段麗 陳藝 楊帆

[摘要] 目的 探討抗繆勒管激素（AMH）水平對非梗阻性無精子癥（NOA）的臨床預(yù)測價(jià)值。 方法 釆用酶聯(lián)免疫法和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測NOA患者精漿AMH、血清促卵泡激素（FSH）以及睪酮（T）的濃度;B超檢測其睪丸體積;通過睪丸顯微取精術(shù)（M-TESE）檢獲精子;同時(shí)設(shè)置對照組，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 NOA組的AMH濃度分別低于OA組[（19.53±9.13）pmol/L，（52.34±15.13）pmol/L，P<0.05]及NF組[（158.53±37.45）pmol/L，P<0.05];NOA組的FSH濃度分別高于OA組[（18.36±8.95）U/L，（5.51±3.32）U/L，P<0.05]及NF組[（6.12±3.02）U/L，P<0.05];NOA患者的睪酮濃度[（15.32±5.43）nmol/L]分別與OA組[（15.63±6.23）nmol/L]、NF組[（15.81±5.73）nmol/L]比較無顯著性差異（P>0.05，P>0.05）;NOA組左右睪丸體積TV[（9.58±3.83）mL，（7.46±3.57）mL]分別與OA組[（16.97±2.56）mL，（15.32±3.63）mL]、NF組[（16.23±3.53）mL，（16.84±2.83）mL]存在顯著性差異（P<0.05，P<0.05）。NOA組有10人檢獲精子，OA組19人檢獲精子（P<0.05）。Logistic回歸分析檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AMH預(yù)測NOA 患者睪丸內(nèi)是否存在精子的擬合優(yōu)度最佳（Wald χ2=26.198，P<0.01）;ROC曲線圖顯示精漿AMH的AUC值最大;精漿AMH的陽性似然比為7.36[81.82%/（1-88.89%）]，陰性似然比為0.20[（1-81.82%）/88.89%]。 結(jié)論 精漿AMH 濃度對于預(yù)測NOA 患者M(jìn)-TESE成功與否具有重要的意義。

[關(guān)鍵詞] 非梗阻性無精癥;抗繆勒管激素;睪丸顯微取精術(shù);精子檢獲

[中圖分類號] R446.6 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）31-0001-04

Clinical predictive value of seminal plasma AMH level for non-obstructive azoospermia

DUAN Li1， 2 ? CHEN Yi2 ? YANG Fan2 ? DU Dan2 ? WANG Kegeng1 ? LU Siyu3 ? SHEN Wentao4 ? LIU Yan1

1.Institute of Pathogenic Biology， Hengyang Medical College， Nanhua University， Hengyang ? 421001， China; 2.Chenzhou First People's Hospital， Chenzhou ? 423000， China; 3.School of Nursing， Nanhua University， Hengyang ? 421001， China; 4.Huilongshan Town Health Center of Tuanfeng County in Huibei Province， Tuanfeng ? 438800， China

[Abstract] Objective To evaluate the clinical predictive value of anti-Mullerian hormone（AMH） level for non-obstructive azoospermia（NOA）. Methods Enzyme-linked immunosorbent assay and electrochemiluminescence immunoassay were used to detect the concentration of seminal plasma AMH， serum follicle stimulating hormone （FSH） and testosterone （T） in NOA patients. B-ultrasound was used to test testicular volume. And Sperm was acquired by M-TESE. The control group was set up at the same time and statistical analysis was performed. Results The AMH concentration （19.53±9.13） pmol/L in the NOA group was lower than that in the OA group （52.34±15.13） pmol/L and that in the NF group （158.53±37.45） pmol/L， P<0.05. The FSH concentration （18.36±8.95） U/L in the NOA group was higher than that in the OA group （5.51±3.32） U/L and that in the NF group （6.12±3.02） U/L， P<0.05. The testosterone concentration in NOA patients （15.32±5.43） nmol/L was not significantly different from that of OA group （15.63±6.23）nmol/L and NF group （15.81±5.73）nmol/L， P>0.05. The left and right testicular volume TV in the NOA group was（9.58±3.83）mL and（7.46±3.57）mL， which was significantly different from that in the OA group （16.97±2.56）mL and （15.32±3.63） mL， and that in the NF group（16.23±3.53）mL and（16.84±2.83）mL， P<0.05. Sperm was detected in 10 patients in the NOA group and 19 in the OA group （P<0.05）. Logistic regression analysis showed that AMH predicted the best fit of sperm in the testis of NOA patients （Wald χ2=26.198， P<0.01）.ROC curve showed the AUC value of seminal plasma AMH was the highest. The positive likelihood ratio of the seminal plasma AMH was 7.36（81.82%/（1-88.89%）），and the negative likelihood ratio was 0.20 （1-81.82%）/88.89%）. Conclusion The concentration of seminal plasma AMH is important for predicting whether the success of M-TESE in patients with NOA or not.

[Key words] Non-obstructive azoospermia; Anti-Mullerian hormone; Microdissection testicular sperm extraction; Sperm acquisition

無精子癥（Azoospermia）是男性不育的主要原因，是指連續(xù)3次精液及射精后的尿液在3000 g以上的離心標(biāo)本離心15 min后，沉渣鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子[1]。無精子癥分非梗阻性無精子癥（non-obstructive azoospermia，NOA）和梗阻性無精子癥（obstructive azoospermia，OA）兩大類，可通過激素水平和睪丸大小進(jìn)行鑒別[2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，部分NOA患者可通過睪丸顯微取精術(shù)（Micro-testicular sperm extraction，M-TESE）獲取精子進(jìn)行試管嬰兒生育[3]，但M-TESE創(chuàng)傷大、并發(fā)癥多，因此研究無創(chuàng)預(yù)測睪丸穿刺取精獲得精子的指標(biāo)具有重要意義。本研究選擇某院20例NOA患者的臨床資料，分析生殖激素水平與睪丸大小等參數(shù)對M-TESE結(jié)果的預(yù)測價(jià)值，以期為NOA患者是否需要接受外科手術(shù)治療提供臨床依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

依據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)，選取2015年1月～2018年12月期間在某院生殖中心不育門診就診的不育患者。在獲得NOA患者知情同意后，收集其精漿和血清作為研究樣本，同時(shí)設(shè)置梗阻性無精癥OA患者和正常生育（normal fertility，NF）者為對照組。每組選取20例。NOA組20例，為各種睪丸生精功能不足而核型正常的NOA患者，包括原因不明的NOA患者15例，睪丸接受放化療者1例，隱睪癥者1例，精索靜脈曲張者3例，平均年齡（33.82±5.69）歲。OA組共20例，包括輸精管切除術(shù)者5例、輸精管梗阻者10例和射精管梗阻者5例，平均年齡（33.82±5.69）歲。三組受試對象的年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 儀器與試劑

ELx-800型酶標(biāo)儀（美國寶特，BIO-TEK），ELx-50型洗板機(jī)（BIO-TEK）均由上海新波生物技術(shù)有限公司提供;全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（Roche HITACHI cobas 6000）由德國羅氏診斷產(chǎn)品（Roche Diagnostics GmbH）上海有限公司提供;體視鏡（SMZ800）為日本Nikon公司產(chǎn)品，倒置顯微鏡（CKX53）為日本Olympus公司產(chǎn)品。B超（Logiq E9）為美國GE（General Electric Company）產(chǎn)品?？箍娎展芗に兀╝nti-mullerian hormone，AMH）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）檢測試劑盒和睪酮（testosterone，T）檢測試劑盒等均購于羅氏上海有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 血清促卵泡激素及睪酮的檢測 ?待檢者空腹，常規(guī)于前臂淺靜脈處抽取5 mL血樣，分離血清后，2 h內(nèi)檢測其血清促卵泡激素及睪酮的濃度。FSH濃度檢測：選擇羅氏Roche HITACHI型電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)及配套FSH濃度檢測試劑盒，F(xiàn)SH的最低檢測限為0.10 IU/L。根據(jù)試劑盒說明，將離心處理后的血液樣本置于標(biāo)本槽內(nèi)，采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（Electrochemiluminescent immunoassay，ECLIA）雙份測定FSH水平。睪酮T濃度檢測：選擇配套睪酮T濃度檢測試劑盒，T的最低檢測限為0.14 nmol/L。根據(jù)試劑盒說明，將離心處理后的血液樣本置于標(biāo)本槽內(nèi)，ECLIA雙份測定T水平。

1.3.2 精漿中所含抗繆勒管激素濃度的檢測 ?待檢者均在釆集精液前一周停止性生活，手淫采集精液[4]，置于無菌容器中37℃水浴30 min液化;1 h內(nèi)取3～5 mL液化精液樣本，離心5 min后置于-80 ℃貯藏備用，保存期限1個(gè)月。AMH濃度檢測：選擇Roche公司提供的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）雙份重復(fù)測定，AMH的最低檢測限為3.2 pmol/L。根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行。將試劑盒置室溫平衡30 min后使用，凍存樣本復(fù)融后應(yīng)經(jīng)過充分的混勻。樣品孔先加入樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋5倍）。設(shè)置對照組，輕輕振蕩混勻后封板膜封板，37℃溫育30 min;每孔加酶標(biāo)試劑50 μL，輕輕振蕩混勻后封板膜封板，37℃溫育30 min后，洗板5遍，扣干;每孔加入顯色劑A、B液各50 μL，輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min;每孔加終止液50 μL，輕振蕩混勻;設(shè)定酶標(biāo)儀波長于450 nm處，空白孔調(diào)零后，15 min內(nèi)測定各孔OD值。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度和OD值分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品的實(shí)際濃度。

1.3.3 B超檢測睪丸體積 ?運(yùn)用B超儀高頻探頭9～15 Mz進(jìn)行測量，具體數(shù)據(jù)以公式為準(zhǔn)，睪丸的體積=睪丸的前后直徑×左右直徑×上下直徑×0.71。

1.3.4 睪丸顯微取精術(shù) ?取較大側(cè)睪丸，常規(guī)消毒皮膚并麻醉后，通過顯微鏡放大足夠倍數(shù)（通常20倍左右）后，切開至睪丸白膜，避開白膜下血管，睪丸中部切開白膜0.5～1.0 cm，用外科剪刀切開并分離，獲取含有飽滿不透明的曲細(xì)精管睪丸組織25～50 mg，將睪丸組織送檢。剪取外觀飽滿、乳白色半透明或不透明、相對粗大并有張力的生精小管，體視鏡下取出后置于Falcon 3001培養(yǎng)皿Gemete培養(yǎng)液（Irvine scientific，santa anna，CA，美國）中立即用注射針頭撕裂研磨，倒置顯微鏡下查找精子。

1.4 參數(shù)計(jì)算方法

靈敏度=真陽性人數(shù)/（真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù)）×100%，特異度=真陰性人數(shù)/（真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù)）×100%，陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%，陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，陽性似然比=靈敏度/（1-特異度）;陰性似然比=（1-靈敏度）/特異度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分別進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析后采用Student-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過Logistic回歸分析，篩選出與患者行睪丸穿刺活檢發(fā)現(xiàn)精子相關(guān)程度較高的指標(biāo)。應(yīng)用Microsoft Excel 2013繪制受試者工作特征曲線（receiver operating curve，ROC）圖[5]，根據(jù)ROC曲線下的面積（area under the curve，AUC）來判斷監(jiān)測方法的優(yōu)劣[6]。

2 結(jié)果

2.1 三組生殖激素水平、睪丸體積及有精子人數(shù)比較

NOA組的FSH濃度[（18.36±8.95）U/L]分別高于OA組[（5.51±3.32）U/L]及NF組[（6.12±3.02）U/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NOA組的睪酮濃度[（15.32±5.43）nmol/L]分別與OA組[（15.63±6.23）nmol/L]、NF組[（15.81±5.73）nmol/L]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。NOA組的AMH檢測值[（19.53±9.13）pmol/L]分別低于OA組[（52.34±15.13）pmol/L]及NF組[（158.53±37.45）pmol/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B超檢測睪丸體積（TV），NOA組左右兩側(cè)TV[（9.58±3.83）mL，（7.46±3.57）mL]分別小于OA組[（16.97±2.56）mL和（15.32±3.63）mL]及NF組[（16.23±3.53）mL和（16.84±2.83）mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NOA組患者檢獲精子人數(shù)（10/20）低于OA組（19/20），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.1 各指標(biāo)擬合度分析 ?采用Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)：AMH對預(yù)測NOA患者睪丸內(nèi)是否存在精子的擬合優(yōu)度最佳（Wald χ2=26.198，P<0.05），優(yōu)勢比（Odds Ratio，OR）最高，為8.384;其次為FSH（Wald χ2=21.492，P<0.05），再者為睪丸體積（Wald χ2=20.934，P<0.05），T參數(shù)在回歸分析模型中擬合度不佳，OR值最低。見表2。

2.2.2 各指標(biāo)的ROC曲線 ?以睪丸穿刺結(jié)果為狀態(tài)變量，分別以生殖激素水平和睪丸體積及相關(guān)參數(shù)為檢驗(yàn)變量，利用Microsoft Excel 2013繪制ROC曲線圖（圖1），由圖1可見，精漿AMH的AUC值最大（0.87）。

2.3 各項(xiàng)指標(biāo)預(yù)測睪丸組織活檢有無精子的價(jià)值

以睪丸穿刺結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，20例NOA患者中有11例可在精漿中檢出AMH，其中9例在睪丸組織活檢中發(fā)現(xiàn)精子，閾值（Cut-off值）≥10.58 pmol/L;精漿檢測不出AMH的患者有9例，其中8例組織活檢無精子。精漿AMH的靈敏度是81.82%[9/（9+2）]，特異度是88.89%[8/（8+1）];陽性預(yù)測值為90.00%[9/（9+1）]，陰性預(yù)測值為80.00%[8/（8+2）];陽性似然比為7.36[81.82%/（1-88.89%）]，陰性似然比為0.20]（1-81.82%）/88.89%]。見表3。

3 討論

隨著人類輔助生殖技術(shù)的產(chǎn)生和不斷進(jìn)步發(fā)展，臨床上出現(xiàn)了單精子卵胞漿顯微注射術(shù)（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI），使用顯微操作技術(shù)將精子注射到卵細(xì)胞胞漿內(nèi)，受精后體外培養(yǎng)到早期胚胎，再放回母體子宮內(nèi)發(fā)育著床;因此即便是NOA患者，也可通過利用ICSI進(jìn)行生育[7]。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，有45%左右的NOA患者，經(jīng)過多次重復(fù)的睪丸顯微取精術(shù)（M-TESE），會促使睪丸產(chǎn)生精子量提升，從而保證ICSI的順利進(jìn)行[8]。但M-TESE創(chuàng)傷大、并發(fā)癥多，同時(shí)要配合女性的取卵術(shù)。多次重復(fù)的外科手術(shù)診斷和治療，給患者夫妻的經(jīng)濟(jì)和心理都帶來巨大的影響[9，10]。因此，研究無創(chuàng)預(yù)測M-TESE獲得精子的指標(biāo)具有重要意義。

血清FSH的濃度在長時(shí)間內(nèi)一直被認(rèn)為是有效的無精子癥標(biāo)志物，如果FSH水平上升，表明精子生成障礙[11，12];然而隨著M-TESE使用率越來越廣泛，部分無精子癥患者也可通過活檢獲得精子，因此血清FSH不再被認(rèn)為是一個(gè)明確的無精子癥的標(biāo)志物[13]。

精漿AMH來源于睪丸，當(dāng)人進(jìn)入青春期以后，AMH會從睪丸支持細(xì)胞的最頂端逐步向周圍曲細(xì)精管腔內(nèi)分泌，這種現(xiàn)象可能與青春期睪丸開始發(fā)揮作用有關(guān)：在生精上皮特定的周期階段，精漿內(nèi)AMH的分泌增強(qiáng)，和精子的生成有一定的關(guān)系;即便在輸精管切除術(shù)后，仍然可以在精漿中檢測到AMH[14]。因此，患者精漿AMH可以理解為患者生殖系統(tǒng)細(xì)胞缺乏癥的標(biāo)志物，用于判斷患者是否完全缺乏精子，AMH檢測是針對NOA患者的一種無創(chuàng)性的檢測。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)NOA患者精漿AMH濃度、血清FSH濃度及睪丸大小較OA患者及正常人均有顯著性差異，說明這三者與患者生精功能障礙有直接的關(guān)系，與精子的成功生成有一定的關(guān)聯(lián)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)AMH對預(yù)測NOA患者睪丸內(nèi)是否存在精子的擬合優(yōu)度最佳，ROC曲線圖顯示精漿AMH的AUC值最大，由此可見，較之血清FSH濃度及睪丸體積，精漿AMH濃度與睪丸顯微取精術(shù)的成功率有更大的關(guān)聯(lián)性。

陽性似然比、陰性似然比結(jié)合了敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值的優(yōu)點(diǎn)，既可以根據(jù)患者有無某項(xiàng)報(bào)警癥狀來做預(yù)測，同時(shí)又不受被檢人群中病變發(fā)生率的影響，可用于多種臨床環(huán)境中，因此是一個(gè)相對獨(dú)立的、更具臨床意義的診斷性試驗(yàn)效果的評估指標(biāo)[15]。當(dāng)陽性似然比>10或陰性似然比<0.1時(shí)，診斷或排除某種疾病的可能性就顯著增加。在本項(xiàng)研究中，AMH濃度的似然比更加接近理想值。

由此可見，與血清FSH、T濃度和TV等經(jīng)典的精子生成預(yù)測指標(biāo)相比，NOA患者的精漿AMH濃度，預(yù)測M-TESE成功與否的診斷效率更高。精漿AMH濃度作為一種非侵入性持久的精子發(fā)生過少的標(biāo)志物，可在ICSI術(shù)前預(yù)示睪丸精子數(shù)量恢復(fù)成功的可能性，在臨床實(shí)踐中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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（收稿日期：2019-07-12）