等，其中超聲波是一種較好的提取方法，它是利用在液體中產(chǎn)生的空化作用破壞油料細胞壁，使其內容物質得到釋放，從而提高提油率，而且對油脂的破壞也小[8]。水酶法是近年才發(fā)展起來的一種技術，它是在機械破碎的基礎上，通過酶對細胞結構中脂蛋白、脂多糖的分解作用，增加油料組織中油的流動性，從而使油游離出來，其作用條件溫和、能耗低、提取的油純度高、有效的保護了油脂成分[9-10]。蝸牛酶作為一種新型酶，它是含有纖維素酶、果膠酶等多種混合酶的總稱，主要用于酵母細胞壁的破碎、山楂汁的澄清和果醬的制作[11]。因此，本文旨在探討超聲輔助和蝸牛酶輔助提取松子油工藝的可行性以及明確紅松籽油的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料

脫皮紅松籽仁：產(chǎn)自撫松縣露水河；Alcalase堿性蛋白酶（活力200 000 U/g）：上海將來實業(yè)股份有限公司；Snailase蝸牛酶（破壁率90%）：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；1，1-二苯基-2-苦肼基：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設備

PTT-B6000型電子天平：福州華志科學儀器有限公司；XBLL-SO1型商用現(xiàn)磨豆?jié){冰沙調理機：上海帥佳電子科技有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；pH計：梅特勒托利多儀器有限公司；CHA-S型恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；SIGMA 3K15國華離心機：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；BCD-570WPCJ冰箱：合肥美菱股份有限公司；M200型微孔板掃描分光光度計Tencan Infinite：上海迪奧生物科技有限公司；Agilent7890A液相色譜-質譜聯(lián)儀（配有電噴霧離子源）：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波和酶處理

將紅松籽仁破乳，取10.00 g松籽乳按1∶5（g/mL）料液比加入蒸餾水，混合均勻后置于超聲波清洗儀中，超聲波條件依據(jù)前人研究結論設置，即超聲功率為75.00 W、超聲時間為40.00 min、超聲溫度為45.00℃[12]，超聲波處理后先加堿性蛋白酶，在前人試驗基礎上確定試驗堿性蛋白酶的最適作用條件為加酶量2 364.00 U/g，溫度51℃，時間3.00 h，料液比1 ∶5（g/mL），pH 8.40[13]。堿性蛋白酶處理后，加入蝸牛酶，對酶解時間（30 min～120 min）、加酶量（20.00 mg/10g松子乳～60.00mg/10g松子乳）、酶解溫度（30.00℃～50.00℃）和酶解pH值（5.00～9.00）等參數(shù)先進行單因素試驗初步優(yōu)化，酶解時間確定為1.00 h，其他因素進行響應面優(yōu)化。酶解1.00 h后升溫至100.00℃滅酶8.00 min，8 000 r/min離心15 min[13]，小心吸取上層清油Ⅰ，將乳狀液二次離心，分離上層清油Ⅱ，將二次離心后得到乳狀液置于-20℃冷凍24.00 h，油相結晶可以刺入水相，從而大幅度降低乳狀液穩(wěn)定性，達到破乳的目的。解凍分離上層清油Ⅲ，合并三部分清油，計算紅松籽油得率。

公式如下：

式中：A為總游離油質量，g；B為松籽乳質量，g；m為松籽仁含油脂量，%。

1.3.2 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，關鍵因素得以確認，將蝸牛酶的加酶量、酶解溫度和酶解pH值作為自變量，因變量為提油率和皮諾斂酸的量，然后進行響應面試驗設計，模型共進行20次試驗，14組析因試驗，6組中心試驗，用以估計試驗誤差[14]。

1.3.3 皮諾斂酸的測定

紅松籽油脂肪酸甲酯的制備：吸取0.20 mL紅松籽油，加入4.00 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉－甲醇溶液，在65.00℃水浴攪拌大約15.00 min，待油滴完全消失后，再加入3.00 mL 20%三氟化硼－甲醇溶液，繼續(xù)反應5.00 min，混合液加入10.00 mL石油醚和10.00 mL水，萃取兩次后合并石油醚層備用。

色譜條件：Agilent7890A，選用30 m×0.32 mm石英毛細管柱，F(xiàn)ID氫火焰離子檢測器，進樣溫度250.00℃，檢測器溫度250.00℃，載氣流速1.00 mL/min，分流比10∶1，升溫程序 140.00℃保持 5.00 min，以1.80℃每分鐘加熱至220.00℃保持20.00 min，進樣量1 μL，運行65.00 min。

質譜條件：安捷倫MS5977，EI離子源；離子源溫度230.00℃；接口溫度280.00℃；電子能量70.00 eV；倍增器電壓1.80 kV；溶劑切除時間為3.50 min；質譜掃描方式為SCAN；質量掃描范圍30 amu～400 amu。

1.3.4 抗氧化活性測定

依據(jù)文獻進行DPPH自由基清除活性測定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)整理數(shù)據(jù)，并利用SPSS19.0進行進行單因素方差（One-way Anova）和多因素方差分析（Multi-way Anova）分析（Multi-way Anova）檢驗不同處理之間的差異（LSD，α=0.05），圖像采用 Origin 7.5，所有數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差。

2 結果與分析

2.1 紅松油酸標準品測定結果

對紅松籽油脂肪酸甲酯進行了GC-MS分析，根據(jù)GC-MS聯(lián)用儀獲得質譜信息，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索與標準譜圖對照，分析了主要脂肪酸含量，對色譜圖進行面積歸一化，定量了各種脂肪酸的質量分數(shù)，見圖1。

由圖1可知，皮諾斂酸的峰開始時間為39.335min，結束時間為40.558 min。

圖1 紅松油酸標準品GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of GC-MS in red pine acid standard

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 加酶量對提油率和皮諾斂酸量的影響

圖2 加酶量、溫度和pH值對皮諾斂酸量和紅松籽提油率的影響Fig.2 The effects of enzyme addition amount，enzymatic hydrolysis temperature and enzymolysis pH on the extraction rate of Korean pine seed oil and the amount of pinolenic acid

加酶量對提油率和皮諾斂酸量的影響如圖2A。由圖2A可知，在一定范圍內，隨著酶量的增加，得率增加，主要是因為隨著酶量的增加，酶與底物作用的越充分，酶滲透到脂質體膜內，以及酶對脂蛋白、脂多糖的分解作用，有利于油脂從復合體中釋放[12]；當酶用量超過50.00 mg/（10 g松子乳）時，得率呈下降趨勢，這是由于底物量有限，繼續(xù)增大總加酶量，過量酶會對油脂產(chǎn)生吸附作用，使得率略有下降[15]；只有加酶量在40.00 mg/10 g松子乳～50.00 mg/10 g松子乳時，提取量達到最大，并于其他處理差異極顯著（p＜0.01）。綜合考慮到紅松籽油的提取率及成本，初步確定40.00 mg/10 g松子乳為最適加酶量。

2.2.2 酶解溫度對提油率和皮諾斂酸量的影響

由圖2B可知，在低于40.00℃時，得率隨著溫度的升高而增加；當溫度達到40.00℃時，得率達到最高（p＜0.01）；隨著溫度繼續(xù)升高得率降低，這是由于溫度超過酶的最適溫度，使酶的活性中心結構被破壞，導致酶變性或失活，并且也會加速不飽和脂肪酸的氧化速度，不利于松籽油的提取[16-18]，因此初步確定最佳酶解溫度為40.00℃。

2.2.3 pH值對提油率和皮諾斂酸量的影響

由圖2C可知，隨著pH值的增加，提油率逐漸增加；當pH值為6～7時，得率最高，且差異極顯著（p＜0.01）；而后隨著pH值的增加，得率逐漸降低，且差異極顯著，主要是因為酶和pH值協(xié)同作用實現(xiàn)乳狀液的破乳，且蝸牛酶的最適pH值在6～7時[8]，酶活高，酶對底物作用的效果明顯，得率高。反之，會影響酶的活性，同時降低油的乳化性[19-20]，因此初步確定最佳酶解pH值為7.00。

2.3 響應面優(yōu)化提油率和皮諾斂酸的量

2.3.1 響應面分析

在單因素試驗的基礎上，可以看出，pH值、溫度和蝸牛酶的量對提油率和皮諾斂酸的量影響較大，需進一步優(yōu)化。因此，采用23個全因子中心復合設計，選擇這3個因素作為響應面法中的變量，將提油率和皮諾斂酸的量作為響應值，進行優(yōu)化，結果見表1。

表1 中心組合設計以獨立變量的原始和編碼形式、提油率和皮諾斂酸的量Table 1 Central composite design setting in the original and coded form of the independent variables and experimental results of extraction rate of Korean pine seed oil and pinolenic acid

通過對二次模型進行分析，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.001）。方差分析中可知失擬項不顯著，并且該模型R12=99.51%、R22=99.47%，R12Adj=99.06%、R22Adj=99.00%，說明兩種模型與試驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，試驗誤差小，可以用此模型來分析和預測水酶法提取紅松籽油和皮諾斂酸量的結果。由此可以認為上面給出的二次回歸方程模型是合適的。由F檢驗可以得到因子貢獻率為加酶量＞pH值＞溫度。回歸方程式如下：

式中：A為加酶量，mg/10 g松子乳；B為溫度，℃；C為pH值。

為了進一步研究參數(shù)對提油率和皮諾斂酸的量的交互影響，多維的三維輪廓非線性回歸模型如圖3所示。

圖3 加酶量、溫度和pH值對提油率和皮諾斂酸的量的影響Fig.3 The Response surface of the effects of enzymatic hydrolysis temperature，enzyme addition amount and enzymolysis pH on the extraction rate of Korean pine seed oil and the amount of pinolenic acid

通過響應模型的曲面曲線圖，可以直觀的分析各因素的交互作用[21]。如圖3所示，油脂通常與大分子結合，構成脂多糖、脂蛋白等復合體。因此只有將油料組織的細胞壁及脂質復合體破壞，才能將油脂取出。蝸牛酶通過分解細胞壁的纖維素、果膠使得內容物更多的釋放出來，同時利用酶解切斷脂肪酸與多糖的酯鍵鏈接，進而得到更多的各類脂肪酸[22-23]。評估酶的用量需要綜合考慮得率和酶使用成本，從圖3中的A、B、D、E可以看出，加酶量在40 mg/10 g松子乳左右提油率和皮諾斂酸的量達到最大值，表明40.00 mg的酶足以破壞細胞壁和脂質復合體。

事實上，酶解溫度是影響提油率和皮諾斂酸的量的一個重要因素，它能夠改變平衡和質量在固液萃取中轉移條件[24]，溫度過高，既會影響酶的活性又會影響油的色澤，溫度過低又會影響得率以及蛋白質的回收率[25]，由圖 3 中的 A、C、D、F 可以看出，隨著溫度的上升，提油率和皮諾斂酸的量都呈先升高后下降的趨勢，表明當溫度超過44℃酶的活性受到抑制，且可能會加速不飽和脂肪酸的氧化和分解[19]。

酶和pH值協(xié)同作用實現(xiàn)乳狀液的破乳，酶解產(chǎn)生的小分子肽競爭吸附到油水界面導致蛋白質膜失去原有的穩(wěn)定性而實現(xiàn)乳狀液的破乳，油和蛋白質的提取機理之間存在著緊密聯(lián)系，在等電點附近時，蛋白質的溶解度最低，提油率也最低，所以在提取時，既要考慮酶的最適pH值，也要考慮得率的最適pH值。由圖3中的B、E可知，pH值在7.00左右提油率和皮諾斂酸的量達到最大值，當pH值超過7.00時，原因可能是影響了酶的活性和不飽和脂肪酸的活性以及蛋白質的乳化性、氣泡性和持水性[19]。

2.3.2 松籽油最佳提取條件的確定

應用響應面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進行分析，計算出最優(yōu)響應條件為：溫度43.54℃，加酶量為39.00 mg/10 g松子乳，pH7.10，在此條件下，松籽油提取率理論值為94.04%，皮諾斂酸的理論值量為856.06 mg/10 g松子乳。

2.3.3 驗證試驗

為方便試驗操作，將酶解溫度和pH值分別調整至44.00℃和7.00，同時為進一步驗證提取方法的可靠性，進行了平行試驗，結果表明，紅松籽油提油率平均值為93.87%，皮諾斂酸量的平均值為855.77 mg/（10 g松子乳），而且與模型預測值差異不顯著（p＜0.01）。表明該模型能夠較好地預測實際紅松籽油提取率情況和皮諾斂酸的量。

2.4 自由基清除能力

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一種自由基化合物，已被廣泛用于測試目前存在的各種樣品的自由基清除的能力，產(chǎn)生減少50%的樣品濃度自由基吸光度（IC50）被用作評估其指數(shù)的指標抗氧化活性。不同植物油的抗氧化活性見圖4。

圖4 不同植物油的抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of different vegetable oils

由圖4分析可得，采用優(yōu)化工藝提取松籽油的DPPH IC50值為8.52 mg/mL。而且紅松籽油和紫蘇籽油與其他植物油的抗氧化活性相比，表現(xiàn)較好（p＜0.01）。因此，本試驗明確了紅松籽油的抗氧化活性，同時由于紫蘇籽為栽培作物，在種植過程中難免使用化肥和農(nóng)藥，而且產(chǎn)量較小，而紅松為東北主要經(jīng)濟樹種，松籽綠色環(huán)保且產(chǎn)量巨大，但是目前產(chǎn)品的深加工程度較低，只要改進適當?shù)墓に?，就能提高產(chǎn)品的附加值，從而更好地開發(fā)和利用該優(yōu)質資源[7]。

3 結論

利用超聲波輔助雙酶法兩步提取紅松籽油，通過單因素試驗和響應面優(yōu)化試驗，以提油率和皮諾斂酸的量為指標，得到紅松籽油的最佳提取工藝條件為堿性蛋白酶加酶量2 364 U/g、溫度51.00℃、時間3.00 h、pH 8.40；蝸牛酶加酶量為39.00 mg/10 g松子乳、溫度44.00℃、時間1.00 h、pH7.00，松籽油得率可以達到93.87%，皮諾斂酸的量為855.77 mg/10 g松子乳，明顯高于前人的研究結果。在最優(yōu)條件下，通過自由基清除能力試驗測定了松籽油的IC50為8.52 mg/mL，同時，紅松籽油的抗氧化活性明顯高于紫蘇籽油等其他植物油。該工藝提高了紅松籽油的提油率和皮諾斂酸的量，為紅松籽油的開發(fā)和利用的開發(fā)提供了科技支持。