孫梅 劉鵬 耿建利 王曉偉 姚繼承 王明義

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東威海 264200；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院肝膽外科，山東威海 264200；3.威海威高生物科技有限公司，山東威海 264200

化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法是目前檢測(cè)抗原、半抗原及抗體的主流方式，靈敏度、特異性高的特點(diǎn)使其可用于腫瘤標(biāo)志物、激素等微量物質(zhì)的超微定量及定性分析。因此，在各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)中全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀應(yīng)用普遍。實(shí)驗(yàn)室對(duì)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀的臨床性能要求也不斷提高?；瘜W(xué)發(fā)光體系的設(shè)計(jì)與應(yīng)用是發(fā)展化學(xué)發(fā)光技術(shù)的前提。國(guó)外對(duì)于化學(xué)發(fā)光體系的研究與應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)成熟，通過(guò)實(shí)現(xiàn)與高效液相 色譜、毛細(xì)管電泳、生化免疫分析、電化學(xué)分析等技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用可解決化學(xué)發(fā)光分析固有選擇性差這一難題，使化學(xué)發(fā)光分析靈敏度更高、結(jié)果更準(zhǔn)確。但我國(guó)國(guó)產(chǎn)儀器與國(guó)外同類產(chǎn)品在性能上還有一定差距，因此，提高核心科學(xué)技術(shù)的整體水平而推動(dòng)國(guó)內(nèi)自動(dòng)化儀器的發(fā)展是必然趨勢(shì)。微粒子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系作為化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀的重要模塊，其關(guān)鍵技術(shù)水平也在不斷優(yōu)化。本文以新一代國(guó)產(chǎn)免疫分析儀AutolumiS 3000的微粒子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系為例，對(duì)微粒子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系進(jìn)行介紹。

化學(xué)發(fā)光試劑的研究應(yīng)用及發(fā)展是推動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)進(jìn)步的基礎(chǔ)。目前化學(xué)發(fā)光試劑的種類有很多，包括魯米諾類、吖啶酯類、過(guò)氧草酸酯類和1，2-二氧雜環(huán)丁烷類等，魯米諾類發(fā)光效率高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且無(wú)毒的特點(diǎn)使其成為化學(xué)發(fā)光試劑的代表性物質(zhì)之一，在免疫分析或非免疫分析診斷、檢測(cè)技術(shù)和生物傳感器等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

1 免疫復(fù)合物形成

魯米諾類是目前化學(xué)發(fā)光體系中應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)發(fā)光試劑。異魯米諾發(fā)光效率雖較魯米諾差，但異魯米諾做為一種標(biāo)記物,被標(biāo)記到抗原或抗體上時(shí),它的發(fā)光效率則顯著增加。結(jié)合異魯米諾反應(yīng)時(shí)間短、背景噪聲低、可直接標(biāo)記抗原或抗體且結(jié)合穩(wěn)定的特點(diǎn)，AutolumiS 3000的微粒子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系選用異魯米諾作為直接發(fā)光試劑。在免疫反應(yīng)過(guò)程中，以抗原或抗體異魯米諾發(fā)光標(biāo)記物為示蹤信號(hào)，以偶聯(lián)抗原或抗體的磁性微粒子為載體，增大反應(yīng)表面積，與待測(cè)物在均相中反應(yīng)，形成“夾心”免疫復(fù)合物。

2 免疫復(fù)合物無(wú)損磁性分離

2.1 微米級(jí)別的磁性微粒

AutolumiS 3000的微粒子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系采用微米級(jí)別的Fe3O4核心的磁微粒為固相載體—磁性微粒表面積大，蛋白吸附能力極強(qiáng)，與包被管或包被珠相比反應(yīng)表面積增大50倍，是目前最理想的免疫固相分離載體之一。磁微粒增進(jìn)了結(jié)合動(dòng)力并保證了較大的敏感度。分散懸浮液的反應(yīng)速率接近均相溶液的動(dòng)力學(xué)，同時(shí)抗原抗體的相對(duì)反應(yīng)濃度增高，增快了捕捉的有效性，提高了精確度，加快了免疫反應(yīng)的速度。

圖2 儀器洗滌區(qū)磁分離結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 磁場(chǎng)磁性分離技術(shù)

通過(guò)對(duì)復(fù)合物顆粒磁分離過(guò)程的分析，給出了磁場(chǎng)設(shè)計(jì)原則（按圖1從小到大依次為16S、15N、14S、13N…順序排列）。免疫復(fù)合物充分無(wú)損分離技術(shù)（磁場(chǎng)磁性分離技術(shù)）的分離共分為三個(gè)過(guò)程，即吸附過(guò)程、沖洗過(guò)程和吸走過(guò)程。磁鐵吸附住磁微粒，能更有效的將游離相和結(jié)合相分離。將未結(jié)合的抗原和標(biāo)記物洗滌清除，實(shí)現(xiàn)了免疫復(fù)合物顆?？焖俪浞譄o(wú)損分離。

AutolumiS 3000儀器磁分離模塊結(jié)構(gòu)示意圖（如圖2）。磁場(chǎng)作用原理：反應(yīng)杯中的免疫復(fù)合物所處的環(huán)境可以視為磁流體，在外加磁場(chǎng)的作用下，液體中的免疫復(fù)合物被磁化靠近永磁體，吸附在反應(yīng)杯壁上，而未與發(fā)光標(biāo)記物結(jié)合的顆粒則仍然在反應(yīng)杯中間位置通過(guò)沖洗過(guò)程和吸走過(guò)程，只留下結(jié)合的免疫復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)合物顆粒磁分離過(guò)程。

磁場(chǎng)的作用是將復(fù)合顆粒束縛在反應(yīng)杯中，但是又不能使復(fù)合物聚集結(jié)團(tuán)，為避免這一情況發(fā)生采用圓形的磁鐵。在磁分離過(guò)程中，外加磁場(chǎng)位于反應(yīng)器皿的側(cè)面吸附前復(fù)合物顆粒均勻分散在反應(yīng)杯中，吸附后附著在反應(yīng)杯的側(cè)壁，反應(yīng)杯吸附過(guò)程如圖3所示。

圖3 反應(yīng)杯吸附過(guò)程示意圖

3 異魯米諾化學(xué)發(fā)光

異魯米諾化學(xué)發(fā)光已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)藥、生命科學(xué)等領(lǐng)域中有機(jī)物及無(wú)機(jī)物的檢測(cè)。其發(fā)光機(jī)理是在堿性環(huán)境中下，異魯米諾被氧化劑H2O2氧化而處于激發(fā)態(tài)，當(dāng)其返回到基態(tài)過(guò)程中發(fā)出光子，從而獲得閃光信號(hào)，如圖4所示。為保證反應(yīng)充分徹底，使測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，必須實(shí)現(xiàn)全部復(fù)合物顆粒與激發(fā)液的充分接觸。因此，通過(guò)直針與彎針形式的洗滌針（如圖5所示），在激發(fā)液加注前的洗滌過(guò)程中通過(guò)直針將反應(yīng)杯底部的復(fù)合物顆粒團(tuán)沖開，彎針將貼附在杯壁上的復(fù)合物顆粒沖下，防止復(fù)合物顆粒聚集成團(tuán)，保證未結(jié)合顆粒全部吸走。

圖4 異魯米諾化學(xué)發(fā)光原理圖

圖5 洗滌針中直針、彎針設(shè)計(jì)

4 微弱閃光信號(hào)精確測(cè)量

為實(shí)現(xiàn)信號(hào)的精確測(cè)量，研制出微弱閃光信號(hào)精確測(cè)量技術(shù)系統(tǒng)，AutolumiS 3000測(cè)量室結(jié)構(gòu)如圖6所示。該系統(tǒng)設(shè)有嚴(yán)格避光的暗室環(huán)境（如圖7所示）。反應(yīng)杯進(jìn)入反應(yīng)杯通道，傳送到反應(yīng)杯第一孔加注激發(fā)液位置，擋光板關(guān)閉，通過(guò)測(cè)量室升降動(dòng)作，控制玻璃關(guān)門打開，加注激發(fā)液并測(cè)量反應(yīng)杯第一孔。然后玻璃關(guān)門關(guān)閉，傳到第二孔加注激發(fā)液位置，依次進(jìn)行。暗室采用背膠毛氈等材料實(shí)現(xiàn)加注針移動(dòng)過(guò)程中的動(dòng)密封，同時(shí)采用交替遮擋方法實(shí)現(xiàn)測(cè)量室的光密封，能有效去除背景光反射，降低本底噪聲，使測(cè)量更精準(zhǔn)。化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的閃光信號(hào)通過(guò)集光器接收，并在光電倍增管作用下實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，通過(guò)上位機(jī)處理程序分析所得RLU值（relative light unit），獲得樣本濃度信息，實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的定量或定性分析。

圖6 發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量室結(jié)構(gòu)圖

圖7 測(cè)量室暗室環(huán)境示意圖

5 小結(jié)

AutolumiS 3000微粒子化學(xué)發(fā)光體系采用異魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑，可通過(guò)反應(yīng)中化合物能量的躍遷產(chǎn)生光量子而獲得樣本的濃度信息，不需要增加外部光源，從而減少了瑞利散射和拉曼散射，背景光信號(hào)干擾小，使測(cè)量結(jié)果更加精準(zhǔn)。在免疫反應(yīng)中采用磁性微粒為載體，與包被管、包被珠相比，反應(yīng)表面積增大了50倍，可大幅度縮短檢測(cè)時(shí)間，且在磁場(chǎng)作用下可有效實(shí)現(xiàn)結(jié)合相與游離相的充分無(wú)損分離?？朔藗鹘y(tǒng)酶免疫方法反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、靈敏度低等缺點(diǎn)。該體系中還設(shè)有微弱閃光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，在完全密閉的暗室中完成化學(xué)發(fā)光反應(yīng)及閃光信號(hào)的收集，消除背景光干擾，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)物濃度信息準(zhǔn)確分析。