林秀山 周向東 王才春

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海口 570102)

PM2.5是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于或等于2.5 μm的細(xì)顆粒物質(zhì)，易被人體吸入到達(dá)遠(yuǎn)端支氣管和肺泡，并且長期沉積在呼吸道中，是一系列呼吸系統(tǒng)疾病的危險(xiǎn)因素，包括慢性支氣管炎、哮喘、肺癌等[1,2]。氣道上皮細(xì)胞在受到PM2.5刺激時(shí)常呈黏液高分泌狀態(tài)，具有量大、黏稠等特點(diǎn)，纖毛無法有效的清除，而過量的黏液積聚又會(huì)加重局部呼吸道的炎癥和感染，最終導(dǎo)致呼吸道慢性疾病的遷延不愈[3]。黏蛋白5AC(Mucin 5AC，MUC5AC)是氣道黏液的主要蛋白成分，在呼吸道中發(fā)揮潤滑和保濕作用，但是在PM2.5刺激下，MUC5AC大量分泌，且呈高度的硫酸化和糖基化，是黏液高分泌狀態(tài)的主要原因[4]，因此探討PM2.5誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞MUC5AC高表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，并開展針對性的干預(yù)具有重要的臨床意義。

Sec61是一種異源性三聚體，為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通道蛋白，參與調(diào)節(jié)核糖體生成的多肽鏈向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的轉(zhuǎn)運(yùn)[5,6]。研究發(fā)現(xiàn)，Sec61與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)，如王軍等[7]發(fā)現(xiàn)使用抑制劑阻斷Sec61可以降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78的表達(dá)，緩解肝細(xì)胞脂肪變性的程度。此外，Sec61可以促進(jìn)鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞質(zhì)中釋放，在鈣離子紊亂中發(fā)揮重要的病理作用[8]。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和鈣離子紊亂也是PM2.5誘導(dǎo)氣道黏液高分泌的病理機(jī)制[9]，因此我們推測Sec61可能參與PM2.5誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞MUC5AC高表達(dá)，本文首先使用PM2.5對支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B進(jìn)行刺激，以探討Sec61在不同濃度和不同時(shí)間刺激下的變化規(guī)律，然后使用RNA干擾技術(shù)沉默Sec61表達(dá)，以研究Sec61沉默對細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 siRNA-Sec61和siRNA-Control序列由吉?jiǎng)P基因公司設(shè)計(jì)和合成；siRNA-Sec61正義鏈：5′-GAGAGAAAGAUUCAGUUUAdTdT-3′，反義鏈：5′-UAAACUGAAUCUUUCUCUCdTdT-3′；siRNA-Control正義鏈：5′-GAUAAUAAAUCUAAGGGGUdTdT-3′，反義鏈：5′-ACCCCUUAGAUUUAUUAUCdTdT-3′；懸浮微粒采樣器(TH-150)購自武漢市天虹儀表有限責(zé)任公司；支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B購自美國ATCC公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；LipofectamineTM2000、Fluo-4/AM熒光染料購自Invitrogen公司；PMSF、RIPA裂解液購自上海碧云天；一抗購自Santa Cruz公司；二抗購自Proteintech公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；引物合成自上海生工。

1.2方法

1.2.1PM2.5的采集與處理 于?？谑械闹饕煌房谔?，在空氣質(zhì)量指數(shù)大于5級、PM2.5嚴(yán)重超標(biāo)的霧霾天氣時(shí)分次采集PM2.5顆粒，采集時(shí)間為2018年3～5月，共采集8次，每次時(shí)間為8:00～18:00。采用懸浮微粒采樣器收集PM2.5，結(jié)束后將纖維濾膜放入干燥器中暫時(shí)保存。將纖維濾膜浸入去離子水，超聲振蕩30 min，洗脫液10 000 r/min離心30 min，將沉淀物真空凍干后稱重，于-20℃冰箱中保存。使用PBS將PM2.5配置成0、25、50、100、200 μg/ml[10,11]。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后依次加入0、25、50、100、200 μg/ml的PM2.5刺激48 h，收集細(xì)胞，使用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測細(xì)胞中Sec61的表達(dá)。使用100 μg/ml的PM2.5分別刺激細(xì)胞0、6、12、24、48 h，收集細(xì)胞，Western blot檢測細(xì)胞中Sec61的表達(dá)。使用100 μg/ml的PM2.5刺激48 h，細(xì)胞免疫熒光染色檢測Sec61的表達(dá)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM2000說明書分別將siRNA-Control和siRNA-Sec61干擾序列(工作濃度為50 nmol/L)轉(zhuǎn)染至BEAS-2B細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)分為4組，即對照組、PM2.5組、siRNA-Control組、siRNA-Sec61組。對照組使用未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的BEAS-2B細(xì)胞，加入PBS作為對照；PM2.5組使用未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的BEAS-2B細(xì)胞，加入100 μg/ml的PM2.5刺激48 h；siRNA-Control組和siRNA-Sec61組分別使用轉(zhuǎn)染siRNA-Control或siRNA-Sec61序列的細(xì)胞，加入100 μg/ml的PM2.5刺激48 h。收集細(xì)胞，使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Western blot檢測細(xì)胞中Sec61、MUC5AC、GRP78的表達(dá)，使用免疫熒光染色檢測細(xì)胞中MUC5AC和游離鈣離子的表達(dá)。

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡 使用含有PMSF的RIPA裂解液對細(xì)胞進(jìn)行充分裂解，12 000 r/min離心5 min，收集上清液進(jìn)行蛋白定量。取40 μg的總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜后加入5%的牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入抗Sec61抗體(1∶500)、抗MUC5AC抗體(1∶1 000)、抗GRP78抗體(1∶500)和抗GAPDH抗體(1∶3 000)4℃過夜孵育。洗滌后，加入含辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體室溫孵育1 h，經(jīng)洗滌、顯色后，使用凝膠成像儀拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定各條帶的灰度值，將對照組中目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度值之比作為100。

1.2.5熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，各基因的引物序列見表1。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像儀拍照，Image Pro Plus 6.0軟件測定各條帶的灰度值，將對照組中目的基因與GAPDH基因的灰度值之比作為100。

1.2.6細(xì)胞免疫熒光染色 4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，5%的牛血清白蛋白封閉1 h，加入抗Sec61抗體(1∶100)和抗MUC5AC抗體(1∶100)4℃過夜。次日，PBS洗滌后加入含有FITC熒光標(biāo)簽的山羊抗兔二抗37℃孵育30 min，PBS洗滌后DAPI染色10 min，洗滌后熒光顯微鏡下拍照。

1.2.7胞內(nèi)游離鈣離子的檢測 PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入Fluo-4/AM熒光染料(5 μmol/L)于37℃避光孵育60 min，PBS洗滌，于37℃繼續(xù)孵育20 min，以保證Fluo-4/AM在細(xì)胞內(nèi)充分轉(zhuǎn)化為Fluo-4，然后使用激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為516 nm[12]。

2 結(jié)果

2.1PM2.5刺激對Sec61表達(dá)的影響 隨著PM2.5刺激濃度的增加和刺激時(shí)間的延長，Sec61蛋白質(zhì)的表達(dá)量逐漸升高，刺激濃度為100 μg/ml、刺激時(shí)間為48 h時(shí)，Sec61的表達(dá)量最高，見圖1。使用100 μg/ml的PM2.5刺激48 h，細(xì)胞中Sec61的免疫熒光強(qiáng)度明顯高于對照組，見圖2。

圖1 Western blot檢測PM2.5刺激對Sec61表達(dá)的影響Fig.1 Influence of PM2.5 stimulation on Sec61 express-ion was examined by Western blotNote:A.Influence of different stimulation concentrations on Sec61 expression;B.Influence of different stimulation time on Sec61 expression.Compared with 0 μg/ml group,*.P<0.05;compared with 25 μg/ml,#.P<0.05;compared with 100 μg/ml,▲.P<0.05;compared with 200 μg/ml,★.P<0.05.

圖2 細(xì)胞免疫熒光染色檢測PM2.5刺激(100 μg/ml，48 h)對Sec61表達(dá)的影響Fig.2 Influence of PM2.5 stimulation (100 μg/ml,48 h) on Sec61 expression was examined by immunofluorescence stainingNote:Scale bar.25 μm.

2.2Sec61沉默對Sec61表達(dá)的抑制效果 與對照組比較，PM2.5組細(xì)胞中Sec61 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PM2.5組比較，siRNA-Control組細(xì)胞中Sec61 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與siRNA-Control組比較，siRNA-Sec61組細(xì)胞中Sec61 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 Sec61沉默對Sec61表達(dá)的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of Sec61 silencing on Sec61expressionNote:A.qRT-PCR was used to detect the mRNA expression of Sec61;B.Western blot was used to detect the protein expression of Sec61.Compared with contrd group,*.P<0.05;compared with siRNA-control group;▲.P<0.05.

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GenePrimer sequenceSec61Forward primer5′-TGTCATCTCCCAAATGCTCTCA-3′Reverse primer5′-ACAGGTAATAGCAAAGGCCAC-3′MUC5ACForward primer5′-CAGCACAACCCCTGTTTCAAA-3′Reverse primer5′-GCGCACAGAGGATGACAGT-3′GRP78Forward primer5′-CGTCCTATGTCGCCTTCACT-3′Reverse primer5′-AATGTCTTTGTTTGCCCACC-3′GAPDHForward primer5′-GATTGTTGCCATCAACGACC-3′Reverse primer5′-GTGCAGGATGCATTGCTGAC-3′

2.3Sec61沉默對MUC5AC表達(dá)的影響 與對照組相比較，PM2.5組細(xì)胞中MUC5AC mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PM2.5組相比較，siRNA-Control組細(xì)胞中MUC5AC mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與siRNA-Control組相比較，siRNA-Sec61組細(xì)胞中MUC5AC mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 檢測Sec61沉默對MUC5AC表達(dá)的影響Fig.4 Influence of Sec61 silencing on MUC5AC express-ion was examinedNote:A.qRT-PCR was used to detect the mRNA expression of MUC5AC;B.Western blot was used to detect the protein expression of MUC5AC.Compared with control group,*.P<0.05;compared with PM2.5 group,#.P<0.05;compared with siRNA-control group,▲.P<0.05.

與對照組相比較，PM2.5組細(xì)胞中MUC5AC的熒光強(qiáng)度明顯升高；與PM2.5組相比較，siRNA-Control組細(xì)胞中MUC5AC的熒光強(qiáng)度無明顯差異；與siRNA-Control組相比較，siRNA-Sec61組細(xì)胞中MUC5AC的熒光強(qiáng)度明顯降低，見圖5。

圖5 細(xì)胞免疫熒光染色檢測Sec61沉默對MUC5AC表達(dá)的影響Fig.5 Influence of Sec61 silencing on MUC5AC express-ion was examined by immunofluore-scence stainingNote:Scale bar.50 μm.

2.4Sec61沉默對GRP78表達(dá)的影響 與對照組相比較，PM2.5組細(xì)胞中GRP78 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PM2.5組相比較，siRNA-Control組細(xì)胞中GRP78 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與siRNA-Control組相比較，siRNA-Sec61組細(xì)胞中GRP78 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 Sec61沉默對GRP78表達(dá)的影響Fig.6 Influence of Sec61 silencing on GRP78 expressionNote:A.qRT-PCR was used to detect the mRNA expression of GRP78;B.Western blot was used to detect the protein expression of GRP78.Compared with control group,*.P<0.05;compared with PM2.5 group,#.P<0.05;compared with siRNA-control group,▲.P<0.05.

2.5Sec61沉默對細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的影響 與對照組比較，PM2.5組細(xì)胞中游離鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯升高；與PM2.5組相比較，siRNA-Control組細(xì)胞中游離鈣離子的熒光強(qiáng)度無明顯差異；與siRNA-Control組相比較，siRNA-Sec61組細(xì)胞中游離鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯降低，見圖7。

圖7 Sec61沉默對細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的影響Fig.7 Influence of Sec61 silencing on concentration of intracellular calcium ionsNote:Scale bar.25 μm.

3 討論

PM2.5是空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于或等于2.5 mm的大氣顆粒物，是空氣污染的重要組成部分，主要包含重金屬顆粒、酸性氧化物、有機(jī)污染物、細(xì)菌、真菌、病毒等，吸入后可以沉積在遠(yuǎn)端氣道和肺泡中，引起異常的免疫炎癥反應(yīng)[13]。流行病學(xué)研究表明，空氣中PM2.5濃度每上升10 mg/m3，呼吸系統(tǒng)疾病的死亡率可增加2%，慢性阻塞性肺疾病患者的住院率可增加1.72%～6.87%[14]，因此研究PM2.5對呼吸系統(tǒng)的損傷機(jī)制以及開展針對性的治療具有重要意義。

支氣管上皮細(xì)胞分泌黏液有助于清除進(jìn)入肺部的病原體或顆粒物質(zhì)，在呼吸道的防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但是在PM2.5的長期刺激下，過多的黏液分泌會(huì)產(chǎn)生黏液栓，導(dǎo)致呼吸功能受損，甚至死亡。MUC5AC是呼吸道黏液的主要組成成分，可在病毒、細(xì)菌、煙霧等外界刺激物直接誘導(dǎo)產(chǎn)生，也可以在IL-4、IL-13、TNF-α等炎癥因子的間接作用下上調(diào)表達(dá)，因此在支氣管哮喘、呼吸道感染、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統(tǒng)疾病中大量表達(dá)和分泌[15-17]。同樣，PM2.5也可以誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞大量分泌MUC5AC，而且MUC5AC被糖基化和硫酸化修飾，使氣道黏液呈酸性和黏稠狀[3]。MUC5AC的初始肽鏈在細(xì)胞的核糖體中合成后，可轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的折疊與加工，糖基化和硫酸化修飾也在此完成。綜上，本文認(rèn)為MUC5AC從核糖體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程在PM2.5誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞黏液高分泌狀態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，若阻斷該轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的關(guān)鍵分子可能在PM2.5相關(guān)損傷中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。

Sec61是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的雙向通道蛋白，參與調(diào)節(jié)多肽鏈向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及鈣離子向胞質(zhì)的釋放[5]。為了研究Sec61是否參與PM2.5誘導(dǎo)MUC5AC高表達(dá)，本文使用PM2.5刺激支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著PM2.5刺激濃度的增加和刺激時(shí)間的延長，Sec61蛋白質(zhì)的表達(dá)量逐漸升高，表明PM2.5可以誘導(dǎo)Sec61高表達(dá)，且呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。當(dāng)刺激濃度為100 μg/ml、刺激時(shí)間為48 h時(shí)，Sec61的表達(dá)量最高，細(xì)胞中Sec61的免疫熒光強(qiáng)度也明顯高于對照組，因此本文在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均使用該刺激條件進(jìn)行研究。

本文設(shè)計(jì)和構(gòu)建了Sec61的小分子RNA干擾序列，轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)與siRNA-Control組比較，siRNA-Sec61組細(xì)胞中Sec61 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低，表明Sec61的小分子RNA干擾序列構(gòu)建成功。為了研究Sec61的沉默是否影響MUC5AC的表達(dá)，本文分別使用RT-PCR、Western blot以及免疫熒光染色對MUC5AC的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示與siRNA-Control組相比較，siRNA-Sec61組細(xì)胞中MUC5AC mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低，免疫熒光強(qiáng)度也明顯降低，表明Sec61沉默可以抑制PM2.5誘導(dǎo)的MUC5AC高表達(dá)，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能因?yàn)镾ec61通道蛋白數(shù)量的降低，使MUC5AC新生肽鏈無法有效進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，從而積聚在細(xì)胞質(zhì)中，負(fù)反饋調(diào)節(jié)使MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯水平降低。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和鈣離子失衡在PM2.5誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要的病理作用，而且Sec61與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、鈣離子穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，如Schauble等[18]發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌外毒素A可以抑制鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔向胞質(zhì)中釋放鈣離子，主要機(jī)制是其與Sec61α亞基的氨基端結(jié)合，介導(dǎo)Sec61通道蛋白的關(guān)閉；王軍等[7]也在脂肪變性的肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Sec61蛋白的表達(dá)可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了進(jìn)一步研究Sec61沉默抑制MUC5AC高表達(dá)的機(jī)制，本文對細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平和胞內(nèi)游離鈣離子濃度進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示與siRNA-Control組相比較，siRNA-Sec61組細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低，細(xì)胞中游離鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯降低，表明Sec61沉默可以降低PM2.5誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔向胞質(zhì)的釋放。

本文的不足和展望：①本文僅使用了體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，但是細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)具有穩(wěn)定性差、無法模擬體內(nèi)環(huán)境等缺點(diǎn)，相關(guān)結(jié)論仍需要構(gòu)建相關(guān)的動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證；②本文使用小分子RNA干擾的方法抑制Sec61的表達(dá)，但是該方法發(fā)揮抑制效應(yīng)的時(shí)間較短，一般在7 d左右，因此未來需要進(jìn)一步開發(fā)穩(wěn)定、高效、安全的抑制藥物應(yīng)用于臨床。

綜上所述，PM2.5可以誘導(dǎo)Sec61高表達(dá)，呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。使用小分子RNA沉默Sec61表達(dá)可以顯著抑制MUC5AC高表達(dá)，可能與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和鈣離子穩(wěn)態(tài)有關(guān)。