尹 翠 張奉明 朱 玲 畢凌波 顧佳慧 李 捷 張笑婷

江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004

良好的麻醉效果是實(shí)施動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的重要保證，決定著能否獲得客觀而真實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。目前國內(nèi)醫(yī)學(xué)、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，小鼠麻醉經(jīng)常使用水合氯醛和戊巴比妥鈉，二者作用機(jī)制相近，都是小劑量鎮(zhèn)靜，中等劑量催眠，大劑量有麻醉與抗驚厥作用[1-4]。麻醉效果取決于多種因素，如動(dòng)物品系、麻醉劑量等，如麻醉方法不當(dāng)容易導(dǎo)致小鼠死亡[5-6]。樹膠脂毒素(resiniferatoxin，RTX)是辣椒素(capsaicin，CAP)的高效能類似物，它是目前已知的最有效的瞬時(shí)受體電位通道香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)激動(dòng)劑[7-10]。RTX引起的刺激使TRPV1激活離子通道通透性增加，陽離子(主要是鈣離子)內(nèi)流導(dǎo)致神經(jīng)元去極化，這種刺激后可引起神經(jīng)元脫敏從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[11-15]。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用RTX用于殺死成年小鼠的外周感覺神經(jīng)纖維，但對(duì)于RTX處理不同種系小鼠的生存率以及戊巴比妥鈉和水合氯醛對(duì)其病死率的影響尚無報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過觀察水合氯醛和戊巴比妥鈉對(duì)樹膠脂毒素處理后小鼠不同種屬存活率的影響，可為科研工作者進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)麻醉提供參考。

1 材料與方法

1．1主要試劑和設(shè)備1.0 mL注射器，戊巴比妥鈉(生產(chǎn)批號(hào)：B17P0704V，北京普魯頓生物科技公司)，水合氯醛(批號(hào)：20160715，國藥集團(tuán))，樹膠脂毒素(批號(hào)：APN14259-1-1，Abcam公司，美國)，阿托品(生產(chǎn)批號(hào)：1611251，天津金耀藥業(yè)有限公司)，氨茶堿(生產(chǎn)批號(hào)：1702091，天津金耀藥業(yè)有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)(生產(chǎn)批號(hào)：B326BA3887，上海生工生物工程股份有限公司)，0.9% 氯化鈉注射液，分析天平(上海精天電子儀器有限公司)。

1．2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)健康成年C57BL/6小鼠24只，體質(zhì)量24～28 g；Kunming種小鼠55只，體質(zhì)量28～35 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于空氣過濾系統(tǒng)，自由進(jìn)食飲水，晝夜節(jié)律，光照周期12 h，光照時(shí)間07：00～19：00。所有動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作程序符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理會(huì)批準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：C57BL/6小鼠溶劑對(duì)照組(Ⅰ組，12只)、C57BL/6小鼠RTX組(Ⅱ組，12只)、Kunming小鼠溶劑對(duì)照組(Ⅲ組，10只)、Kunming小鼠RTX組(Ⅳ組，45只)。

1．3藥物的配制RTX根據(jù)說明書加入溶劑DMSO配制成濃度為100 mM的存儲(chǔ)液，實(shí)驗(yàn)中的RTX根據(jù)要求吸取所需劑量并用0.9%的氯化鈉注射液稀釋配制。水合氯醛和戊巴比妥鈉分別用分析天平稱量所需用量并用0.9%的氯化鈉注射液稀釋配成10%水合氯醛和2%戊巴比妥鈉溶液。

1．4實(shí)驗(yàn)方法按前述分組，根據(jù)ENGEL 等[16]描述的方法，4組小鼠連續(xù)3 d皮下注射RTX或溶劑，2次/d，第1、2和3天的單次給藥劑量分別為30 μg/kg、70 μg/kg和100 μg/kg。因RTX對(duì)呼吸系統(tǒng)具有毒性，所以在每次注射RTX前都給小鼠腹腔注射防止呼吸衰竭的保護(hù)性混合藥物(0.1 mL/10 g)：0.4 mL特布他林(0.5 mg/mL)+ 0.2 mL阿托品(1 mg/mL)+ 0.4 mL氨茶堿(240 mg/5 mL)，小鼠在最后一次注射RTX后每天觀察小鼠死亡情況。2周后，存活的C57BL/6小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg，0.1 mL/20 g)麻醉，存活的Kunming小鼠腹腔注射10%水合氯醛(500 mg/kg，0.1 mL/20 g)麻醉。在相同實(shí)驗(yàn)室條件下：室溫20～23 ℃和相對(duì)濕度40%～60%，觀察小鼠病死率情況。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；2組比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

C57BL/6小鼠在皮下注射RTX后，Ⅱ組第24小時(shí)內(nèi)死亡4只，第2天和第3天無小鼠死亡，總病死率為33.3%，而Ⅰ組無小鼠死亡，總病死率為0；Kunming小鼠在皮下注射RTX后，Ⅲ組和Ⅳ組均無小鼠死亡，即總病死率為0。與Ⅰ組、Ⅳ組比較，Ⅱ組病死率顯著增高(P<0.05，表1)。4組小鼠在麻醉中均保持良好的麻醉狀態(tài)，生命體征平穩(wěn)，麻醉時(shí)間大約維持在180 min。在麻醉復(fù)蘇期間，為了避免小鼠遭受同籠其他未麻醉小鼠侵襲咬死的危險(xiǎn)，故單獨(dú)飼養(yǎng)復(fù)蘇，底部有保溫的電熱毯。在腹腔注射2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg，0.1 mL/20 g)麻醉后，Ⅰ組和Ⅱ組的病死率都為0；在腹腔注射10%水合氯醛(500 mg/kg，0.1 mL/20 g)麻醉后，Ⅲ組病死率為0，Ⅳ組的小鼠在麻醉后1～2 d內(nèi)相繼萎靡不振并全部死亡，病死率為100%。所以與Ⅱ組、Ⅲ組比較，Ⅳ組的病死率顯著增高(P<0.01，表2)。

表1 4組皮下注射RTX后死亡數(shù)量比較

表2 不同麻醉藥對(duì)RTX處理后4組病死率比較

3 討論

RTX是一種天然存在的化學(xué)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)于摩洛哥的大戟科白角麒麟，它是辣椒素的高效能類似物，活性成分估計(jì)比辣椒素高500～1 000倍。RTX是目前已知的最有效的TRPV1激動(dòng)劑，可導(dǎo)致通道開放和鈣離子內(nèi)流時(shí)間過度延長，從而產(chǎn)生對(duì)TRPV1陽性痛覺纖維或細(xì)胞體的細(xì)胞毒作用[17-22]。RTX通過多覺型傷害性感受器引發(fā)炎癥和疼痛，然后通過該途徑進(jìn)一步引起反應(yīng)缺失，該過程稱為脫敏[23-27]。它對(duì)神經(jīng)源性炎癥的脫敏從開始到消失多達(dá)7 d，而對(duì)疼痛的脫敏可持續(xù)3周左右[28]。同時(shí)RTX是有毒的，人體攝入10 g即可對(duì)健康造成嚴(yán)重?fù)p害甚至危及生命。雖然RTX在科研實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，但國內(nèi)對(duì)其的報(bào)道少之又少。我們實(shí)驗(yàn)室用RTX殺死外周TRPV1陽性感覺神經(jīng)纖維，在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，通過皮下注射RTX可導(dǎo)致C57BL/6小鼠死亡，卻不會(huì)導(dǎo)致Kunming小鼠的死亡。因此，不同種屬的小鼠對(duì)RTX的耐受可能不同，可根據(jù)實(shí)際情況選擇小鼠的種屬。

一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，特別是手術(shù)等實(shí)驗(yàn)，為減少動(dòng)物的掙扎和保持其安靜，常對(duì)動(dòng)物采用必要的麻醉。麻醉質(zhì)量決定著動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是否成功，麻醉質(zhì)量的控制非常關(guān)鍵，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉藥物及劑量的正確選擇，可以將麻醉對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理功能的影響降低至最低限度，從而保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。水合氯醛和戊巴比妥鈉現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的麻醉，水合氯醛因只產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠作用國外已經(jīng)不允許使用，但由于其價(jià)格比較低，國內(nèi)還在廣泛使用。臨床上，水合氯醛在小兒鎮(zhèn)靜中應(yīng)用較廣[29]，但也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)[30]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以及本實(shí)驗(yàn)室多年麻醉經(jīng)驗(yàn)，水合氯醛對(duì)于Kunming小鼠的麻醉較為安全，且性價(jià)比高；對(duì)于C57BL/6小鼠更傾向于戊巴比妥鈉麻醉。對(duì)于RTX處理后的小鼠如何麻醉尚無文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)表明RTX處理后的Kunming小鼠，在水合氯醛麻醉后的1～2 d內(nèi)小鼠全部死亡；而戊巴比妥鈉對(duì)RTX處理后的C57BL/6小鼠無影響。同時(shí)，水合氯醛對(duì)Kunming小鼠溶劑對(duì)照組無影響，說明不是麻醉劑量過大導(dǎo)致小鼠死亡。水合氯醛對(duì)動(dòng)物胃黏膜和呼吸道影響較大，RTX對(duì)呼吸系統(tǒng)也有不良影響，小鼠的死亡不能排除呼吸抑制的影響。根據(jù)筆者的觀察，死亡的Kunming小鼠在麻醉復(fù)蘇后精神狀態(tài)差，萎靡不振，所以精神損傷的可能性較大，具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。RTX對(duì)于不同種屬的小鼠病死率有著不同的影響，水合氯醛對(duì)于RTX處理后Kunming小鼠有著明顯的致死作用，此現(xiàn)象希望為科研工作者進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供參考。