唐 蕓 徐安英 艾均文 何行健 鄭 穎 葉征明劉 洋 汪維熙 朱 賢 彭大平 宋擁軍

(1湖南省蠶桑科學(xué)研究所，湖南長沙 410127； 2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopoly-hedrovirus，BmNPV)屬桿狀病毒科核型多角體病毒屬，感染家蠶后所引發(fā)的血液型膿病是蠶業(yè)生產(chǎn)中發(fā)生頻率最高、危害最嚴(yán)重的病害，所導(dǎo)致的蠶繭損失占所有蠶病引起損失總量的70%以上[1]，1～5齡蠶均可被感染，屬亞急性傳染病。感染BmNPV的家蠶會(huì)逐漸表現(xiàn)出體軀腫脹，體色乳白，狂躁爬行，體壁易破，血液呈渾濁的乳白色等典型癥狀。洞·庭×碧·波是湖南省蠶桑科學(xué)研究所“八五”期間育成的夏秋用斑紋全限性品種[2]，具有體質(zhì)強(qiáng)健、抗逆性強(qiáng)、絲質(zhì)優(yōu)良的特點(diǎn)，20世紀(jì)90年代與21世紀(jì)初在我國長江流域夏秋季大面積推廣，曾位列單一品種年推廣量的第3位[3]。然而，該品種對BmNPV的抵抗力相對較弱，較易發(fā)生血液型膿病[4]，難以適應(yīng)當(dāng)前蠶桑產(chǎn)業(yè)規(guī)模化發(fā)展的需要。為此，湖南省蠶?？茖W(xué)研究所與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所從2011年起合作開展了洞·庭×碧·波抗血液型膿病能力的改造，并育成了1對具有很強(qiáng)抗血液型膿病的家蠶新品種華·康×湘·泰。為了更加系統(tǒng)地了解新品種各個(gè)種級的改造效果，本試驗(yàn)分別以洞·庭×碧·波的原原種、原種與一代雜交種為對照，于2018年秋季開展梯級濃度的BmNPV多角體經(jīng)口攻毒試驗(yàn)，分析比較了各個(gè)品種各個(gè)種級的半致死濃度(LC50)，以期為新蠶品種的蠶種繁育、農(nóng)村推廣及其它研究提供相關(guān)信息與借鑒資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試家蠶品種 抗病蠶品種：華(洞N)、康(庭N)、湘(碧N(yùn))、泰(波N)、華·康、康·華、湘·泰、泰·湘、華·康×湘·泰、湘·泰×華·康；對照蠶品種：洞、庭、碧、波、洞·庭、庭·洞、碧·波、波·碧、洞·庭×碧·波、碧·波×洞·庭。

以上2對參試品種的原原種、雜交原種與一代雜交種(含正反交)均由湖南省蠶?？茖W(xué)研究所蠶品種研究室提供，各個(gè)種級的家蠶均由12個(gè)卵圈混合收蟻普通桑葉飼養(yǎng)至2齡起蠶。

1.1.2 供試BmNPV病原 由湖南省蠶?？茖W(xué)研究所蠶品種研究室2018年春季復(fù)壯純化，BmNPV多角體懸浮液原液的濃度為3.20×109個(gè)/mL。

1.2 試驗(yàn)方法

2018年秋季，將各供試蠶品種各種級的家蠶在同一環(huán)境下飼養(yǎng)到2齡起蠶，數(shù)蠶分區(qū)，每個(gè)品種6區(qū)，每區(qū)30頭，重復(fù)3次。為減少小蠶起蠶損傷，1齡眠時(shí)數(shù)蠶，2齡起時(shí)再對眠起遲、個(gè)體小的個(gè)別家蠶進(jìn)行替換，以確保所抽取的家蠶發(fā)育齊一。將BmNPV多角體以10倍為梯度，分別用滅菌水稀釋成1×109、1×108、1×107、1×106、1×105個(gè)/mL，以不含BmNPV多角體的滅菌水作為空白對照。各濃度分別取10 μL的BmNPV多角體懸浮液(空白對照以同等體積的滅菌水代替病毒懸浮液)，均勻涂抹于直徑為10 mm的圓形桑葉上，每個(gè)試驗(yàn)區(qū)喂對應(yīng)濃度BmNPV多角體懸浮液涂抹的桑葉5片，待家蠶將帶毒桑葉吃干凈后，改用普通桑葉繼續(xù)飼喂。當(dāng)家蠶發(fā)育至2齡眠時(shí)開始逐日調(diào)查發(fā)病蠶數(shù)，并將感染發(fā)病蠶及時(shí)清除，3齡眠起后還持續(xù)調(diào)查60 h。整理所統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，借助IBM SPSS Statistics 21軟件，計(jì)算各品種對BmNPV多角體的LC50、lg(LC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同家蠶品種添食不同濃度BmNPV多角體懸浮液后的發(fā)病情況

在2齡眠之前觀察，就已發(fā)現(xiàn)部分試驗(yàn)區(qū)的家蠶表現(xiàn)出了病態(tài)，當(dāng)空白對照區(qū)的家蠶進(jìn)入2齡眠時(shí)，添毒處理區(qū)發(fā)病的家蠶卻不食不眠，體壁發(fā)亮；當(dāng)空白對照區(qū)的家蠶3齡眠起時(shí)，添毒處理區(qū)發(fā)病的家蠶大多體色乳白，或已經(jīng)流膿而死。當(dāng)空白對照區(qū)正常發(fā)育的家蠶3齡眠起60 h時(shí)，開展各試驗(yàn)區(qū)發(fā)病蠶數(shù)的最終調(diào)查統(tǒng)計(jì)。從調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，添食1×105個(gè)/mL等低濃度BmNPV多角體的試驗(yàn)區(qū)發(fā)病蠶數(shù)明顯低于添食1×109個(gè)/mL等高濃度的試驗(yàn)區(qū)發(fā)病蠶數(shù)；抗病蠶品種同種級、同血緣系統(tǒng)的抗BmNPV病材料的試驗(yàn)區(qū)發(fā)病蠶數(shù)明顯低于對照蠶品種的對應(yīng)種級或?qū)?yīng)血緣系統(tǒng)的試驗(yàn)區(qū)發(fā)病蠶數(shù)；對照蠶品種添食高濃度BmNPV多角體的試驗(yàn)區(qū)的發(fā)病蠶數(shù)最多，鮮有存活個(gè)體；即使同為抗BmNPV病系統(tǒng)材料，日系的湘、泰、湘·泰、泰·湘的發(fā)病蠶數(shù)也均不同程度地高于中系的華、康、華·康、康·華。

2.2 不同家蠶品種對BmNPV的抵抗力

將調(diào)查結(jié)果用IBM SPSS Statistics 21軟件計(jì)算抗BmNPV病家蠶新品種華·康×湘·泰和對照蠶品種洞·庭×碧·波對BmNPV的抵抗力，以LC50為判斷不同蠶品種、不同種級之間對BmNPV多角體抗性強(qiáng)弱的指標(biāo)。從表1和圖1可以看出，抗BmNPV病家蠶新品種華·康×湘·泰的不同種級對BmNPV多角體的LC50值均在109個(gè)/mL水平以上，而對照蠶品種洞·庭×碧·波的不同種級對BmNPV多角體的LC50值在106～107個(gè)/mL水平之間，最高僅為6.18×107個(gè)/mL，兩者差距明顯，華·康×湘·泰對BmNPV的抵抗力明顯強(qiáng)于洞·庭×碧·波。

表1 不同家蠶品種對BmNPV的抵抗力

續(xù)表1

圖1 不同家蠶品種對BmNPV的抵抗力

3 小結(jié)與討論

抗BmNPV病家蠶新品種華·康×湘·泰的正反交及其原原種、原種對BmNPV多角體的LC50值均大于1×109個(gè)/mL，對照蠶品種洞·庭×碧·波的正反交及其原原種、原種對BmNPV多角體的LC50值均在106～107個(gè)/mL水平之間，其中庭·洞最高，為6.18×107個(gè)/mL。蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院于2019年5月進(jìn)行了該品種的鑒定試驗(yàn)，華·康×湘·泰正反交對BmNPV多角體的LC50值均大于2.92×109個(gè)/mL(未發(fā)表)，與本次試驗(yàn)結(jié)果的趨勢是一致的?？笲mNPV病家蠶新品種華·康×湘·泰比對照蠶品種洞·庭×碧·波對BmNPV抗性強(qiáng)，具有明顯的優(yōu)勢。

本次試驗(yàn)與錢荷英等[5]對菁松N×皓月N檢測結(jié)果相一致，但沒有明顯表現(xiàn)出如孟智啟[6]、陳克平等[7]、朱勇等[8]研究所得的家蠶對BmNPV抗性的偏父遺傳現(xiàn)象，今后還需進(jìn)一步深入研究。此外，家蠶對BmNPV的抗性除了受遺傳因素影響外，還會(huì)受溫濕度、桑葉質(zhì)量、光照等多種內(nèi)外部因素的影響[9]。本次試驗(yàn)之所以選擇在湖南省早秋的蠶期進(jìn)行，是因?yàn)樵囼?yàn)環(huán)境條件較為惡劣，平均溫度超過30 ℃，環(huán)境干燥，葉質(zhì)差，可以更加切實(shí)體現(xiàn)出夏秋用家蠶新品種華·康×湘·泰的抗逆性。此次試驗(yàn)的結(jié)果僅是2018年秋季進(jìn)行1次試驗(yàn)得出的，尚不能全面反映華·康×湘·泰在不同季節(jié)、不同區(qū)域?qū)mNPV的抗性強(qiáng)弱，有待今后進(jìn)一步深入研究加以補(bǔ)充完善。