藍(lán)雅華 趙新華 何恩潔 欒 芳 陳勃生 于 婷梁喜麗 謝 森 邵勇奇 魯興萌

(1浙江大學(xué)蠶蜂研究所，浙江杭州 310058； 2浙江省桐鄉(xiāng)市蠶業(yè)有限公司，浙江桐鄉(xiāng) 314500；3浙江省蠶種質(zhì)量檢驗檢疫站，浙江杭州 310000)

養(yǎng)蠶業(yè)是我國的傳統(tǒng)經(jīng)典產(chǎn)業(yè)，也是少數(shù)在世界上具有產(chǎn)業(yè)規(guī)模優(yōu)勢的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一。家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclear polyhedrosis virus，BmNPV)引起的家蠶核型多角體病毒病(俗稱血液型膿病或水白肚)是家蠶的主要病害，目前主要通過防止病毒或多角體的污染和清潔消毒等技術(shù)進(jìn)行防控。品種是農(nóng)業(yè)技術(shù)的重要基礎(chǔ)，選育和推廣使用具有良好抗性及經(jīng)濟(jì)性狀的蠶品種，是解決養(yǎng)蠶中家蠶核型多角體病毒病流行最為高效的途徑，也是近期各育種單位十分關(guān)注的領(lǐng)域。

抗病性主要由品種的遺傳基礎(chǔ)決定。有研究表明，家蠶對BmNPV病的抵抗性受多因子影響，經(jīng)口感染的抵抗性遺傳規(guī)律是受1對主效顯性基因和若干微效基因控制，有偏父遺傳性，雜交一代的抗病性表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢，并存在超顯性現(xiàn)象等抗性遺傳規(guī)律[1-4]。家蠶對BmNPV病的抗性除受遺傳基礎(chǔ)的影響外，還受蠶體發(fā)育階段[5]、飼育溫濕度[6]、桑葉營養(yǎng)狀況[7]、BmNPV來源[8]等因素的影響。其抗性的表現(xiàn)可采用死亡率[9]、發(fā)病率[10-11]、半數(shù)致死濃度(LC50)[12]、半數(shù)發(fā)病濃度(IC50)[10-11，13]、半數(shù)致死劑量(LD50)[14]等指標(biāo)進(jìn)行評價，其中死亡率與LC50[15-18]的應(yīng)用較其他評判指標(biāo)更為廣泛。

在抗性育種過程中，采用LC50的方法[19-20]評價家蠶抗性是常用的方法，但在新品種的推廣中如何評價不同品種的抗性，以及根據(jù)蠶區(qū)飼養(yǎng)條件選擇合適的抗性蠶品種，采用LC50或與參照品種的差異，可能受飼養(yǎng)條件、桑葉質(zhì)量和病毒活力等因素的影響而產(chǎn)生偏差，從而導(dǎo)致評價困難。為此，我們通過測定多批次蠶品種對BmNPV多角體的LC50，構(gòu)建了一種基于抗性指數(shù)的蠶品種對BmNPV病抗性評價方法，該方法具有較好的可比性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試BmNPV 由浙江大學(xué)蠶蜂研究所家蠶病理學(xué)與病害控制實驗室(以下簡稱浙大實驗室)、蘇州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)與生態(tài)研究院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所(以下簡稱蘇大實驗室)和浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所保存和繁殖。蘇大實驗室提供數(shù)據(jù)的試驗由蘇大實驗室實施，其它試驗都在浙大實驗室完成。

1.1.2 供試蠶品種 由相應(yīng)的蠶品種選育單位提供，作為參照蠶品種的菁松×皓月、皓月×菁松、秋豐×白玉和白玉×秋豐由浙江省蠶種質(zhì)量檢驗檢疫站提供。供試蠶品種或雜交組合的名稱，因考慮知識產(chǎn)權(quán)等原因而采用字母與數(shù)字表示，字母代表雜交組合，數(shù)字的單數(shù)代表正交，雙數(shù)代表反交(表1)。采用常規(guī)方法催青、收蟻、飼養(yǎng)至1齡眠，隨機(jī)挑選2齡起蠶，供試驗用。

表1 不同實驗室不同期別BmNPV抗性測定的供試蠶品種

浙大實驗室為浙江大學(xué)蠶蜂研究所家蠶病理學(xué)與病害控制實驗室的簡稱，蘇大實驗室為蘇州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)與生態(tài)研究院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所的簡稱；“/”代表數(shù)據(jù)缺失；不同的英文字母代表不同的蠶品種，其后的數(shù)字單數(shù)表示正交，雙數(shù)表示反交；2018年夏①表示2018年夏第1次試驗，2018年夏②表示2018年夏第2次試驗；菁松×皓月后面的小寫英文字母(a、b)表示該品種蠶種的不同生產(chǎn)單位。表2-4相同。

1.2 試驗方法

本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)參考文獻(xiàn)[21]的方法(Reed-Muench法)進(jìn)行LC50的測定。以2齡起蠶作為攻毒對象，設(shè)置4個10倍稀釋濃度病毒多角體懸浮液，每個濃度設(shè)3個重復(fù)區(qū)，每個重復(fù)區(qū)30頭蠶，同時設(shè)置無菌生理鹽水添食作空白對照區(qū)。分別于2017年夏季、2017年秋季和2018年夏季進(jìn)行了4次LC50的測定，其中2018年夏季進(jìn)行了2次LC50的測定，分別用“2018年夏①”和“2018年夏②”表示(表1)。試驗用攻毒BmNPV母液多角體濃度分別為1.30×109個/mL、1.00×109個/mL、1.05×109個/mL和1.74×108個/mL。

此外，蘇大實驗室提供了1批家蠶核型多角體病毒病LC50測定數(shù)據(jù)，其試驗用攻毒BmNPV母液多角體濃度為1.00×109個/mL，其中參照品種菁松×皓月正反交為來自2個不同蠶種生產(chǎn)單位，分別用a和b表示(表1)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總統(tǒng)計，用SPSS 20.0軟件計算LC50[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 參照蠶品種BmNPV多角體的LC50

菁松×皓月和秋豐×白玉是江浙蠶區(qū)農(nóng)村飼養(yǎng)量較大的家蠶品種，也是家蠶新品種飼養(yǎng)和抗性比較試驗中常用的參照蠶品種。浙大實驗室和蘇大實驗室，分別在不同時期，用相同或類似的試驗方法，測定了上述2對參照蠶品種正反交對BmNPV多角體的LC50(表2)。

表2 參照蠶品種BmNPV多角體的半數(shù)致死濃度(LC50) 個/mL

從表2可以看出，同一參照蠶品種在不同試驗期別，或在不同實驗室測定的BmNPV多角體的LC50存在一定差異，菁松×皓月、皓月×菁松、秋豐×白玉和白玉×秋豐的BmNPV多角體的LC50值最大差數(shù)分別為66.60、1.75、9.71和10.48倍。不同蠶種生產(chǎn)單位生產(chǎn)的相同蠶品種，同一實驗室的同期試驗蠶品種的LC50也有一定的差異，菁松×皓月和皓月×菁松的LC50值差數(shù)分別為1.14和1.51倍(蘇大實驗室)。

2.2 待測蠶品種BmNPV多角體的LC50

浙大實驗室和蘇大實驗室，分別對50個(次)蠶品種(包括供試，相同或不同蠶品種，或不同雜交組合及正反交)進(jìn)行了LC50的測定。從表3可以看出，不同待測蠶品種的LC50存在明顯差異，最高的蠶品種的LC50值為1015.16(浙大實驗室，2017年夏的L蠶品種)，最低的蠶品種的LC50值僅為105.79(浙大實驗室，2017年夏的D1蠶品種)。待測蠶品種LC50值差異幅度最大出現(xiàn)在待測蠶品種最多的一次試驗(浙大實驗室，2017年夏)，為0～2.3×109倍之間。從表3還可以看出，同一待測蠶品種在相同實驗室不同試驗時期，以及相同實驗室同一次試驗中的LC50都會出現(xiàn)不同，但不同試驗時期的差異較大，如浙大實驗室2017年秋和2018年夏①的P2蠶品種的LC50值相差10.75倍；同一次試驗的差異相對較小，如蘇大實驗室2017年夏的cC1相差0.17倍、cC2相差0.20倍、dD1相差0.26倍、dD2相差0.10倍。

表3 待測蠶品種BmNPV多角體的LC50

浙大實驗室于2018年夏①測定的蠶品種P1因試驗攻毒BmNPV懸浮液的多角體濃度不足以產(chǎn)生2個死亡率數(shù)據(jù)，無法得出LC50值。

2.3 不同蠶品種對BmNPV病的抗性評價

不同待測蠶品種Reed-Muench法測定的LC50不同，體現(xiàn)了不同蠶品種對BmNPV病的抗性差異，但LC50值為多少是屬于抗性蠶品種或敏感蠶品種？不同LC50值適用于哪些蠶區(qū)？育種單位雖然可以通過LC50值比較抗性的改變，但不同實驗期別LC50值的偏差造成的困惑如何解決？等等問題，都會在育種選拔效果評價或新品種推廣選擇中遭遇。上述不同實驗室、不同試驗時期和不同蠶品種對BmNPV多角體的LC50測定數(shù)據(jù)中，盡管試驗方法較為一致，但還是出現(xiàn)同一蠶品種LC50的較大差異，證實了該類問題的存在。

為此，利用表3中相同蠶品種不同期別或同期試驗結(jié)果，分別以1對或2對參照蠶品種的正反交LC50值為分母得出一個相對值(待測蠶品種LC50值/參照蠶品種正反交LC50值的平均數(shù))作為BmNPV病抗性指數(shù)(表4)。待測蠶品種P2，在同一實驗室的2次LC50測定數(shù)據(jù)分別為1010.55和109.48(差11倍)；在僅以菁松×皓月正反交為參照的情況下，BmNPV病抗性指數(shù)為22.80；在僅以秋豐×白玉正反交為參照的情況下，BmNPV病抗性指數(shù)為2.56。參照蠶品種的不同，同樣出現(xiàn)對具體待測蠶品種抗性評價的較大差異，采用2對參照蠶品種正反交的4個LC50值平均數(shù)為分母，其BmNPV病抗性指數(shù)則為11.31，即增加參照蠶品種數(shù)量可以提高校正作用。cC1、cC2、dD1和dD2蠶品種為同一實驗室的同期測定數(shù)據(jù)，本身其差異較小，按照上述BmNPV病抗性指數(shù)的方法比較其差異則更小。

表4 不同試驗時期或同期不同試驗組的BmNPV病抗性指數(shù)

因此，可以認(rèn)為在以菁松×皓月和秋豐×白玉為主推蠶品種的江浙等蠶區(qū)，以其為參照蠶品種，同步測定待測蠶品種的LC50，并以BmNPV病抗性指數(shù)為蠶品種對BmNPV病抗性評價參數(shù)，較之單一的LC50具有更好的可比性。

3 討論

隨著家蠶核型多角體病毒病抗性特征在家蠶育種和新品種推廣中的重要性日趨明顯，家蠶品種對家蠶核型多角體病毒病抗性的評價逐漸被關(guān)注。LC50作為抗性測定的一種經(jīng)典方法而被廣泛應(yīng)用，但由于蠶品種自身(群體遺傳特征和繁育制種)、病毒以及桑葉等的不確定因素的存在[23-25]，盡管對試驗條件作出較為嚴(yán)格的規(guī)范要求[21]，但依然不可避免LC50值在同一實驗室的不同測定時期或不同實驗室間出現(xiàn)較大的偏差或波動(表2和表3)，由此給抗性評價工作造成一定的困難。因此，采用BmNPV病抗性指數(shù)法(待測蠶品種LC50值/參照蠶品種正反交LC50值的平均數(shù))[21]可有效減少上述困難，并為生產(chǎn)推廣提供更為直觀的評價結(jié)果。

在方法學(xué)方面，增加參照品種的數(shù)量將有利于待測品種抗性評價的穩(wěn)定性，但過多的參照品種不僅增加LC50測定的工作量，也可能因參照品種來源的復(fù)雜性而產(chǎn)生其他方面的不確定因素。因此，參照品種和數(shù)量的確定，應(yīng)該根據(jù)育種目標(biāo)和推廣區(qū)域的情況來確定。此外，近年來出現(xiàn)了部分對家蠶核型多角體病毒病具有很強(qiáng)抗性的蠶品種，在LC50測定中難以測到半數(shù)致死試驗區(qū)的實際數(shù)據(jù)，一般采用相對較低多角體濃度攻毒試驗區(qū)的死亡數(shù)據(jù)進(jìn)行推測而來。因此，必須設(shè)置盡可能高的BmNPV多角體濃度和新鮮度，避免出現(xiàn)單一攻毒多角體濃度的死亡數(shù)據(jù)而無法進(jìn)行LC50推測的情況。

家蠶品種對家蠶核型多角體病毒病抗性雖然受主效顯性基因和若干微效基因控制[1-4]，但是家蠶品種群體內(nèi)的抗性差異還是比較大的，或者說若干微效基因的作用也是不可小覷的因素。在LC50測定中，死亡與存活家蠶個體同時存在于一個攻毒多角體濃度梯度的試驗區(qū)，且在3個攻毒多角體濃度梯度試驗區(qū)出現(xiàn)的情況是常見的現(xiàn)象。分析該現(xiàn)象，可以認(rèn)為測定家蠶品種對BmNPV多角體LC50的試驗方法無法確定是否是由單一家蠶個體食下病毒量的不同或食桑等環(huán)境因子引起，但在1 000倍多角體濃度梯度設(shè)計情況下的差異，與遺傳基礎(chǔ)具有相關(guān)性的可能性是較高的。因此，家蠶抵抗病原微生物的抗性品種育成中，如何提高品種群體的抗性水平也是一個值得關(guān)注的問題。