劉得貴 張應(yīng)龍 杜國(guó)輝 孟范永

（①山東省臨沂市蘭山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 276000 ②山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 山東 濟(jì)南③山東省東營(yíng)市畜牧獸醫(yī)局）

硝基咪唑類(lèi)藥物具有很強(qiáng)的抗厭氧菌作用，可用于防治禽類(lèi)的球蟲(chóng)病、組織滴蟲(chóng)病及六鞭蟲(chóng)病等，很受養(yǎng)殖戶(hù)的青睞，但其在動(dòng)物產(chǎn)品中的藥物殘留對(duì)食品安全構(gòu)成了直接威脅。此類(lèi)藥物在雞蛋中的殘留以及代謝物的狀況尤其另人擔(dān)憂(yōu)，目前國(guó)家相關(guān)政策文件規(guī)定不準(zhǔn)以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)為目的在所有食品動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中使用。但由于相關(guān)研究不夠深入和透徹，此類(lèi)藥物在動(dòng)物體內(nèi)(尤其是蛋雞)殘留及代謝情況目前尚不清楚，相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不盡完善，甚至沒(méi)有相關(guān)代謝物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。硝基咪唑類(lèi)藥物殘留檢測(cè)研究進(jìn)展旨在對(duì)在不同動(dòng)物性產(chǎn)品中藥物殘留檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，以期引起研究人員的重視，對(duì)此類(lèi)藥物的殘留及代謝情況予以詳細(xì)研究，在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定等方面起到一定的效果，制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)以指導(dǎo)用藥。

硝基咪唑類(lèi)藥物具有硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)，這一類(lèi)化合物包括甲硝唑(MNZ)、二甲硝咪唑(DMZ)、異丙硝唑(IPZ)、塞可硝唑(SCZ)、奧硝唑(ONZ)、替硝唑(TNZ) 、洛硝噠唑(RNZ)等。這類(lèi)藥物能夠殺菌、抗原蟲(chóng)，并且對(duì)厭氧菌有很強(qiáng)的殺滅作用[1]。其中甲硝唑除以上作用外，還對(duì)以下菌群有良好的抑制作用，比如脆弱擬桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽抱桿菌、以及黑色素?cái)M桿菌梭狀桿菌屬等；二甲硝咪唑不僅能抑制大腸弧菌、葡萄球菌、鏈球菌、多型性桿菌等，并能對(duì)組織滴蟲(chóng)、阿米巴原蟲(chóng)、纖毛蟲(chóng)等原蟲(chóng)具有很好的殺滅作用[1]。此類(lèi)藥物添加于飼料中，可預(yù)防仔豬下痢(要由螺旋體引起)，可防治禽球蟲(chóng)病、六鞭蟲(chóng)病以及組織滴蟲(chóng)病等，此外，使用此藥物對(duì)動(dòng)物體重還具有增加作用[1]。因此，此類(lèi)藥物目前在市面上，大受養(yǎng)殖戶(hù)、經(jīng)銷(xiāo)商等的青睞。但是，也有研究表明具有完整咪唑環(huán)的硝基咪唑類(lèi)藥物及其代謝物具有致癌、致突變作用，含有的硝基雜環(huán)具有細(xì)胞誘變性，有致癌性和潛在的致畸性。甲硝唑類(lèi)藥物中的硝基雜環(huán)除具有細(xì)胞誘變性以外，其在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物羥基甲硝唑(MNZ, MNZOH的代謝物)和羥基二甲硝咪唑(DMZ、HMMNI和RNZ的共同代謝物)與原藥具有類(lèi)似毒性，如果任其在動(dòng)物源性食品中殘留，則會(huì)對(duì)食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2]。因此，我國(guó)已將這類(lèi)藥物列入《食用動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》中。在歐盟，分別在1993年、1995年和1998年禁止RNZ、DMZ和MNZ這3種藥物用于食用動(dòng)物；在美國(guó)，2002年，美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)公布了在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中禁止使用包括DMZ等硝基咪唑類(lèi)藥物在內(nèi)的共11種藥物；在我國(guó)，農(nóng)業(yè)部和國(guó)家藥品監(jiān)督管理局明確在第227號(hào)公告中規(guī)定，不準(zhǔn)以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)為目的，在所有食品動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中使用MNZ、DMZ及其鹽、酯及制劑[3]。

隨著我國(guó)史上最強(qiáng)食品安全法的出臺(tái)，國(guó)家對(duì)獸藥殘留的監(jiān)控更加嚴(yán)格，在畜產(chǎn)品的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，涉及到人體使用的藥品被逐漸禁止。但是，作為畜產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中的治療用藥，以及以其他目的使用此藥物，都有可能導(dǎo)致該類(lèi)藥物在動(dòng)物性食品中殘留，因此，如何準(zhǔn)確同步測(cè)定動(dòng)物組織、產(chǎn)品及排泄物中藥物殘留及代謝物殘留狀況對(duì)人類(lèi)食品安全至關(guān)重要。本文就硝基咪唑類(lèi)藥物在不同動(dòng)物性產(chǎn)品中藥物殘留及代謝物測(cè)定情況進(jìn)行了綜述。

1 硝基咪唑類(lèi)藥物的檢測(cè)方法

（1）迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)于硝基咪唑類(lèi)藥物的檢測(cè)均有大量報(bào)道，研究的檢測(cè)方法多是針對(duì)可食性動(dòng)物產(chǎn)品、動(dòng)物組織以及動(dòng)物排泄物，還包括動(dòng)物所用飼料。在飼料中的測(cè)定方法可以追溯至20世紀(jì)80年代左右，硝基咪唑開(kāi)始作為獸藥或促生長(zhǎng)添加劑的時(shí)后，氣相色譜法較少，大部分為高效液相色譜法[4]。但高效液相色譜法靈敏度低，容易被雜質(zhì)干擾，無(wú)法準(zhǔn)確定性；氣相色譜質(zhì)譜方法前處理繁瑣，干擾因素也較多，適用范圍不夠?qū)?；目前逐漸處于淘汰當(dāng)中；LCMS/MS法由于靈敏度高，而且抗干擾性強(qiáng)，目前在硝基咪唑類(lèi)藥物多殘留的檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用[5]。（2）隨著食品安全問(wèn)題越來(lái)越受重視，檢測(cè)儀器的飛速發(fā)展，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于具有儀器的精密性、檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，處理受到人為因素減少等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為熱點(diǎn)的檢測(cè)方法，其他方法逐漸成淘汰趨勢(shì)；除此之外，由于快速檢測(cè)的需要，酶聯(lián)免疫法測(cè)定硝基咪唑類(lèi)藥物殘留等食品快速檢測(cè)方法也有了長(zhǎng)足的進(jìn)展。這兩種方法被用來(lái)對(duì)不同動(dòng)物性產(chǎn)品中的硝基咪唑類(lèi)藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，但快速檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度仍不能和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法相比擬。

2 硝基咪唑類(lèi)藥物殘留在不同動(dòng)物性產(chǎn)品中檢測(cè)進(jìn)展

硝基咪唑類(lèi)藥物殘留在不同動(dòng)物性產(chǎn)品中的檢測(cè)，目前許多學(xué)者已經(jīng)開(kāi)展了很多不同檢測(cè)方法的研究，主要有：李小橋等建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法Uplc-MS/MS測(cè)定了牛肉中地美硝唑、甲硝唑、洛硝唑和替硝唑殘留量。樣品前處理為乙酸乙酯提取，用正己烷浸提除脂，親水親脂平衡柱萃取凈化，以C18反相色譜柱為分析柱，0.1%甲酸水-乙睛為流動(dòng)相，采用電噴霧電離源(ESI+)對(duì)樣品分析。結(jié)果顯示，回收率、線性范圍均較好，定量限也較低，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)牛肉中4種藥物的檢測(cè)[5]。王揚(yáng)等建立了一種同時(shí)測(cè)定羅非魚(yú)肌肉中甲硝唑、奧硝唑、地美硝唑、洛硝噠唑、替硝唑這5種藥物的殘留量的反相高效液相色譜法。前處理方法為：水產(chǎn)品肌肉組織經(jīng)勻漿，加氯化鈉、磷酸氫二鉀和乙酸乙酯振蕩提取濃縮，殘余物加鹽酸和乙酸乙酯溶解，正己烷去脂后過(guò)MCX柱，2%濃氨水甲醇溶液洗脫，色譜柱分離酸氨緩沖液-乙腈(86：14，V/V)為流動(dòng)相，320nm紫外檢測(cè)。結(jié)果顯示：測(cè)定肌肉組織中5種硝基咪唑類(lèi)藥物的最低檢測(cè)限均為1.0μg/kg，在2.0μg/kg的加樣水平下，5種藥物在羅非魚(yú)中的回收率最低為62.9%，每一種的標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于10%，其靈敏度，準(zhǔn)確度和精密度均符合我國(guó)農(nóng)業(yè)部獸藥殘留分析方法的要求[6]。勵(lì)炯等建立了水產(chǎn)品中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法，分散固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。使用分散固相萃取技術(shù)前處理，省去了濃縮、固相小柱萃取等步驟。具體方法為：樣品經(jīng)含0.1%氨水乙腈提取，加無(wú)水硫酸鈉、Cm-N以及NH2-PSA凈化劑后渦旋振蕩對(duì)樣品進(jìn)行提純，以甲醇甲酸水溶液為流動(dòng)相，C18色譜柱分離，梯度洗脫，電噴霧電離質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果顯示：在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，5種硝基咪唑類(lèi)藥物在20～500mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。適用于水產(chǎn)品中5種硝基咪唑類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)，可滿(mǎn)足水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)需求[2]。Huet A C等用直接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法檢測(cè)了雞蛋和雞肉中甲硝唑(MNZ)含量，使用抗體顯示出與二甲硝咪唑(DMZ)，羅硝唑(RNZ)，羥基二甲硝唑(DMZOH)和異噻唑(IPZ)的交叉反應(yīng)性。用乙腈提取雞蛋和雞肉肌肉樣品，并用己烷洗滌除去脂肪。結(jié)果顯示：甲硝唑、二甲硝唑、羅硝唑、羥基二甲硝唑和異噻唑在檢測(cè)限極低情況下均能檢出[7]。Kanda,Maki等利用LC/MS/MS開(kāi)發(fā)了一種快速有效的測(cè)定蜂蜜中的四種硝基咪唑(即二甲硝咪唑，異噻唑，甲硝唑和羅硝唑)和三種親水代謝物(即2-羥甲基-1-甲基-5-硝基咪唑，1-甲基-2-(2'-羥基異丙基)-5-硝基咪唑和1-(2-羥乙基)-2-羥甲基-硝基咪唑的方法。此方法前處理快速(約30min)，使用較少的有機(jī)溶劑，應(yīng)用QuEChERS(快速，簡(jiǎn)便，廉價(jià)，有效，堅(jiān)固，安全)程序進(jìn)行對(duì)硝基咪唑的檢測(cè)分析。此方法7種硝基咪唑的總回收率為76.1%～98.5%；在0.1～0.5mug/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[8]。WANG Yang等建立了高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)分析羅非魚(yú)肌肉組織中5種硝基咪唑多殘留物(甲硝唑，二甲硝咪唑，奧硝唑，替硝唑和羅丹唑)的樣品。將樣品均質(zhì)化并加入氯化鈉，磷酸一鉀萃取。然后，回收有機(jī)相并濃縮。最后，將殘余物溶于鹽酸/乙酸乙酯中，加入正己烷通過(guò)液-液萃取脫脂，在MCX柱上用2%洗脫進(jìn)行凈化。氨/甲醇，色譜分離，乙酸鹽緩沖溶液/乙腈(86：14，V/V)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm。結(jié)果表明，5種硝基咪唑的檢出限均為1.0μg/kg，回收率以及線性良好[9]。W Han等開(kāi)發(fā)了一種基于單克隆抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ic-ELISA)酶聯(lián)免疫試劑盒，可同時(shí)測(cè)定動(dòng)物性組織和飼料中的硝基咪唑類(lèi)獸藥，樣品制備方法簡(jiǎn)單的，甲硝唑，二甲硝咪唑，奧硝唑，替硝唑，洛硝噠唑的含量檢測(cè)可達(dá)到微克級(jí)別，在動(dòng)物組織中的含量回收率在75.5%～111.8%之間，相關(guān)性良好[10]。Guo X C等利用對(duì)不同硝基咪唑類(lèi)藥物的分子印跡固相萃取技術(shù)。此方法用于蜂蜜樣品中的硝基咪唑類(lèi)藥物檢測(cè)。不同硝基咪唑類(lèi)藥物的定量限為1.0μg/kg，結(jié)果良好[11]。Mitrowska等利用改進(jìn)的分子印跡固相萃取前處理方法，建立了選擇性測(cè)定蜂蜜中14種硝基咪唑及其羥基代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法。具體為：C-18柱分離，使用0.1%甲酸的乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液的梯度洗脫。該方法適用于甲硝唑、羥甲硝唑、二甲硝唑、羅丹唑、羥基二甲硝唑、異噻唑、羥基咪唑、卡那唑、甲硝唑、尼莫唑、奧硝唑、二硝唑、三硝唑和替硝唑。該方法測(cè)定硝基咪唑及其羥基代謝物低于推薦的濃度水平3μg/kg。檢測(cè)線可分別低至0.110～0.387μg/kg和0.179～0.508μg/ kg，且方法穩(wěn)定性較好。該方法已成功應(yīng)用于各種蜂蜜樣品的分析[12]。Boison等開(kāi)發(fā)了一種新的靈敏的多殘留方法(MRM)，通過(guò)LC-MS/MS檢測(cè)，用于篩選，測(cè)定和確定濃度≥0.05ng的火雞肌肉組織中7種硝基咪唑及其3種代謝物的殘留物。前處理為用堿金屬鹽將化合物萃取到溶劑中，然后通過(guò)固相萃取(SPE)進(jìn)行樣品凈化和濃縮，并通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定量化合物，確定了新方法的重復(fù)性，選擇性，耐用性，穩(wěn)定性，定量水平和確認(rèn)水平等特征參數(shù)[13]。Chi Z 等合成了2-甲基-5-硝基咪唑半抗原，用于制備免疫抗原和包膜抗原，用抗原制備2-甲基-5-硝基咪唑常見(jiàn)抗體，建立了5種硝基咪唑的ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果表明：制備了滴度為1：100000的抗血清，同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源食品中硝基咪唑多殘留的ELISA，回收率為85.65%～108%，檢出限低至1.9×10～4mg/L。該研究為動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的快速檢測(cè)提供了技術(shù)基礎(chǔ)[14]。Fang C等建立了高效液相色譜結(jié)合共振瑞利散射的新型高靈敏度方法，用于測(cè)定蜂蜜中的硝基咪唑殘留，包括甲硝唑(MNZ)，奧硝唑(ONZ)和咪唑(TNZ)。在pH3.8 BR緩沖溶液中，通過(guò)HPLC分離3種硝基咪唑類(lèi)藥物，并對(duì)柱后衍生的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，3種硝基咪唑類(lèi)藥物的檢出信號(hào)隨著其濃度在相應(yīng)線性范圍內(nèi)的增加而增強(qiáng)[15]。Zi-Tong Z等采用加速溶劑萃取法，用乙酸乙酯萃取樣品，凝膠滲透色譜純化。實(shí)驗(yàn)條件為安捷倫Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(2.1mm×100mm，3.5μm)，流動(dòng)相由0.15%甲酸溶液(A)-甲醛(B)組成，采用正離子模式運(yùn)行質(zhì)譜儀，同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。結(jié)果：相關(guān)系數(shù)為0.9961～0.9982，方法檢出限為1.5μg/kg，定量限為5.0μg/kg。結(jié)論：所建立的方法在定性和定量分析中被證明具有高度自動(dòng)化，高靈敏度和準(zhǔn)確性[16]。Rúbies, A.等提出了一種高通量驗(yàn)證方法，用于分析肌肉樣品中的11種硝基咪唑。前處理使用乙腈萃取，此方法有效簡(jiǎn)單，大多數(shù)回收率在65%～101%之間，并且不需要清除萃取物。在MRM模式下使用UPLC-QqQMS進(jìn)行色譜分析，其中電噴霧源以正模式操作。總色譜分析時(shí)間為12min。該方法目前用于肌肉樣品的分析，并已在其他動(dòng)物來(lái)源，如腎和蛋中進(jìn)行測(cè)試，效果良好[17]。

3 結(jié)語(yǔ)

綜合以上研究進(jìn)展可以看出，在硝基咪唑類(lèi)藥物殘留檢測(cè)方面，許多學(xué)者已經(jīng)做了大量的工作，有快速檢測(cè)的方法，有液相檢測(cè)方法以及液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法等，前處理采取的方法也均有其新意及可取之處，除了提取的溶劑不相同外，具體的操作步驟也不盡相同。通過(guò)檢測(cè)基本都取得了一定的滿(mǎn)意效果。但是通過(guò)所有進(jìn)展，我們看出，所有的方法均是針對(duì)硝基咪唑類(lèi)藥物殘留展開(kāi)的，由于硝基咪唑類(lèi)藥物在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行代謝，關(guān)于代謝產(chǎn)物的情況以及危害不明，對(duì)于代謝產(chǎn)物的檢測(cè)更無(wú)從談起。針對(duì)蛋雞的養(yǎng)殖，目前根據(jù)國(guó)家相關(guān)法規(guī)及規(guī)定，能夠合法使用的獸藥越來(lái)越少，且能夠使用的獸藥都要嚴(yán)格的條件限制。但是，在雞蛋中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留以及代謝物檢測(cè)仍未有相關(guān)方法的出現(xiàn)，同時(shí)國(guó)家尚未制定出此類(lèi)藥物在雞蛋中殘留檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，許多不法分子瞄準(zhǔn)了在蛋雞養(yǎng)殖過(guò)程中飼喂此類(lèi)藥物，從而規(guī)避市場(chǎng)因獸藥殘留檢測(cè)不合格帶來(lái)的處罰風(fēng)險(xiǎn)。因此，此類(lèi)藥物在雞蛋中的殘留以及代謝物的狀況引人擔(dān)憂(yōu)。為此，對(duì)硝基咪唑類(lèi)藥物殘留檢測(cè)應(yīng)該關(guān)注其在動(dòng)物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的情況，這將是未來(lái)咪唑類(lèi)檢測(cè)的研究方向，加強(qiáng)對(duì)此類(lèi)藥物及其代謝物殘留情況的研究，以及對(duì)其檢測(cè)方法做詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)化的研究，都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。