洪偉，錢聲艷，吳昌學**，饒鳳琴，程玉梅，張婷，齊曉嵐，禹文峰，官志忠

(1.貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室&貴州省分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附院 ICU，貴州 貴陽 550004)

肺炎克雷伯菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，是一種革蘭陰性的兼性厭氧菌[1]。對于醫(yī)院內(nèi)住院、患有嚴重基礎(chǔ)疾病(如糖尿病、慢性酒精中毒或肺阻塞)或免疫功能受損的病人，肺炎克雷伯感染可引起尿路感染、敗血癥肺炎、化膿性肝膿腫和危及生命的敗血癥[2]。在亞洲(中國和韓國等)肺炎克雷伯菌是引起肝膿腫的主要病原體，這種現(xiàn)象在歐美國家卻很少見[3-5]。有研究表明肝膿腫的發(fā)病機制是由于腸道定植肺炎克雷伯菌入侵腸道黏膜、進入門靜脈或上行感染膽道而引起[6]。隨著肺炎克雷伯肺炎發(fā)病率和致死率逐年增高，有關(guān)該菌的基礎(chǔ)研究也日益受到重視[7-8]。目前，經(jīng)典肺炎克雷伯菌和高致病性肺炎克雷伯菌(hypervirulentK.pneumoniae, hvKp)是醫(yī)院的主要流行菌株，對醫(yī)療系統(tǒng)造成了嚴重的威脅[9-11]。造成這種現(xiàn)象的主要原因是肺炎克雷伯菌能夠產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶[12]，且隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯菌的耐藥性日益增加[13-15]。重癥監(jiān)護病房(intensive care unit, ICU)病人因基礎(chǔ)病情多樣、復雜，肺炎克雷伯菌感染率居高不下。因此，檢測肺炎克雷伯在ICU的感染情況和耐藥性對于控制肺炎克雷伯感染和治療具有重大意義。本研究采集ICU住院病人腸道來源樣品(糞便)分離肺炎克雷菌，并研究分離菌株對常用胃腸道感染抗生素的耐藥性及其分類地位，以期為臨床診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與試劑 肺炎克雷伯菌從醫(yī)院ICU病房患者糞便樣品分離得到。酵母粉(Oxoid，英國)，哥倫比亞培養(yǎng)基(columbia medium)、胰蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、紅霉素、克拉霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素購買于索萊寶(Solarbio)，諾氟沙星、阿莫西林、甲砜霉素、甲硝唑及克林霉素均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2主要儀器 電子天平購自上海浦春計量儀器有限公司，壓力蒸汽滅菌鍋購自上海醫(yī)療申安醫(yī)療器械廠，移液器購自德國 Eppendorf 公司，PCR 擴增儀購自美國 ABI 公司，DYY-7C 型電泳儀購自北京六一有限公司，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細菌培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的配制 按照廠家說明書稱取哥倫比亞培養(yǎng)基40 g加蒸餾水溶解至1 L，另在電子天平上準確稱取胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g及氯化鈉10 g加入雙蒸水定容至 1 L，配制Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基配制時需加1.5%的瓊脂粉，以上培養(yǎng)基均需高壓滅菌 30 min。細菌在以上2種培養(yǎng)基上涂板，37 ℃靜置培養(yǎng)即可生長良好。實驗所用抗生素因其化學性質(zhì)不同，故而用特定溶劑溶解并根據(jù)溶解度配制成濃度不同的工作液備用，使用抗生素的種類及濃度分別為阿莫西林(2.5 mg/L)、甲硝唑(10 mg/L)、克林霉素(10 mg/L)、鏈霉素(50 mg/L)、氯霉素(10 mg/L)克拉霉素(30mg/L)、紅霉素(10 mg/L)、四環(huán)素(10 mg/L)、甲砜霉素(10 mg/L)及諾氟沙星(50 mg/L)，以上抗生素溶解完成后均需使用0.22 μm過濾器過濾除菌。

1.2.2菌株的分離及鑒定 從ICU病房取病人糞便樣品，用磷酸緩沖液處理樣品，取50 μL處理后的糞便樣品涂布于哥倫比亞選擇培養(yǎng)基上；涂布完成后，將平板靜置于隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃需氧培養(yǎng)18～24 h，挑選菌落形態(tài)疑似肺炎克雷伯菌的單菌落(與質(zhì)控菌株比較)。酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因(tyrB)是肺炎克雷伯菌特異性分子標記，可用于初篩分離平板上形成的菌落，縮小測序范圍，所用引物見表1。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，68 ℃最后延伸5 min。tyrB陽性菌株，使用平板劃線法純化細菌并接入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8～12 h，油鏡觀察菌懸液(放大倍數(shù)100倍)。顯微鏡下細菌形態(tài)為均一桿狀時，PCR擴增16S rDNA并送至上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序比對，確定菌種種屬。

表1 引物列表Tab.1 Primer list

1.2.3菌株的培養(yǎng)及生長曲線測定 在最適培養(yǎng)條件下(37 ℃靜置培養(yǎng))，以0.1%(V/V)的接種量，將純化好的肺炎克雷伯菌液接入新鮮的LB培養(yǎng)基，剛接種時，每隔3 h取出1 mL濁度計儀600 nm處測定吸光度值(OD)值；12 h之后，每隔12 h測1次OD值，根據(jù)OD值繪制肺炎克雷伯菌生長曲線。

1.2.4瓊脂稀釋法(Agar Dilution)測定菌株耐藥性 參照國際抗生素敏感實驗標準，根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(clinical and laboratory standards institute, CLSI)(2017)標準確定各抗生素的耐藥折點，將藥物的最高濃度設(shè)定為耐藥折點的2倍。諾氟沙星耐藥折點為128 mg/L，則瓊脂稀釋平板濃度依次為0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、及256.0 mg/L，其余抗生素也按此方法進行瓊脂稀釋。用直尺繪制6×6方格，每個平板接14株菌，且每株菌設(shè)置3個重復，即每3個格子接1株菌，每格加菌懸液1.5 μL；另設(shè)置不添加任何抗生素的LB培養(yǎng)基為對照，菌株在不同抗性培養(yǎng)基與對照組中均設(shè)置3個重復；點板完成后，將平板靜置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃需氧培養(yǎng)16 ～24 h，肉眼觀察肺炎克雷伯菌的生長情況，判讀最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)、MIC50及MIC90值(MIC50及MIC90指在一批實驗中能抑制50%或90%受試菌生長所需抗生素濃度)。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌菌落、菌體形態(tài)及生長曲線

肺炎克雷伯菌在哥倫比亞培養(yǎng)基上形成白色、直徑2 ～ 5 mm菌落(圖1A和圖1B)，菌落不透明、邊緣光滑。用牙簽挑取菌落時，菌落具有黏性、可拉絲。在液體哥倫比亞培養(yǎng)基中，37 ℃靜止培養(yǎng)肺炎克雷伯菌3 h進入對數(shù)生長期，對數(shù)生長期24 h結(jié)束，最大OD600值為2.0，繼續(xù)培養(yǎng)無菌體自溶現(xiàn)象(圖1C)。在油鏡下，革蘭染色為陰性(紅色)，菌體呈短桿狀(圖1D，紅圈區(qū)域)。

注：A：肺炎克雷伯菌QSY-1在平板上的菌落形態(tài)；B：肺炎克雷伯菌QSY-2在平板上的菌落形態(tài)；C：肺炎克雷伯菌QSY-1生長曲線；D：肺炎克雷伯菌QSY-1革蘭氏染色結(jié)果。圖1 肺炎克雷伯菌菌落、菌體形態(tài)及生長曲線Fig.1 Colony, morphology and growth curve of Klebsiella pneumoniae

2.2 分離肺炎克雷伯菌株BLAST比對

從54份ICU糞便樣品中，分離到14株菌落形態(tài)疑似肺炎克雷伯的菌株，攜帶率26%；使用PCR方法擴增這些菌株的16S rDNA并送測序后，NCBI BLAST比對結(jié)果確認為肺炎克雷伯菌，菌株根據(jù)分離順序分別命名為QSY-1 到 QSY-14(表2)。

表2 16S rDNA序列Blastn比對結(jié)果Tab.2 The Blastn results of 16S rDNA sequences

2.3 ICU分離肺炎克雷伯菌進化發(fā)育分析

以常見腸桿菌科標準菌株16S rDNA作為參照，構(gòu)建分離的14株肺炎克雷伯菌的系統(tǒng)進化樹。ICU分離肺炎克雷伯菌在進化樹上形成獨立簇，遠離歐、美地區(qū)分離的肺炎克雷伯菌標準菌株(klebsiellapneumoniaesubsp.)，與新加坡分離菌株Klebsiellasingaporensisstrain LX3親緣關(guān)系較近。聚集為一簇的ICU分離肺炎克雷伯菌可進一步分為兩個分支，其中QSY-13、QSY-14、QSY-2、QSY-5、QSY-9、QSY-3、QSY-11、QSY-12、QSY-4、聚為一個分支；QSY-1、QSY-8、QSY-6、QSY-7、QSY-10聚為一個分支(圖2)。

圖2 基于菌株16s rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain

2.4 14株肺炎克雷伯菌對10種抗生素的耐藥性

如表4所示，14株菌對紅霉素、克拉霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、阿莫西林、甲砜氯霉素、甲硝唑和克林霉素均具有耐藥性，耐藥率為100%。14株菌對諾氟沙星均不具有耐藥性，耐藥率為0.0%。見表3。

表3 14株肺炎克雷伯菌對常用腸道感染抗生素的耐藥性Tab.3 Resistance of 14 strains of Klebsiella pneumoniae to commonly used antibiotics for intestinal infections

2.5 14株肺炎克雷伯菌rmpA和khe基因鑒定

結(jié)果顯示，Mucoid phenotype A(rmpA)和溶血素(hemolysin)基因(khe)是肺炎克雷伯菌高毒力的分子標記。14株分離的肺炎克雷伯菌株中QSY-1、QSY-4、QSY-7、QSY-10、QSY-11、QSY-6、QSY-9基因型為rmpA-khe+，占50%；QSY-2、QSY-12、QSY-5、QSY-13基因型為rmpA+khe+，占29%；QSY-3基因型為rmpA-khe-，占7%；QSY-8、QSY-14基因型為rmpA+khe-，占14%。見表4。

表4 4株肺炎克雷伯菌rmpA和khe基因鑒定Tab.4 Identification of rmpA and khegene of 14 Klebsiella pneumoniae

注：“+”表示有這種毒性基因，“-”表示無這種毒性基因。

3 討論

在歐美肺炎克雷伯菌定置率位5%～35%[16-17]。在亞洲，如馬來西亞、新加坡、日本、泰國、越南和韓國，肺炎克雷伯菌在健康人腸道中的定植率分別為87.8%、61.1%、18.8%、52.9%、41.3%和21.1%[2,18]。本研究采集了54位ICU住院病人糞便樣品，其中14位病人檢出肺炎克雷伯菌，定植率為26%，提示貴州地區(qū)ICU病房肺炎克雷伯菌在腸道中的定植率低于亞洲平均水平；其次，本研究觀察了菌株形態(tài)和生長特征，并構(gòu)建了其進化樹，同時測定了14株菌對常見治療腸道感染的抗生素的耐藥性，發(fā)現(xiàn)ICU分離肺炎克雷伯對90%的測試抗生素具有耐藥性，僅對諾氟沙星敏感。最后，本研究利用PCR方法發(fā)現(xiàn)14株菌種rmpA+khe+雙陽性菌株占比高達29%，提示在ICU病人腸道可能是高致病性克雷伯菌的主要來源。

在進化分類特征上，貴州ICU分離的肺炎克雷伯菌具有明顯的地域特征，在進化樹上與歐、美菌株的距離較遠，與亞洲分離菌株的分類距離較近(新加坡分離株)。本研究發(fā)現(xiàn)14株肺炎克雷伯菌形成兩個獨立的分支，提示在進化地位相近的同時，菌株與菌株之間也存在明顯的差異，這一觀點在后續(xù)rmpA和khe鑒定過程中也得到了印證。以上結(jié)果表明，肺炎克雷伯菌具有區(qū)域特征，這些特征可能是肺炎克雷伯菌在貴州地區(qū)長期進化的結(jié)果。

分離肺炎克雷伯菌菌株中rmpA和khe兩個基因的攜帶狀態(tài)不盡相同，提示菌株與菌株之間存在較大的毒素基因型差異。高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentK.pneumoniae,hvKp)比傳統(tǒng)肺炎克雷伯菌具有更高的毒力。在過去的30年中，hvKp在亞洲流行性和致病性呈增長趨勢[19-20]。Mucoid phenotype A(rmpA)溶血素基因(hemolysin,khe)是hvKp的分子標記[21]，本次在ICU分離的肺炎克雷伯菌種，含毒性基因的菌株(包含rmpA或khe)占比高達93%(非毒性菌株僅占7%)，其中mpA-khe+占50%、rmpA+khe+占29%、mpA+khe-占14%。值得注意的是rmpA+khe+雙陽性菌株占比高達29%，提示在ICU病人腸道可能是高致病性克雷伯菌的主要來源。因此，不同毒素基因型在致病力上是否存在差異是未來研究的重要方向，值得進一步深入研究。