曹二龍 譚 瀟 劉選梅 肖 非 馬 婷 賀印旎

(邵陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)教研室，邵陽 422000)

肺炎克雷伯菌是全世界社區(qū)獲得性和醫(yī)院感染最常見的革蘭陰性細(xì)菌，常見于免疫功能低下人群。肺炎克雷伯菌的主要毒力因子包括細(xì)菌表面成分是莢膜多糖(CPS)和脂多糖(LPS)[1]。有研究表明，K1血清型肺炎克雷伯菌(K1-CPS)的CPS可通過Toll樣受體4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6。在機(jī)體固有免疫系統(tǒng)與各種病原微生物相互作用過程中，具備多種機(jī)制拮抗病原微生物感染。短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(Short palate,lung,and nasal epithelium clone 1，SPLUNC1)是從軟腭、肺、懸雍垂和鼻腔分泌的一種先天免疫蛋白，主要由大氣道上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌[2]。SPLUNC1具有殺菌/通透性增加蛋白功能，同時(shí)也可抑制細(xì)菌生物膜的形成，并是某些惡性腫瘤的負(fù)調(diào)控因子[3]。在慢性氣道炎癥患者中，SPLUNC1表達(dá)水平升高，并且過表達(dá)SPLUNC1的小鼠對(duì)對(duì)銅綠假單胞菌和肺炎支原體的耐受顯著增高。此外，也有研究表明SPLUNC1與革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖結(jié)合[4]。因此，SPLUNC1可能是機(jī)體抵抗微生物感染的一種重要機(jī)制。在先前的研究中，Liu等[5]發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌感染后可引起SPLUNC1表達(dá)增高，后者可調(diào)節(jié)氣道液表面張力而阻止肺炎克雷伯菌生物膜形成。但肺炎克雷伯菌誘導(dǎo)SPLUNC1表達(dá)的機(jī)制目前仍不明確。本研究旨在觀察肺炎克雷伯菌CPS對(duì)人肺上皮細(xì)胞表達(dá)SPLUNC1的影響，并探討其在介導(dǎo)細(xì)胞因子分泌中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 TNF-α和IL-8 ELISA試劑盒為eBioscience產(chǎn)品；實(shí)時(shí)定量PCR SYBR Green mix購自天根生化科技有限公司；LPS(E.coli 0111:B4)購自Sigma-Adrich；抗IκB多克隆抗體、SPLUNC1單克隆抗體購自Santa Cruz；NF-κB活性檢測試劑盒購自Cayman；PDTC購自Calbiochem。

1.2方法

1.2.1肺炎克雷伯菌的培養(yǎng)與夾膜多糖提取 肺炎克雷伯菌(ATCC)用含有100 μg/ml氨芐青霉素或50 μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按照參考文獻(xiàn)提供的方法提取CPS[6]。即將培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌用25 ml蒸餾水重懸浮，100℃加熱10 min以釋放其莢膜成分。隨后加入體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮4℃孵育2 h以沉淀CPS。沉淀物室溫干燥過夜后用PBS重懸浮，30 000 g離心去除不溶物。隨后將上清在4℃、100 000 g離心8 min，棄沉淀(LPS和蛋白)。上清用RNase B(30 μg/ml)和Dnase Ⅰ(70 μg/ml)在37℃消化24 h，然后用鏈霉蛋白酶溶液(含10 mmol/L Tris HCl，pH7.4，1 mmol/L CaCl2)消化24 h。最后用50 kD的透析膜對(duì)樣品進(jìn)行透析、凍干。CPS粗提物隨后在TSK HW-65F柱上進(jìn)一步純化，最后用0～2 mol/L NaCl洗脫。最后采用高效體積排阻色譜法進(jìn)一步分離LPS。苯酚-濃硫酸法測定CPS的濃度，即在不同濃度的葡萄糖溶液2.0 ml中加入6%苯酚1.0 ml及濃硫酸5.0 ml，充分反應(yīng)后于490 nm測定其吸光值(OD)。以糖濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述提取的CPS 2 ml，重復(fù)上述測量標(biāo)準(zhǔn)品濃度的步驟，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中多糖的含量。刺激細(xì)胞前采用2-酮基-3-脫氧辛酸(KOD)-硫代巴比妥酸法測定CPS中LPS的含量以排除LPS污染。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理 NCI-H292細(xì)胞用有10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2培養(yǎng)。當(dāng)NCI-H292細(xì)胞生長至80%～90%密度時(shí)，加入0.5～3 μg/ml CPS孵育24 h。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測 mRNA表達(dá) 通過逆轉(zhuǎn)錄測定上皮細(xì)胞中SPLUNC1 mRNA的水平，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。使用TRIzol試劑提取總RNA。在50 μl反應(yīng)中使用1 μg總RNA和隨機(jī)六聚體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用Primer Express軟件設(shè)計(jì)用于人SPLUNC1基因的引物和探針。人SPLUNC1：正向引物，5′-GGGCCTGTTGGGCATTCT-3′;反向引物：5′-CCTCCTCCAGGCTTCAGGAT-3′;探針，5′-AAACCTTCCGCTCCTGGA-3′。在ABI Prism 7700序列檢測系統(tǒng)上進(jìn)行PCR。 25 μl PCR反應(yīng)含有30 ng cDNA，100 nmol/L熒光探針和200 nmol/L引物以及來自TaqMan RT-PCR試劑盒的其他組分。采用比較閾值循環(huán)(CT)方法，通過計(jì)算其與管家基因GAPDH的比值來確定相對(duì)基因表達(dá)水平。

1.2.4NF-κB活性測定 通過使用Nuclear Extract Kit(Active Motif)提取核蛋白，并通過使用Bio-Rad蛋白質(zhì)測定法(Bio-Rad Life Science Research)測定蛋白質(zhì)濃度。NF-κBp65活性測定采用Active Motif提供的TransAM NF-κBp65 ELISA試劑盒進(jìn)行，在該試劑盒中，通過將5 μg核蛋白加至反應(yīng)孔中，最后通過測定其吸光度，間接測定p65與其DNA結(jié)合的含量。

1.2.5Western blot檢測IκB表達(dá) 按照參考文獻(xiàn)提供的方法提取細(xì)胞總蛋白[7]。首先采用SDS-PAGE分離并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后依次與一抗(抗IκB或β-actin)和二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL發(fā)光和Kodak X-OMAT LS膠片顯影。

1.2.6ELISA檢測TNF-α、IL-8及SPLUNC1分泌 處理結(jié)束后獲取細(xì)胞上清用于ELISA測定TNF-α和IL-8。檢測方法按照參考文獻(xiàn)提供的步驟進(jìn)行[8]。檢測靈敏度為7 pg/ml。使用直接ELISA測定人SPLUNC1蛋白。即首先將重組人SPLUNC1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋為不同濃度并包被在96孔板上(PA)，隨后依次加入小鼠抗SPLUNC1抗體(1 μg/ml)、生物素化的抗小鼠抗體和抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶共孵育。最后用TMB顯色，酶標(biāo)儀獲取其吸光度，以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定培養(yǎng)上清中SPLUNC1濃度方法同上，最后用CurveExpert軟件計(jì)算出培養(yǎng)上清中SPLUNC1濃度(ng/ml)。

1.2.7RNA干擾實(shí)驗(yàn)使用siRNA沉默基因沉默SPLUNC1。即將NCI-H292細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔的密度接種到6孔板中。12 h后(約60%～70%密度)根據(jù)DharmaFECT Transfection Reagents(Thermo Scientific)提供的步驟，分別將陰性對(duì)照siRNA或SPLUNC1 siRNA(75 pmol)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中。24 h后，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，采用Western blot對(duì)其干擾效率進(jìn)行分析并用于下一步處理。本文所用的SPLUNC1 siRNA序列為5′-GCCTGAACAACATCATTGATT-3′，對(duì)照siRNA(Scrambled siRNA)5′-UUCUCCGAACGTGUCACGUUU-3′。所用siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1肺炎克雷伯菌夾膜多糖誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞表達(dá)SPLUNC1 mRNA和蛋白 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組SPLUNC1 mRNA表達(dá)水平很低。加入0.1 μg/ml、1 μg/ml和3 μg/ml CPS后，SPLUNC1 mRNA隨之增高(圖1A)。此外，SPLUNC1的蛋白水平也與mRNA趨勢(shì)類似(圖1B)。

圖1 不同濃度CPS對(duì)SPLUNC1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Different concentration of CPS on SPLUNC1 mRNA and protein expressionNote:Compared with control group，*.P<0.05.

2.2夾膜多糖激活NCI-H292細(xì)胞NF-κB NF-κB活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.1 μg/ml、1 μg/ml和3 μg/ml處理可明顯增強(qiáng)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的活性(圖2A)。此外，Western blot結(jié)果也顯示，CPS孵育后，可明顯促進(jìn)IκB的降解(圖2B)。

圖2 不同濃度莢膜多糖激活NF-κBFig.2 Activation of NF-κB by different concentration of CPSNote:A.Activation of NF-κB by CPS, *.P<0.05, as compared with the control group (0 μg/ml);B.CPS induced degradation of IκB.

2.3夾膜多糖經(jīng)NF-κB誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8 ELISA結(jié)果顯示，NCI-H292細(xì)胞經(jīng)不同濃度CPS孵育24 h后，與陰性對(duì)照組相比，TNF-α和IL-8分泌水平明顯增高。而同時(shí)加入20 μmol/L NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理后，TNF-α和IL-8的含量進(jìn)一步降低(圖3)。

圖3 夾膜多糖誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8Fig.3 CPS induces NCI-H 292 cells secretion of TNF-α and IL-8Note:*.P<0.05, as compared between the groups.

2.4沉默SPLUNC1增強(qiáng)夾膜多糖誘導(dǎo)TNF-α和IL-8分泌 為了進(jìn)一步明確SPLUNC1在CPS誘導(dǎo)TNF-α和IL-8分泌中的作用，隨后采用siRNA沉默SPLUNC1后，再加入CPS孵育，結(jié)果顯示與未沉默的對(duì)照組相比，干擾SPLUNC1后TNF-α和IL-8分泌有所增多(圖4)。

圖4 沉默SPLUNC1對(duì)TNF-α和IL-8的影響Fig.4 Effect of TNF-α and IL-8 secretion after silence of SPLUNC1Note:A.Silence of SPLUNC1 by siRNA;B and C.Effect of SPLUNC1 siRNA on TNF-α and IL-8 production.*.P<0.05, as compared with the control siRNA.

3 討論

SPLUNC是近年來從軟腭、肺、懸雍垂和鼻腔上皮細(xì)胞中鑒定出的一種蛋白家族分子，目前發(fā)現(xiàn)的 10種PLUNC，其中SPLUNC1主要表達(dá)于人和小鼠的大氣道上皮。研究表明，SPLUNC1是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)多種病原微生物如肺炎支原體、銅綠假單胞菌的入侵具有抵抗作用[9,10]。近年也有研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1也能抑制肺炎克雷伯菌生長[10]，但肺炎克雷伯菌感染后，都能反饋性上調(diào)SPLUNC1表達(dá)目前仍不明確。對(duì)于肺炎克雷伯菌而言，其CPS是重要的致病物質(zhì)。為了探討其是否能誘導(dǎo)SPLUNC1表達(dá)，本研究首先檢測了CPS處理后SPLUNC1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPS處理可明顯上調(diào)SPLUNC1 mRNA和蛋白的表達(dá)。為了明確SPLUNC1對(duì)炎癥反應(yīng)的作用，我們觀察了CPS對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPS處理后，隨著劑量的上升，TNF-α和IL-8水平逐漸增高，這表明CPS對(duì)細(xì)胞因子分泌具有促進(jìn)作用。對(duì)于病原微生物感染來說，其所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)往往與激活其胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB有關(guān)[11]。為了觀察CPS是否能影響NF-κB的活性，本研究檢測了細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65亞基的含量，后者是NF-κB激活的標(biāo)志。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)CPS處理組相比，CPS處理后細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的活性明顯增高。由于NF-κB在未激活狀態(tài)下，p65和IκB結(jié)合于細(xì)胞漿中，當(dāng)細(xì)胞被外源性刺激激活時(shí)，IκB降解，隨后釋放p65至細(xì)胞核中發(fā)揮作用。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，采用CPS刺激后，IκB水平明顯降低。這表明CPS能上調(diào)NF-κB的活性，最終誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌。有研究表明，SPLUNC1對(duì)多種病原微生物所致的炎癥反應(yīng)具有抑制作用[12]。既然CPS能通過激活NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌，同時(shí)也能反饋性上調(diào)SPLUNC1表達(dá)，那么，SPLUNC1是否參與了CPS所致的炎癥反應(yīng)呢？為了進(jìn)一步明確SPLUNC1在CPS影響TNF-α和IL-8分泌中的作用，本研究采用siRNA干擾SPLUNC1表達(dá)后，再用CPS孵育，結(jié)果顯示與對(duì)照siRNA組相比，沉默SPLUNC1后，CPS對(duì)TNF-α和IL-8分泌作用有所增多，跟LPS類似。這表明SPLUNC1能在一定程度上負(fù)向調(diào)控包括夾膜多糖和LPS在內(nèi)的病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌。

綜上所述，盡管肺炎克雷伯菌經(jīng)宿主固有免疫系統(tǒng)或呼吸道上皮細(xì)胞識(shí)別后，可誘發(fā)固有免疫應(yīng)答從而參與其清除。但細(xì)胞因子的過度分泌本身也會(huì)帶來不利影響。機(jī)體在進(jìn)化過程中已經(jīng)形成了一種精密的負(fù)向調(diào)控機(jī)制及時(shí)調(diào)控炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，從而維持機(jī)體的免疫平衡。本研究表明SPLUNC1可能是在肺炎克雷伯菌感染后維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要分子，但其究竟是通過何種機(jī)制影響細(xì)胞因子分泌仍不清楚。有研究顯示，SPLUNC1能和TLR2受體結(jié)合而抑制IL-8的分泌[9]，此外，SPLUNC1也能影響某些鈉離子通道蛋白的活性，促進(jìn)病原體清除[13]?？傊壳皩?duì)SPLUNC1的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，SPLUNC1針對(duì)不同病原體是否存在不同機(jī)制，仍有待深入研究。