蘇先芝，劉一斐，孔文娟，閆菲，王曉梅，韓福國(guó),劉清飛*,史云，

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029； 2. 清華大學(xué)藥學(xué)院，北京 100084； 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700)

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)，是指40歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退，主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常(閉經(jīng)、月經(jīng)稀發(fā)或頻發(fā))、促性腺激素水平升高(FSH>25 IU/L)和雌激素水平波動(dòng)性下降[1]。由于卵巢功能的減退導(dǎo)致女性生育力的喪失和低雌激素狀態(tài)，POI已成為影響女性生殖健康和社會(huì)穩(wěn)定性的不可忽視的因素，因此對(duì)POI的病因?qū)W和診療的研究日益受到重視。POI的病因和病理機(jī)制尚不明確，自身免疫、遺傳、環(huán)境、藥物和應(yīng)激因素等都可能引起卵巢功能的減退。目前臨床缺乏療效確切的藥物，原因之一就在于建立適宜的POI動(dòng)物模型存在一定的困難。目前POI的動(dòng)物模型的制備主要依據(jù)不同的發(fā)病機(jī)制，有化療藥物造模法、半乳糖代謝造模法、化學(xué)損傷物質(zhì)造模法、基因敲除造模法等[2]，本文針對(duì)目前常用的三種造模方法：雷公藤造模法、化學(xué)物質(zhì)二氧化乙烯基環(huán)己烯(4-vinylcyclohexenediepoxide，VCD)造模法、半乳糖代謝造模法進(jìn)行對(duì)比性研究，力求找到更理想的POI動(dòng)物模型，為臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性ICR小鼠100只，8周齡，體重(28±3)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0011】，飼養(yǎng)和取材均于北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)內(nèi)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行【SYXK (京) 2015-0001】，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：17-23)。小鼠分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室溫度(20±4)℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照和黑暗12 h更替，自由進(jìn)食及飲水。

1.1.2 試劑與儀器

雷公藤多苷片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)，20160502)，二氧化乙烯環(huán)己烯(Sigma，BCBV1352，美國(guó))。芝麻油(Spectrum，2GC0155，美國(guó))。D-(+)-半乳糖(Sigma，WXBC4726 V，美國(guó))。血清促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(北京易科拜德科技有限公司)。本實(shí)驗(yàn)所及儀器均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，每日早8:00起對(duì)小鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，連續(xù)10 d光鏡下觀察，篩選出有規(guī)律動(dòng)情周期的健康雌性小鼠96只進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、雷公藤多苷片組(tripterygium glycosides, TG)、VCD組和半乳糖組(D-(+)-galactose, D-gal)，每組24只。干預(yù)當(dāng)天設(shè)為0 d，干預(yù)后第16、46和76天處死隨機(jī)處死各組8只小鼠，分別設(shè)為各組的I、II和III亞組。取血并處死，取小鼠雙側(cè)子宮和卵巢，生理鹽水清洗后擦干，稱重，分組置于4%多聚甲醛中固定。

1.2.2 POI模型的建立

TG組以雷公藤多苷片混懸液按50 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)15 d。VCD組以VCD溶液按160 mg/(kg·d)劑量腹腔注射，連續(xù)15 d。半乳糖組以半乳糖溶液按500 mg/(kg·d)劑量頸背部皮下注射，連續(xù)75 d。

1.2.3 觀測(cè)指標(biāo)

(一)造模前后一般情況觀察

觀察并記錄動(dòng)物皮毛、活動(dòng)情況、進(jìn)食、大小便和體重等改變，若有動(dòng)物死亡，記錄死亡數(shù)量及原因。

(二)動(dòng)情周期觀察

自干預(yù)日起，各組小鼠每日8:00起進(jìn)行陰道涂片，觀察動(dòng)情周期。取細(xì)棉簽蘸取0.9%生理鹽水后，在小鼠陰道內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)一周，在玻片上輕輕滾動(dòng)，使分泌物均勻地涂布于玻片上，于光學(xué)顯微鏡下直接觀察小鼠動(dòng)情周期變化。觀察標(biāo)準(zhǔn)：①動(dòng)情前期：橢圓形有核上皮細(xì)胞占大多數(shù)，偶有少量角化細(xì)胞和白細(xì)胞；②動(dòng)情期：片狀無(wú)核角化上皮細(xì)胞占絕大多數(shù)或間有少量有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞；③動(dòng)情后期：白細(xì)胞、片狀角化上皮細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞均有，且比例無(wú)明顯差異；④動(dòng)情間期：有大量白細(xì)胞及少量粘液[3]。

(三)血清性激素水平

血液標(biāo)本于血清管(VACUETTE，#D1703343)中靜置1 h后，以4200 r/min離心15 min，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒操作，ELISA法測(cè)定血清FSH、LH、E2、AMH水平。

(四)子宮、卵巢指數(shù)測(cè)定

取雙側(cè)子宮和卵巢，剔除脂肪組織后稱重，按以下公式計(jì)算子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)：卵巢指數(shù)=卵巢濕重(mg)/體重(g)×100%；子宮指數(shù)=子宮濕重(mg)/體重(g)×100%。

(五)卵巢、子宮組織學(xué)觀察

稱重后將卵巢、子宮分組浸入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟切片與HE染色，在光學(xué)顯微鏡下閱片，計(jì)數(shù)卵巢中各級(jí)卵泡和黃體的數(shù)量，測(cè)量子宮內(nèi)膜和子宮肌壁厚度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

各造模組小鼠在干預(yù)期間均出現(xiàn)不同程度的一過(guò)性活動(dòng)減少、攝食減少、皮毛光澤度下降等變化，體重?zé)o明顯下降；干預(yù)結(jié)束后，雷公藤組小鼠活動(dòng)和攝食逐漸恢復(fù)，皮毛光澤度亦于第46天時(shí)恢復(fù)正常，VCD組小鼠皮毛光澤度仍較差。對(duì)照組小鼠食欲、皮毛、活動(dòng)度等均較干預(yù)前無(wú)明顯變化。

2.2 小鼠動(dòng)情周期變化

對(duì)照組小鼠均有規(guī)律的動(dòng)情周期，表現(xiàn)為6～7 d出現(xiàn)一次規(guī)律動(dòng)情周期。干預(yù)當(dāng)天記為0 d，與每組結(jié)果比較。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠動(dòng)情周期紊亂比例(%)Figure 1 Ratio of disordered estrous cycle(%)

2.3 血清性激素水平變化

干預(yù)后第16天，各組E2值較對(duì)照組均下降，有十分顯著性差異(P<0.01)，雷公藤組和VCD組AMH均明顯下降，VCD組FSH值及FSH/LH比值升高半乳糖組AMH值降低，差異均有顯著性(P<0.05)。第46天，雷公藤組、VCD組E2值較對(duì)照組仍明顯降低，差異有顯著性(P<0.05)；VCD組AMH值較第16天及同期對(duì)照組降低，差異有顯著性(P<0.05)；半乳糖組與同期對(duì)照組相比，E2值降低，差異十分顯著(P<0.01)，AMH值明顯降低(P<0.05)。第76天，雷公藤組E2值較對(duì)照組仍降低(P<0.05)，其余各值均無(wú)顯著差異；VCD組AMH、LH、E2值較對(duì)照組降低，F(xiàn)SH/LH比值升高，均有顯著性差異(P<0.05)；半乳糖組AMH、E2值較對(duì)照組降低，有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。雷公藤組小鼠AMH值在第76天時(shí)較第16天時(shí)顯著升高(P<0.01)，VCD組和半乳糖組小鼠E2水平持續(xù)性降低，較前有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.4 卵巢、子宮濕重指數(shù)

小鼠給藥前稱重，各組小鼠體重差異無(wú)顯著性。第16天，雷公藤組小鼠體重明顯減輕， VCD組卵巢濕重、卵巢指數(shù)均明顯減少，半乳糖組卵巢指數(shù)明顯減少，差異均有顯著性(P<0.05)；第46天，半乳糖組卵巢濕重、卵巢指數(shù)均較同期空白對(duì)照組明顯減少，差異有顯著性(P<0.05)。第76天各組卵巢指數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。各組子宮指數(shù)與同期空白對(duì)照組相比均未產(chǎn)生顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 卵巢與子宮組織結(jié)構(gòu)變化

2.5.1 卵泡計(jì)數(shù)及子宮厚度測(cè)量

第16天，雷公藤組發(fā)育中卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度較對(duì)照組減少，VCD組子宮肌壁厚度明顯減小，半乳糖組子宮內(nèi)膜厚度明顯減小，差異均有顯著性(P<0.05，P<0.01)；第46天，雷公藤組、VCD組、半乳糖組發(fā)育中卵泡數(shù)、黃體數(shù)較對(duì)照組明顯減少，差異有顯著性(P<0.01，P<0.05)；第76天，VCD組成熟卵泡數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、子宮肌壁厚度較對(duì)照組均明顯減小，半乳糖組子宮內(nèi)膜厚度明顯減小，差異均有顯著性，(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：與同期空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與同期空白對(duì)照組相比，**P<0.01；與同組第16天相比，#P<0.05；與同組第16天比較，##P<0.01。圖2 三種早發(fā)性卵巢功能不全小鼠模型的血清性激素比較Note. Compared with the control group at the same period, *P<0.05. Compared with the control group at the same period, **P<0.01. Compared with the same treatment group at day 16, #P <0.05. Compared with the same treatment group at day 16, ##P <0.01.Figure 2 Comparison of the changes of serum hormone levels in the three POI mouse models with premature ovarian dysfunction

表1 三種POI小鼠模型的體重和卵巢、子宮指數(shù)變化Table 1 Changes of ovarian and uterine indexes in the three mouse models of premature ovarian dysfunction s)

注：與同期對(duì)照組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the control group at the same period，*P<0.05.

注：與同期空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與同期空白對(duì)照組相比，**P<0.01；與同組第16天相比，#P<0.05； 與同組第16天比較，##P<0.01。圖3 三種早發(fā)性卵巢功能不全小鼠模型的卵泡計(jì)數(shù)及子宮厚度測(cè)量Note. Compared with the control group at the same period, *P<0.05. Compared with the control group at the same period, **P<0.01. Compared with the same treatment group at day 16, #P<0.05. Compared with the same treatment group at day 16, ##P<0.01.Figure 3 Ovarian follicle counts and uterine wall thickness measurements in the three mouse POI models

2.5.2 卵巢、子宮形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組小鼠卵巢表現(xiàn)為體積大，皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)各階段的卵泡，包括發(fā)育中的卵泡(初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡)、成熟卵泡和黃體相間分布，在位子宮內(nèi)膜無(wú)明顯增厚或變薄，腺體無(wú)擴(kuò)張或萎縮。與對(duì)照組相比，雷公藤組第16天和第46天各級(jí)卵泡及黃體所占比例下降，子宮內(nèi)膜變薄，腺體萎縮，但這一現(xiàn)象在第76天時(shí)較前恢復(fù)；VCD組發(fā)育中的卵泡和黃體所占比例明顯下降，腺體和間質(zhì)萎縮，子宮內(nèi)膜上皮呈低柱狀或立方狀，子宮內(nèi)膜和子宮肌壁變薄，并與時(shí)間呈反比；半乳糖組發(fā)育中的卵泡和黃體所占比例逐漸下降，子宮內(nèi)膜厚度變薄。結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

3 討論

疾病動(dòng)物模型的最終目的在于能夠解析疾病發(fā)生的生理病理機(jī)制和服務(wù)于疾病預(yù)防和治療藥物的研發(fā)兩個(gè)方面[4]。然而POI的發(fā)病機(jī)制尚不明確，制備理想的動(dòng)物模型有很多難點(diǎn)，包括致病途徑及過(guò)程與人類(lèi)相似，患病后的病理結(jié)果與人類(lèi)一致，模型的自我修復(fù)可能，是否具有可重復(fù)性等。根據(jù)病因的不同，目前有多種方式可以造成POI的動(dòng)物模型，如雷公藤多苷片造模法、半乳糖代謝造模法、環(huán)境化學(xué)物質(zhì)造模法、化療藥物造模法等[5]。

本文選取了目前應(yīng)用較多也較具代表性的雷公藤多苷片灌胃造模法、VCD溶液腹腔注射造模法和半乳糖溶液皮下注射造模法進(jìn)入研究，主要針對(duì)藥物性、環(huán)境性和代謝性POI作為研究對(duì)象。雷公藤多苷提取自傳統(tǒng)中藥雷公藤，臨床發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷會(huì)導(dǎo)致卵巢功能減退和衰竭，高慧等[6]用雷公藤多苷片給12周齡SD大鼠連續(xù)灌胃14 d后，建立較為理想的POI動(dòng)物模型，然而梁爽等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤致POI動(dòng)物模型中，停藥10 d后，卵巢功能可自然修復(fù)。半乳糖血證與POI發(fā)病相關(guān)，由于半乳糖在體內(nèi)堆積可導(dǎo)致卵母細(xì)胞的過(guò)早耗竭，女性卵巢功能對(duì)半乳糖血證異常敏感[8]，患半乳糖血證的婦女POI的發(fā)病率很高[9]。Bandyopadhyay等[10]通過(guò)給懷孕雌鼠飼料中添加半乳糖成功建立POI動(dòng)物模型。然而半乳糖血證導(dǎo)致的POI臨床病例很少，缺乏實(shí)際研究意義。工業(yè)化學(xué)品VCD是制造殺蟲(chóng)劑、滅火劑、橡膠、塑料等的副產(chǎn)品[11]，可以選擇性地?fù)p傷雌鼠和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物卵巢儲(chǔ)備池中的原始卵泡及初級(jí)卵泡，加速卵泡凋亡，誘導(dǎo)卵巢功能逐步衰竭[12-13]，可較好地模擬自然狀態(tài)下卵巢功能衰竭的進(jìn)程[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道，連續(xù)腹腔注射160 mg/(kg·d)VCD 15 d，待停止注射后(70±5)d時(shí)，嚙齒類(lèi)動(dòng)物的卵巢接近POI的臨床特征[12, 15]。

圖4 各組卵巢病理圖片(HE染色)Figure 4 Pathological changes of the mouse ovarian tissues(HE staining)

圖5 各組子宮病理圖片F(xiàn)igure 5 Pathological changes of mouse uterine tissues(HE staining)

本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤組小鼠在第16天時(shí)出現(xiàn)體重減輕，多數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂，AMH和E2值顯著降低，發(fā)育中卵泡數(shù)和成熟卵泡數(shù)減少，子宮內(nèi)膜變薄，提示雷公藤多苷片造模法15 d確可造成小鼠卵巢功能的減退。第46天時(shí)小鼠體重恢復(fù)，E2值仍降低，發(fā)育中卵泡數(shù)和黃體數(shù)顯著減少，提示停藥1個(gè)月后，雷公藤多苷片對(duì)卵巢功能的損害仍然存在。但第46天時(shí)，除E2值仍持續(xù)偏低外，雷公藤組小鼠體重、血清性激素值及卵巢、子宮組織結(jié)構(gòu)均與同期空白對(duì)照組無(wú)顯著差異，表明雷公藤混懸液灌胃15 d即能造成小鼠生殖功能的損傷，出現(xiàn)體重下降、動(dòng)情周期紊亂、卵巢組織病理學(xué)變化等現(xiàn)象，但停藥1～2個(gè)月左右，小鼠動(dòng)情周期即逐漸恢復(fù)，其他各指標(biāo)逐漸恢復(fù)到正常水平，這與文獻(xiàn)表述一致[7]。由此說(shuō)明采用雷公藤多苷造模研究治療POI藥效學(xué)方法尚需要探討。

半乳糖組小鼠在第16天時(shí)出現(xiàn)卵巢指數(shù)減低，AMH和E2值均減低，子宮內(nèi)膜厚度減小，提示半乳糖造模法確實(shí)能夠?qū)β殉补δ茉斐蓳p害，第46天時(shí)E2仍持續(xù)減低，發(fā)育中的卵泡數(shù)、黃體數(shù)減低，提示給藥46 d后，卵巢功能仍處于損害中。第76天時(shí)AMH和E2值減低，子宮內(nèi)膜厚度減小，半數(shù)以上動(dòng)物出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂，提示給藥75 d后卵巢功能仍在逐步下降，表明半乳糖造模法也是制備POI小鼠模型的較理想造模方法。但與VCD造模相比，半乳糖制造POI模型具有造模時(shí)間長(zhǎng)，成模率不高(62.5%)等缺點(diǎn)，其造模方法仍需商榷。

VCD組小鼠在第16天時(shí)出現(xiàn)卵巢濕重及卵巢指數(shù)減低，AMH和E2值顯著降低減低，F(xiàn)SH值和FSH/LH升高，提示VCD造模法給藥15 d后，已經(jīng)對(duì)卵巢功能造成了損害，但尚未引起動(dòng)情周期紊亂等表現(xiàn)。第46天時(shí)小鼠體重、血清性激素與前無(wú)差異，發(fā)育中的卵泡數(shù)和黃體數(shù)較前進(jìn)一步減少，提示停藥1個(gè)月后，VCD對(duì)卵巢功能的損害持續(xù)存在。第76天時(shí)小鼠AMH、LH、E2仍明顯降低，F(xiàn)SH/LH比值升高，絕大多數(shù)小鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂，發(fā)育中卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)均減少，子宮內(nèi)膜和子宮肌壁厚度均減小，提示停藥2個(gè)月后，VCD對(duì)卵巢功能仍產(chǎn)生持久損害，引起POI的臨床征象，且這種影響并未發(fā)現(xiàn)自然修復(fù)，可能對(duì)卵巢功能造成不可逆的損傷，表明VCD造模法效果確切，是制備POI小鼠模型的良好造模方法。

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine-disrupting chemicals, EDCs)可影響機(jī)體的激素分泌，長(zhǎng)期暴露于EDCs可引起青春期提前、生育力降低、妊娠期并發(fā)癥發(fā)生率增加及絕經(jīng)期提前等[16-17]，是誘發(fā)女性POI的因素之一[18]。VCD是VCH(4-vinylcyclohexene)的代謝產(chǎn)物，VCH產(chǎn)生于香煙、礦物或塑料燃燒氧化過(guò)程中，可由吸煙、接觸農(nóng)藥等方式進(jìn)入人體，是誘發(fā)POI的重要因素之一[19-20]。良好的POI模型應(yīng)包含以下幾個(gè)因素：(1)動(dòng)情周期的改變；(2)血清雌激素明顯降低；(3)卵泡數(shù)顯著減少；(4)生育試驗(yàn)證實(shí)產(chǎn)仔數(shù)明顯減少[21]。綜上可見(jiàn)，VCD溶液腹腔注射法致POI造模法致病途徑及過(guò)程與人類(lèi)相似，動(dòng)物卵巢和子宮病理結(jié)果與人類(lèi)一致(如卵巢萎縮，各級(jí)卵泡減少，子宮內(nèi)膜和子宮肌壁厚度減小等)，動(dòng)情周期明顯改變，血清雌激素明顯降低，卵泡數(shù)顯著減少，未觀察到自然修復(fù)。因此，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)化學(xué)毒性物質(zhì)VCD能誘導(dǎo)小鼠卵巢功能減退，模擬POI的病理過(guò)程，在三種造模方法中最為優(yōu)選，可作為探討POI發(fā)病機(jī)理和用藥研究的動(dòng)物模型。