張晶，許凱，梁潔，陳強(qiáng)，馬群英，梁麗娜

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京 100040)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是55歲以上人群主要的致盲眼病之一。隨著中國(guó)老齡化問(wèn)題的日益嚴(yán)重，其患病率逐年升高，其發(fā)病機(jī)制和防治成為研究的熱點(diǎn)，合適的動(dòng)物模型是相關(guān)研究工作的重要工具。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外建立了各種AMD動(dòng)物模型[1]，不同的動(dòng)物模型各有其優(yōu)缺點(diǎn)，理想的動(dòng)物模型應(yīng)該更經(jīng)濟(jì)和更接近于人類(lèi)AMD自然病程。AMD的病因和發(fā)病機(jī)制仍然存在很大的爭(zhēng)議，目前得到公認(rèn)的是受年齡、基因和環(huán)境的影響，其中吸煙和光暴露是AMD發(fā)生的重要環(huán)境危險(xiǎn)因素，既往大量報(bào)道以吸煙、光照誘導(dǎo)出部分AMD病理改變動(dòng)物模型[2-3]，而人類(lèi)AMD是一個(gè)多因素作用、光感受器細(xì)胞、RPE細(xì)胞和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管之間相互影響形成的復(fù)雜“系統(tǒng)”的表現(xiàn)。因此，聯(lián)合多種發(fā)病誘因，盡可能模擬AMD發(fā)生的環(huán)境因素，可能會(huì)建立更接近人AMD發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。本研究，我們采用慢性光照聯(lián)合氫醌飼料喂養(yǎng)的方法誘導(dǎo)出類(lèi)似晚期AMD病變模型，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4月齡健康雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠20只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)【SYXK(京)2014-0019】。溫度(22±5)℃，濕度(50±5)%。所有實(shí)驗(yàn)操作遵循眼科技視覺(jué)研究動(dòng)物ARVO宣言，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 試劑與儀器

氫醌(Sigma-Aldrich，H9003)；TUNEL細(xì)胞原位凋亡試劑盒(Roche Life Science，12156792910)； HE染色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，C02-04004)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色液(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，BD PharmingenTM，564907)；抗熒光淬滅劑(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，C-101)； DNA酶I(大連TaKaRa公司，D2270 A)；冰凍包埋劑(optimal cutting temperature compound，O.C.T，美國(guó)Sakura公司，4583)； 4%多聚甲醛(北京Unique生物科技有限公司，P1110)；VEGF(Abcam，ab52917)；CD31(Abcam，ab28364)；羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，AE042337)；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA, 北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-2315)。光學(xué)顯微鏡(DM2500，Leica，德國(guó)), 透射電子顯微鏡(JEM-1400，日本電子株式會(huì)社，日本), 冰凍切片機(jī)(CM1850，Leica，德國(guó))，光照度計(jì)(北京師范大學(xué)光電儀器廠，ST-85，中國(guó))，大鼠SPF級(jí)生長(zhǎng)繁育飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司,中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立

動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組10只，正常對(duì)照組10只。模型組小鼠置于自主設(shè)計(jì)的LED光照裝置中(專利號(hào)：2017210439226)波長(zhǎng)400～750 nm，光照度計(jì)測(cè)量，保證在動(dòng)物頭部水平測(cè)量光照強(qiáng)度可達(dá)2500 lx，每日接受12 h光照；同時(shí)被喂以基于基礎(chǔ)純凈合成的含8 g/(kg·bw)的飲食；正常組小鼠被喂以不含氫醌的同配方飲食，正常晝夜節(jié)律飼養(yǎng)。兩組動(dòng)物飼養(yǎng)3.5個(gè)月后進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。

1.2.2 視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢測(cè)

各組小鼠于檢測(cè)前暗適應(yīng)24 h，復(fù)方托吡卡胺滴眼液點(diǎn)雙眼常規(guī)散瞳20 min；采用鹽酸氯胺酮-鹽酸塞拉嗪混合麻醉劑(v∶v=1∶7)肌注(0.01 mL/kg)麻醉小鼠。檢測(cè)操作全程均在弱紅光燈下進(jìn)行操作。將參考電極和接地電極分別置于小鼠正中頭皮下及雙下肢皮下。將雙側(cè)角膜電極置于大鼠雙側(cè)眼瞼內(nèi)，保持各電極間阻抗始終<5 kΩ。以Ganzfeld全視野刺激器進(jìn)行刺激，根據(jù)國(guó)際臨床視覺(jué)電生理協(xié)會(huì)(ISCEV)制定的最新國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[4]，依次選定暗適應(yīng)0.01 ERG，暗適應(yīng)3.0 ERG，暗適應(yīng)3.0 震蕩電位，(自動(dòng)明適應(yīng) 10 min)明適應(yīng)3.0 ERG，閃爍光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。依次記錄各組a波、b波的峰時(shí)值(ms)和振幅值(μV)。

1.2.3 視網(wǎng)膜光鏡觀察

頸椎脫臼法處死小鼠，快速摘取眼球，1 mL注射器角膜穿刺置于4%多聚甲醛固定20 min，解剖顯微鏡下小心去除眼前節(jié)和部分玻璃體，余下組織繼續(xù)固定24 h，梯度酒精脫水、二甲苯透明后浸蠟包埋。連續(xù)4 μm切片，切片常規(guī)脫蠟至水后行HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察視網(wǎng)膜各層病理改變。

1.2.4 視網(wǎng)膜透射電鏡檢測(cè)

頸椎脫臼法處死小鼠，快速摘取眼球，立刻置于4℃，2.5%戊二醛中固定0.5 h，顯微鏡下去除眼前節(jié)組織及部分玻璃體，保留視杯，解剖顯微鏡下切取視乳頭顳側(cè)1 mm上方全層眼球壁，大小1 mm× 1 mm × 2 mm。鋨酸固定、梯度酒精脫水、環(huán)氧丙烷樹(shù)脂浸透包埋組織，制作900 nm超薄切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛避光染色、風(fēng)干，透射電子顯微鏡觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 TUNEL檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡

動(dòng)物眼球取材固定同HE染色，4%多聚甲醛液中4℃固定24 h后，冰凍包埋劑OCT包埋后液氮冷凍。冰凍切片機(jī)-23℃下行垂直視網(wǎng)膜的8 μm冰凍切片。冰凍切片磷酸緩沖液(PBS)室溫15 min ×3次洗脫包埋劑，進(jìn)行TUNEL檢測(cè)，具體操作參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明，完成后進(jìn)行DAPI復(fù)染細(xì)胞核，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。每組隨機(jī)選取10張片子，每張切片計(jì)數(shù)一個(gè)高倍視野下凋亡的感光細(xì)胞數(shù)及感光細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡率。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)VEGF及CD31表達(dá)

將冰凍切片置于磷酸緩沖液(PBS)室溫10 min × 3次，然后置于1% Triton X-100 溶液30 min，2%牛血清白蛋白的室溫封閉 2 h后依組別分別滴加一抗VEGF，CD31，4℃孵育過(guò)夜。PBS溶液室溫洗滌10 min × 3次，滴加羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗,室溫下孵育 1 h，PBS清洗10 min × 3次，DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min?？篃晒馑p封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢測(cè)

暗適應(yīng)0.01 ERG正常組視網(wǎng)膜b波振幅(234.00±20.95)μV，模型組b波振幅(113.00±16.13)μV，模型組較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；暗適應(yīng)3.0 ERG正常組b波振幅(355.50±61.08)μV，模型組(129.00+18.05)μV，模型組較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。暗適應(yīng)3.0 震蕩電位正常組b波振幅(575.00±115.11)μV，模型組(284.25±55.25)μV，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；明適應(yīng)3.0 ERG正常組b波振幅(138.00±17.53)μV，模型組(44.50±7.59)μV，較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；閃爍光反應(yīng)正常組b波振幅(163.00±30.27)，模型組(50.50±11.03)μV，模型組較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)表1。

表1 正常組及模型組視網(wǎng)膜電圖檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 Electroretinogram (ERG) test between the normal and model groups ± s，n=10)

注：A：正常組,視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列規(guī)整，細(xì)胞形態(tài)均一，視網(wǎng)膜色素上皮層連續(xù)整齊。B：模型組,視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列較為疏松，感光細(xì)胞較正常組減少，視網(wǎng)膜色素上皮層呈現(xiàn)萎縮樣改變，Bruch膜可見(jiàn)中斷，血管樣組織長(zhǎng)入(白色箭頭)。RGCs：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層；RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層。圖1 正常組及模型組視網(wǎng)膜病理圖像(HE染色，×400)Note.A, Normal group, the retina layers were arranged regularly, the cell morphology was uniform, and the retinal pigment epithelium layers were continuous and orderly. B, Model group, the arrangement of retinal layers was looser, the number of photoreceptor cells was less than which in normal group, the RPE layer showed atrophic changes, Bruch membrane was interrupted, and vascular-like tissue grew into (white arrow). RGCs：Retinal ganglion cells. INL：Inner nuclear layer. ONL:Outter nuclear layer. RPE：Retinal pigment epithelium layer.Figure 1 Pathological changes of the retinas in the normal and model groups(HE staining,×400)

2.2 視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)光鏡觀察

正常組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列規(guī)整，細(xì)胞形態(tài)均一，視網(wǎng)膜色素上皮層連續(xù)整齊，與正常組相比，模型組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列較為疏松，感光細(xì)胞較正常組減少，視網(wǎng)膜色素上皮層呈現(xiàn)萎縮樣改變，Bruch膜結(jié)構(gòu)破壞，可見(jiàn)血管樣組織長(zhǎng)入，部分區(qū)域增厚，部分區(qū)域變薄，感光細(xì)胞計(jì)數(shù)正常組為(243.33±15.231)，模型組(164.67±34.37)，模型組感光細(xì)胞數(shù)目明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.77,P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3 視網(wǎng)膜電鏡觀察

正常組小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞膜盤(pán)結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，色素上皮細(xì)胞線粒體豐富，頂部微絨毛數(shù)量多而且長(zhǎng)，Bruch膜結(jié)構(gòu)規(guī)整，厚度均勻。模型組小鼠感光細(xì)胞膜盤(pán)結(jié)構(gòu)松散變形，出現(xiàn)分離、碎解，固縮等改變。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)色素粒減少，頂部微絨毛較正常組稀疏變短，RPE下可見(jiàn)沉積物，Bruch膜結(jié)構(gòu)不規(guī)整，厚度不均勻，部分出現(xiàn)中斷，內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入，見(jiàn)圖2。

注： A、B正常組，A圖示膜盤(pán)結(jié)構(gòu)，B圖示Bruch膜及周?chē)Y(jié)構(gòu)。C-F模型組，C圖可見(jiàn)盤(pán)膜結(jié)構(gòu)散亂變形，D-F圖色素上皮細(xì)胞頂部微絨毛稀疏變短，RPE下沉積物(箭頭)，Bruch膜不規(guī)則，可見(jiàn)中斷，內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入(黑色箭頭)。圖2 小鼠視網(wǎng)膜透射電子顯微鏡圖Note. A,B. Normal group. A, Structure of the rod outer segment. B, Bruch membrane and its surrounding structures.C-F. Model groups. C. The disc membrane structure was disorganized and deformed. D-F. the microvilli at the top of the pigment epithelial cells were sparse and shorter, the deposits under RPE (arrow), the Bruch membrane was irregular, and the endothelial cells grew in (black arrow).Figure 2 Transmission electron micrographs of the mouse retinas

注：A:正常組，未見(jiàn)凋亡細(xì)胞；B:模型組，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞呈紅色，藍(lán)色為DAPI復(fù)染細(xì)胞核。RGCs：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層；RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層。圖3 TUNEL檢測(cè)正常組及模型組視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡情況Note. A, Normal group, showing no apoptotic cells. B, Model group, showing a large amount of apoptotic cells (red) in the photoreceptor layer of the retina. The cell nuclei were stained as blue by DAPI.(RGCs：Retinal ganglion cells；INL：Inner nuclear layer；ONL:Outter nuclear layer：RPE：Retinal pigment epithelium layer)Figure 3 Apoptosis in photoreceptor cells of the normal and model groups(TUNEL staining)

2.4 視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況

正常組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞核排列規(guī)整，幾乎未見(jiàn)凋亡細(xì)胞，模型組感光細(xì)胞層細(xì)胞核較正常組減少，可發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，感光細(xì)胞凋亡率(43.00±2.73)%。見(jiàn)圖3。

2.5 視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)情況

正常組視網(wǎng)膜未見(jiàn)明確的VEGF表達(dá)，模型組視網(wǎng)膜色素上皮層及內(nèi)核細(xì)胞層可見(jiàn)較強(qiáng)的VEGF陽(yáng)性染色。見(jiàn)圖4。

2.6 視網(wǎng)膜CD31表達(dá)情況

正常組視網(wǎng)膜未見(jiàn)明確的CD31表達(dá)，模型組視網(wǎng)膜色素上皮層可見(jiàn)較強(qiáng)的CD31陽(yáng)性染色。見(jiàn)圖5。

注：A:正常組，未見(jiàn)明確VEGF染色；B:模型組，視網(wǎng)膜色素上皮層及內(nèi)核層可見(jiàn)VEGF陽(yáng)性染色呈紅色(白箭)，藍(lán)色信號(hào)為DAPI復(fù)染的細(xì)胞核。RGCs：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層；RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層。圖4 免疫熒光檢測(cè)正常組及模型組視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)情況Note. A， Normal group, showing no VEGF-stained cells. B, Model group, showing VEGF-positive cells in both RPE layer and the inner nuclear layer (white arrow)，and all the cell nuclei were stained as blue by DAPI. RGCs：Retinal ganglion cells；INL：Inner nuclear layer；ONL:Outter nuclear layer：RPE：Retinal pigment epithelium layer.Figure 4 VEGF expression in the retina tissues of normal and model groups(Immunofluorescence staining)

注：A:正常組，未見(jiàn)明確CD31染色；B:模型組，視網(wǎng)膜色素上皮層可見(jiàn)CD31陽(yáng)性染色呈紅色(白箭)，藍(lán)色信號(hào)為DAPI復(fù)染的細(xì)胞核。RGCs：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層；RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層。圖5 免疫熒光檢測(cè)正常組及模型組視網(wǎng)膜CD31表達(dá)情況Note. A， Normal group, showing no significant CD31-stained cells. B, Model group, showing numerous CD31-positive cells in the retinal pigment epithelium (white Arrows)，and all the cell nuclei were stained as blue by DAPI. RGCS：Retinal ganglion cells；INL：Inner nuclear layer；ONL:Outter nuclear layer：RPE：Retinal pigment epithelium layer.Figure 5 CD31 expression in the retinas of the normal and model groups(Immunofluorescence staining)

3 討論

目前用于AMD研究的動(dòng)物模型種類(lèi)較多，如AMD易感基因工程動(dòng)物模型[5]；激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)模型，玻璃體腔注射生長(zhǎng)因子誘發(fā)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜新生血管模型，靜脈注射碘酸鈉誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷模型，光致視網(wǎng)膜損傷模型等[6]。模型各有特點(diǎn)，但大多偏重于AMD某種病理特征。部分基因工程小鼠模型雖可以呈現(xiàn)人類(lèi)AMD的特征性變化，但模型建立費(fèi)用高昂，動(dòng)物因免疫缺陷及代謝異常存活率低，不易于普及利用。理想動(dòng)物模型應(yīng)更近似于臨床AMD發(fā)病過(guò)程，大量研究證實(shí)衰老、吸煙[7-8]及持續(xù)可見(jiàn)光暴露[9-11]與AMD發(fā)生的關(guān)系密切。故本研究選擇氫醌飼料喂養(yǎng)及慢性可見(jiàn)光暴露模擬AMD發(fā)病的環(huán)境危險(xiǎn)因素。氫醌是香煙中的主要有害物質(zhì)，具有極強(qiáng)的氧化性，既往研究證實(shí)，置于吸煙環(huán)境中的小鼠可出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮層下沉積物、Bruch膜變薄及RPE細(xì)胞凋亡等改變，與人AMD早期改變類(lèi)玻璃膜疣形成相似[12]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氫醌處理體外培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞系，可觀察到細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)氧化損傷，大量親電子化合物細(xì)胞內(nèi)蓄積并誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞系列損傷[13-16]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)利用含0.8 g/(kg·bw)氫醌飼料喂養(yǎng)小鼠3.5月后，觀察到視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜下出現(xiàn)類(lèi)玻璃膜疣狀物沉積，但光感受器細(xì)胞病變并不明顯[3]。光損傷是AMD另一個(gè)重要的環(huán)境危險(xiǎn)因素，AMD 發(fā)病與長(zhǎng)期低強(qiáng)度光損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)可見(jiàn)光通過(guò)光毒性和化學(xué)毒性導(dǎo)致視網(wǎng)膜感光細(xì)胞及RPE損傷[17]，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用光照強(qiáng)度為2500 lx 的白色光源照射2月齡小型豬3個(gè)月后，視網(wǎng)膜發(fā)生慢性損傷，以視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞及感光細(xì)胞凋亡為特點(diǎn)，內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)量減少，視網(wǎng)膜厚度降低[18-19]。此外研究證實(shí)，吸煙與可見(jiàn)光暴露對(duì)于視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷還存在交互作用，Zinflou 等[20]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)香煙煙霧成分可導(dǎo)致RPE細(xì)胞對(duì)于藍(lán)光呈現(xiàn)較高的吸收率，導(dǎo)致RPE細(xì)胞光損傷加劇。因此，將吸煙與光照兩種AMD發(fā)病誘因相聯(lián)合，有可能建立與AMD自然病程及病理特點(diǎn)更接近的動(dòng)物模型。

人類(lèi)AMD是涉及光感受器細(xì)胞、RPE細(xì)胞以及脈絡(luò)膜血管病變的復(fù)雜病理過(guò)程。早期病變?yōu)橐暰W(wǎng)膜黃斑區(qū)出現(xiàn)玻璃膜疣狀沉積物drusen，直徑65～125 μm，RPE細(xì)胞無(wú)異常改變；進(jìn)入中期，黃斑區(qū)可見(jiàn)直徑125 μm以上drusen形成，同時(shí)伴有RPE細(xì)胞色素紊亂；隨著病情進(jìn)展，視網(wǎng)膜RPE局灶性脫離，內(nèi)層視網(wǎng)膜細(xì)胞萎縮；晚期可見(jiàn)脈絡(luò)膜新生血管長(zhǎng)入Bruch膜或視網(wǎng)膜地圖狀萎縮，前者又被稱為濕性AMD，后者為干性AMD[21]。本實(shí)驗(yàn)選擇C57BL/6近交系小鼠為觀察對(duì)象，盡管小鼠視網(wǎng)膜缺乏確切的黃斑結(jié)構(gòu)，但其視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞、RPE細(xì)胞、Bruch膜及脈絡(luò)膜血管等結(jié)構(gòu)與人類(lèi)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)極為類(lèi)似，因此觀察小鼠視網(wǎng)膜各結(jié)構(gòu)在AMD重要發(fā)病因素作用下的病理變化，可為研究人類(lèi)AMD的發(fā)生提供客觀的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)將AMD發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素相聯(lián)合，4月齡C57BL/6小鼠依據(jù)發(fā)育周期已屬于中年[22]，歷經(jīng)3.5個(gè)月實(shí)驗(yàn)周期恰好進(jìn)入老年期；每日以含有0.8 g/(kg·bw)氫醌飼料喂養(yǎng)小鼠模擬吸煙環(huán)境；采用自主設(shè)計(jì)的LED冷光源燈架，光源波長(zhǎng)范圍為400～750 nm模擬人眼可感知的光波范圍，以光照強(qiáng)度2500 lx每日光照小鼠12 h，進(jìn)行慢性光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷，既保持動(dòng)物正常的晝夜節(jié)律，又模擬人類(lèi)隨著時(shí)間進(jìn)展視網(wǎng)膜細(xì)胞不斷發(fā)生變化的特點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)模型組動(dòng)物視網(wǎng)膜進(jìn)行功能學(xué)和形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。模型組動(dòng)物ERG結(jié)果暗適應(yīng)0.01 ERG，暗適應(yīng)3.0 ERG以及明適應(yīng)3.0 ERG的b波振幅降低，提示視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞以及內(nèi)層視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生損傷，與人類(lèi)視網(wǎng)膜變性類(lèi)疾病ERG呈現(xiàn)類(lèi)似的變化趨勢(shì)；電鏡觀察到模型組視網(wǎng)膜感光細(xì)胞膜盤(pán)結(jié)構(gòu)松散變形，碎解，RPE細(xì)胞內(nèi)色素粒減少，下方可見(jiàn)沉積物；上述變化與本課題組前期實(shí)驗(yàn)單純氫醌喂養(yǎng)小鼠結(jié)果一致[3]，此外視網(wǎng)膜還出現(xiàn)Bruch膜結(jié)構(gòu)及厚度均欠規(guī)整，部分出現(xiàn)中斷，內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入等變化。光鏡下不但觀察到模型組視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層細(xì)胞數(shù)量顯著減少(t=-9.77,P<0.05)，RPE細(xì)胞呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)，還可見(jiàn)血管樣組織由脈絡(luò)膜層向內(nèi)長(zhǎng)入，破壞Bruch膜結(jié)構(gòu)，經(jīng)免疫熒光檢測(cè)該區(qū)域內(nèi)與血管生長(zhǎng)密切相關(guān)的因子VEGF、CD31呈陽(yáng)性表達(dá)，提示病變向中晚期進(jìn)展。

本研究選擇AMD發(fā)病的高危因素：衰老、吸煙以及持續(xù)可見(jiàn)光暴露建立動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不但出現(xiàn)類(lèi)似于玻璃膜疣的視網(wǎng)膜下沉積物，還可觀察到Bruch膜破壞，血管樣結(jié)構(gòu)由脈絡(luò)膜向內(nèi)長(zhǎng)入等更類(lèi)似于臨床晚期AMD的病理特征。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇遺傳背景清晰的近交系小鼠，個(gè)體差異小，模型建立過(guò)程操作難度適中，可重復(fù)性高，為進(jìn)一步研究AMD發(fā)病、預(yù)防及治療提供了較好的研究工具。本次研究未發(fā)現(xiàn)突破RPE層的典型脈絡(luò)膜新生血管組織，可能與觀察時(shí)間較短有關(guān)，在今后的研究中延長(zhǎng)造模時(shí)間，同時(shí)增加脈絡(luò)膜鋪片等觀察方法進(jìn)一步明確CNV的生長(zhǎng)和發(fā)展。