覃燕靈 董建國(guó) 王艷午

（1 廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場(chǎng)， 廣西南寧 530000； 2 信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院， 河南信陽(yáng) 464000；3 廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)金光有限公司， 廣西南寧 530000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）引起的豬的一種高度接觸性傳染病，又稱(chēng)藍(lán)耳病。臨床上以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡階段豬只的呼吸道癥狀為主要特征。該病于1987 年在美國(guó)暴發(fā)[1]，1996 年郭寶清等[2]首次從北京地區(qū)暴發(fā)流行病豬的流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離到PRRSV，2006 年春夏季首次暴發(fā)由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly-pathogentic PRRSV,HP-PRRSV）引起的“豬無(wú)名高熱病癥”給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損害[3-4]。2015 年我國(guó)暴發(fā)由NADC30-like 毒株引起的PRRS，再次嚴(yán)重打擊了養(yǎng)豬業(yè)[5-6]。

PRRSV 屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，基因組為單股正鏈RNA，基因組全長(zhǎng)約15 kb[7]。由9 個(gè)開(kāi)放閱讀 框（ORF）：ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-ORF7 組成[8-9]。ORF5 編碼的GP5 是PRRSV 的膜蛋白。該蛋白是變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白，成為PRRSV遺傳變異分析的靶基因[10]。本研究通過(guò)對(duì)一例豬場(chǎng)的疑似PRRS 陽(yáng)性病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷分析，以期為疾病的診斷提供科學(xué)的思路。

1 材料與方法

1.1 病料樣品采集

2018 年3 月，駐馬店地區(qū)某豬場(chǎng)疑似PRRS 的豬，采集豬肺臟組織，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

TRIzol 試劑、dNTP Mixture、DL 2 000 Marker、LA Taq DNA 聚合酶、動(dòng)物總RNA 快速提取試劑盒來(lái)自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank 中收錄的PRRS 基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF5 的引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物序列ORF5-F：ACCACCGCAGCATCA GACTTCGTT（5'—3'），下游引物序列：ORF5-R：CGGCCGCGACTTACCTTTAGAGC（5'—3'），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為760 bp，退火溫度為60℃。

1.4 組織總RNA 的提取和ORF5 基因的擴(kuò)增鑒定

采集病豬肺臟組織，用剪刀剪碎，加入少量無(wú)菌PBS 并用研磨器研磨成汁，12 000 r/min 離心5 min，取上清按照試劑盒操作說(shuō)明提取病料組織總RNA。取6 μL RNA 模 板、 12.5 μL 2 ×FastKing One Step RT-PCR Master Mix、1 μL 25×RT-PCR Enzyme Mix、上下游引物各1.25 μL、RNase-Free ddH2O 3 μL 共25 μL 體系，在儀器內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：42℃30 min，95℃3 min；94℃30 sec，60℃30 sec，72℃30 sec，35 個(gè)循環(huán)；72℃5 min。擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 ORF5 基因序列比對(duì)和進(jìn)化分析

將鑒定陽(yáng)性的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，隨后將獲得的序列與PRRSV 代表毒株用DNAStar 進(jìn)行序列比對(duì)并用Mega 進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 臨床病變

由圖1 可知，病豬肺臟組織出現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎病變，且肺臟萎縮實(shí)變，說(shuō)明豬只肺臟病變嚴(yán)重。

圖1 病豬肺臟病變圖

2.2 PCR 鑒定結(jié)果

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增出PRRSV ORF5 基因片段，片段大小為603 bp，說(shuō)明引起該病的病原為PRRSV。見(jiàn)圖2。

圖2 PRRSV ORF5 基因的擴(kuò)增

2.3 ORF5 基因進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

運(yùn)用軟件MEGA6.0 對(duì)獲得的PRRSV ORF5 基因序列和從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的23 個(gè)國(guó)內(nèi)外參考毒株的ORF5 基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖3 可知，駐馬店地區(qū)流行的毒株為美洲型，屬于NADC30-like 毒株。美洲型毒株進(jìn)一步分為4 個(gè)亞群，分別是以VR-2332為代表的lineage5/sublineage 5.1，以NADC30 為代表的lineage1/sublineage1.9，以CH-1a 為代表的subgroup I 和以JXA1 為代表的subgroup III。

圖3 PRRSV ORF5 進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

2.4 ORF5 基因序列必對(duì)

利用DNAStar 中的Megalign 軟件對(duì)擴(kuò)增的ORF5毒株與5 株國(guó)內(nèi)外代表毒株進(jìn)行基因序列同源性分析。由圖4 可知，ZMD 與歐洲型LV 的核苷酸同源性為61.4%；和美洲型VR-2332 毒株的同源性為85.1%；與經(jīng)典疫苗株CH-1a 核苷酸同源性為87.1%；和致病性很高的毒株JXA1 核苷酸同源性為85.6%；與NADC30毒株核苷酸同源性最高，為95.9%。

圖4 PRRSV GP5 基因序列比對(duì)分析

3 結(jié)論和討論

通過(guò)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果分析可知，引起豬場(chǎng)發(fā)病的是PRRSV NADC30-like 毒株，該毒株于2015年在中國(guó)暴發(fā)，隨后中國(guó)許多地區(qū)均發(fā)現(xiàn)PRRSV 陽(yáng)性[11]。河南地區(qū)也是發(fā)現(xiàn)PRRSV NADC30-like 毒株陽(yáng)性較早的地區(qū)，該病的發(fā)生給本地區(qū)PRRSV 疫病的防控帶來(lái)了嚴(yán)重打擊。

GP5 蛋白是PRRSV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它在病毒的吸附和入侵過(guò)程中發(fā)揮重要作用。GP5 蛋白同時(shí)是變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白，為此常作為PRRSV 遺傳進(jìn)化分析的靶基因[10]。ZMD 毒株與歐洲型LV 的核苷酸同源性為61.4%；和美洲型VR-2332 毒株的同源性為85.1%，表明ZMD 毒株為美洲型毒株；與經(jīng)典疫苗株CH-1a 核苷酸同源性為87.1%；和致病性很高的毒株JXA1 核苷酸同源性為85.6%；與NADC30 毒株核苷酸同源性最高，為95.9%，進(jìn)化樹(shù)分析顯示ZMD 與NADC30 和NADC30-like 毒株位于同一分支，這些結(jié)果表明ZMD毒株為NADC30 樣毒株。該結(jié)果確證該豬場(chǎng)的疫病是由NADC30 樣毒株感染引起。