李媛媛，周海燕，吳綠英，莫賢煒，李晶

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006)

高尿酸血癥(hyperuricemia)是嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少，致血液中尿酸濃度不正常升高的現(xiàn)象，一般認(rèn)為人類體內(nèi)血尿酸鹽達(dá)到416 μmol/L時(shí)應(yīng)考慮高尿酸血癥[1]。高尿酸血癥為嘌呤代謝紊亂性疾病[2-3]，過量糖、脂肪、蛋白質(zhì)、鹽的攝入及大量飲酒與患病率增加有重要關(guān)系。

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，高尿酸血癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡呈現(xiàn)低齡化[4]。一些研究結(jié)果表明，血尿酸升高與腎疾病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化程度、腦卒中、心血管事件的發(fā)生率和死亡率等呈獨(dú)立正相關(guān)，同時(shí)，一些心血管病患者的尿酸也隨著病情的發(fā)展相應(yīng)增加[5-6]。有學(xué)者對(duì)西班牙1564名健康男性進(jìn)行研究，多因素回歸分析結(jié)果顯示，高尿酸血癥與血糖、肥胖明顯相關(guān)，比值分別為2.69和2.5[7]。目前國內(nèi)外已經(jīng)有許多學(xué)者進(jìn)行高尿酸血癥動(dòng)物模型的造模研究，但有關(guān)高尿酸血癥是否影響心血管系統(tǒng)并進(jìn)而引發(fā)繼發(fā)性病變的造模研究尚少。

本文采用氧嗪酸鉀聯(lián)合高糖高脂飼料及氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母膏飼料進(jìn)行造模，通過血清尿酸(uric acid，UA)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐酸(creatinine，Cr)水平的檢測(cè)來考察與評(píng)價(jià)其建立持續(xù)、穩(wěn)定的大鼠高尿酸實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的可行性，并同時(shí)采用胰島素(insulin，INS)，血糖(glucose，GLU)，甘油三酯(triglyceride，TG)，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein chesterol，LDL-C)等指標(biāo)來比較不同高尿酸血癥造模法對(duì)心血管的繼發(fā)性損害的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，7～9周齡，體重(180±20)g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2013-0034】。動(dòng)物模型的指標(biāo)及標(biāo)本的采集均在廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)鼠類實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK(粵)2017-0125】，且經(jīng)廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審批(受理編號(hào)：SPF2017097)。標(biāo)準(zhǔn)鼠籠飼養(yǎng)溫度20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

普通飼料由廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，高糖高脂飼料(63.0%大小鼠維持飼料、20.0%蔗糖、15.0%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等)購自南通特洛菲飼料科技有限公司，酵母菌飼料為酵母膏按照1∶4均勻拌入粉碎的普通飼料中混勻而成，壓制成顆粒，輻射滅菌，由南通特洛菲飼料科技有限公司制作。

1.1.2 試劑與儀器

酵母膏購自北京奧博星生物科技有限公司，氧嗪酸鉀購自上海源葉生物科技有限公司。UA、Cr、BUN、GLU、INS等指標(biāo)均由廣州市第十二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測(cè)(UA、Cr、BUN、GLU：全自動(dòng)生化分析儀，西門子ADVIA2400；INS：羅氏電發(fā)光分析儀，COBAS602)；大鼠心臟、腎、肝等組織委托武漢賽維爾生物科技公司進(jìn)行HE染色。

1.2 方法

將32只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組(Group C)，氧嗪酸鉀模型組(Group M1)，氧嗪酸鉀聯(lián)合高糖高脂飼料模型組(Group M2)，氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母膏飼料模型組(Group M3)，每組8只，連續(xù)造模3周。三個(gè)模型組每日按照750 mg/kg體重給予氧嗪酸鉀灌胃，C組按同體積溶媒(0.5% CMC-Na)灌胃。同時(shí)，C組及M1組給予普通飼料喂養(yǎng)，M2組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，M3組給予酵母膏飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)連續(xù)21 d。每7天大鼠禁食不禁水12 h，經(jīng)乙醚麻醉后進(jìn)行眼內(nèi)眥取血2 mL，室溫靜置2 h后離心分離(4000 r/min，10 min，4℃)，取上層血清-80℃保存待測(cè)。第21天實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食不禁水12 h后，各組大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h后離心分離(4000 r/min，10 min，4℃)，取上層血清-80℃保存待測(cè)。取血后，立即取大鼠心臟、腎、肝置于福爾馬林杯，加入4%甲醛溶液浸泡，待測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

4組大鼠實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(第0天)體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第10天開始，M3組動(dòng)物毛發(fā)光滑性較其他三組較差，且糞便明顯增多(更換墊料次數(shù)增多)，并伴有刺鼻的酸臭味，同時(shí)各模型組大鼠均有表現(xiàn)精神萎靡，食欲不振，且敏感易怒。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期里，4組大鼠體重同步增加，組間無明顯差異(P>0.05，表1)。

2.2 UA、BUN及Cr的變化情況

如表2所示，與正常對(duì)照組相比，其他三組自實(shí)驗(yàn)第7天測(cè)得的血尿酸水平較正常組明顯升高，提示本實(shí)驗(yàn)采用的氧嗪酸鉀灌胃法造模成功(P<0.05)。此外，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，造模組的血尿酸水平持續(xù)升高，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(第21天)，所有造模組的血尿酸水平較正常組提高約2倍，且模型三組組間比較無顯著性差異。但造模三組大鼠的Cr及BUN在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中均未表現(xiàn)出較正常對(duì)照組的明顯改變(P>0.05，見表3，4)。

2.3 血糖血脂相關(guān)血清指標(biāo)的變化

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)日取血測(cè)定大鼠的GLU、INS、TG及LDL-C水平，結(jié)果如表5所示。與正常組相比，雖無顯著性差異，但造模三組均表現(xiàn)出不同程度的GLU水平升高和相應(yīng)的INS水平降低趨勢(shì)，其中M2和M3組的INS水平與C組相比有明顯差異(P<0.05)，而三個(gè)模型組之間無顯著性差異；與正常組相比，造模三組均表現(xiàn)出不同程度的TG水平提高，其中M2組的差異最具顯著性(P<0.01)，M3組的TG水平明顯高于M1組，但在本實(shí)驗(yàn)中，僅有M2組能觀察到LDL-C水平的明顯升高(P<0.01)。其他三組兩兩相比均無顯著性差異。

表1 4組大鼠不同時(shí)間體重的變化Table 1 Changes in body weight of the 4 groups of rats at different times ± s, n=8)

表2 4組大鼠不同時(shí)間的尿酸水平Table 2 Uric acid levels of the 4 groups of rats at different times ± s, n=8)

注：和對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group，*P<0.05，**P<0.01.

表3 4組大鼠不同時(shí)間的肌酐酸水平Table 3 Creatinine levels of the 4 groups of rats at different times ± s, n=8)

表4 4組大鼠不同時(shí)間的尿素氮水平Table 4 Blood urea nitrogen levels of the 4 groups of rats at different times ± s, n=8)

組別GroupsGLU(mmol/L)INS(pmol/L)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)C組Group C9.4±0.33.5±0.20.41±0.10.3±0.01M1組Group M110.6±1.42.9±0.40.53±0.10.3±0.05M2組Group M212.2±0.92.7±0.3?0.78±0.2??1.8±0.47??M3組Group M311.8±0.92.8±0.2?0.67±0.2?0.3±0.05

注：和對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group，*P<0.05，**P<0.01.

2.4 腎組織的病理改變

如圖1所示，C組的大鼠組織染色均勻，腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細(xì)胞排列緊密，未見明顯炎癥。造模三組大鼠腎組織皮質(zhì)內(nèi)均有不同程度病理性改變，表現(xiàn)為少量腎小管上皮細(xì)胞脫落，可見腎小管擴(kuò)張。此處挑選出損傷程度較嚴(yán)重的大鼠腎切片進(jìn)行展示。

2.5 肝組織的病理改變

如圖2所示，C組肝索結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富、形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝竇未見明顯擴(kuò)張或擠壓，未見明顯炎癥。與C組相比，M1組和M3組無顯著性區(qū)別，仍表現(xiàn)為正常態(tài)的肝組織結(jié)構(gòu)。但M2組大鼠肝組織發(fā)生較明顯病變，表現(xiàn)為中央靜脈周圍可見少量肝細(xì)胞脂肪變性，胞質(zhì)中可見大小不一的圓形空泡，肝竇變窄，肝細(xì)胞索不明顯。

2.6 心臟組織的病理改變

如圖3所示，C組、M1組及M2組的心臟組織形態(tài)組織染色均勻，心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列規(guī)則、分界清晰，間質(zhì)未見明顯異常，未見明顯炎癥。而3/8的M3組大鼠的心臟組織發(fā)生病變，表現(xiàn)在可見少量心肌纖維水腫，胞質(zhì)疏松淡染，此處挑選病變程度最為嚴(yán)重的M3組大鼠進(jìn)行展示。

3 討論

高尿酸血癥的發(fā)生，主要由于尿酸生成增多或排泄較少所致，所以復(fù)制動(dòng)物模型，應(yīng)該主要從這兩個(gè)途徑入手。氧嗪酸鉀是一種尿酸酶抑制劑，作為化學(xué)誘導(dǎo)劑可以抑制尿酸分解，加強(qiáng)血清中尿酸水平，造成高尿酸血癥動(dòng)物模型[8-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道[10]，腹腔注射氧嗪酸鉀會(huì)使大鼠長期處于應(yīng)激狀

注：黑色箭頭標(biāo)示腎小管及其上皮細(xì)胞病變部位。圖1 各組大鼠腎組織病理染色示意圖(HE 染色)Note. The black arrows point to the renal tubules and their epithelial cell lesions.Figure 1 Comparison of the pathological changes of renal tissues in each group of rats (HE staining)

注：黑色箭頭標(biāo)示肝細(xì)胞脂肪病變部位。圖2 各組大鼠肝組織病理染色示意圖(HE染色)Note. The black arrows point to the hepatocyte lesions.Figure 2 Comparison of the pathological changes of liver tissues in each group of the rats (HE staining)

注：黑色箭頭標(biāo)示心肌纖維病變部位。圖3 各組大鼠心臟組織病理HE染色示意圖(HE染色)Note. The black arrow points to the myocardial fiber lesion.Figure 3 Comparison of the pathological changes of heart tissues in each group of the rats (HE staining)

態(tài)下，且易造成腹腔積水、腹膜硬化等不良后果，有悖于動(dòng)物倫理，而飼喂法相對(duì)穩(wěn)定性欠佳；氧嗪酸鉀灌胃法穩(wěn)定性較好，可用于制作長期高尿酸血癥大鼠模型。故本次實(shí)驗(yàn)，筆者采用氧嗪酸鉀灌胃法。而酵母膏無毒，屬于高嘌呤類食物，酵母在體內(nèi)充分水解產(chǎn)生含氮的有機(jī)堿(包括嘌呤堿類、嘧啶堿類等)，引起嘌呤代謝紊亂，使尿酸增多[11]。

有研究表明，高尿酸血癥與高血糖、高血脂等心血管疾病的發(fā)生是呈顯著的正相關(guān)[12-13]，有部分學(xué)者已成功復(fù)制高尿酸血癥模型，并且對(duì)高尿酸血癥與心血管病變之間的關(guān)系進(jìn)行系列研究[14-15]。

經(jīng)過查閱文獻(xiàn)[16-17]，筆者決定采用氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母膏建立高尿酸血癥模型，同時(shí)研究大鼠是否伴隨著產(chǎn)生心血管病變。采用酵母膏飼料可模擬人服用高嘌呤類食物時(shí)引起嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致尿酸升高，同時(shí)給予氧嗪酸鉀主要是抑制大鼠體內(nèi)的尿酸酶，排除尿酸酶的干擾，二者聯(lián)合造模可以最大程度模擬人類產(chǎn)生高尿酸血癥的病發(fā)原因。由于飼料中含有易被氧化的脂肪成分，因此嚴(yán)格控制大鼠每日給予飼料每只35 g，同時(shí)次日更換新鮮飼料以確保實(shí)驗(yàn)規(guī)范性，在本實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)大鼠死亡現(xiàn)象。由于造模后大鼠會(huì)出現(xiàn)一個(gè)短暫性的尿酸升高隨后降低的現(xiàn)象，為了驗(yàn)證是否出建立一種尿酸值高、維持時(shí)間長、模型穩(wěn)定特點(diǎn)的大鼠模型，因此本實(shí)驗(yàn)采用禁食不禁水12 h后采血。此外，空腹INS水平和血清TG含量等均可作為血糖、血脂代謝指標(biāo)，因此本實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)一在禁食不禁水12 h后采血[18-19]。

本次實(shí)驗(yàn)為每7天進(jìn)行一次大鼠眼內(nèi)眥取血，所得血清量較少，故僅測(cè)定UA、BUN、Cr等三個(gè)指標(biāo)，用于檢測(cè)高尿酸血癥是否造模成功；而實(shí)驗(yàn)最后一天，采用大鼠腹主動(dòng)脈取血，所得血清量較多，因此增加了檢測(cè)的指標(biāo)，比較GLU、INS、TG、LDL-C等水平的差異用于判定大鼠在患有高尿酸血癥的同時(shí)是否伴隨著產(chǎn)生血糖、血脂代謝異常。本實(shí)驗(yàn)三個(gè)模型組都是氧嗪酸鉀灌胃給藥，但給予飼料不同，M1組給予普通飼料，M2組給予高糖高脂飼料，M3組給予酵母膏飼料。通過M1組及M3組可比較氧嗪酸鉀聯(lián)合酵母膏造模相比氧嗪酸鉀單獨(dú)造模的優(yōu)勢(shì)，比較模型三組間的GLU、INS、TG等水平，可檢測(cè)M1組及M3組大鼠是否伴隨著血糖、血脂代謝紊亂。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各模型組的UA水平顯著升高，實(shí)驗(yàn)第7天時(shí)M1及M2組與正常組比較UA明顯升高(P<0.05)，而M3組UA則顯著性地升高(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)第14天時(shí)，M1組與第7天相比，尿酸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，由此可看出受到大鼠體內(nèi)尿酸酶的影響，氧嗪酸鉀單獨(dú)造模表現(xiàn)出模型不穩(wěn)定的現(xiàn)象，而M3組UA則呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢(shì)；實(shí)驗(yàn)第21天時(shí)，各模型組的UA與正常組對(duì)比均顯著性地升高(P<0.01)，但M1組大鼠的UA整體偏差較大，而M3組相對(duì)而言偏差較小，進(jìn)一步說明了氧嗪酸鉀及酵母膏聯(lián)合造?？山⒁环N尿酸升高、維持時(shí)間長、模型穩(wěn)定等特點(diǎn)的大鼠長期高尿酸血癥模型。而在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，各組大鼠的Cr、BUN水平無明顯改變，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道和臨床證據(jù)顯示[20]，UA和Cr、BUN并無明顯相關(guān)性，臨床上有大量高尿酸血癥患者，其Cr和BUN與正常人相當(dāng)。造模三組都表現(xiàn)出GLU水平有不同程度的升高趨勢(shì)，且M3組表現(xiàn)出與M2組相當(dāng)?shù)腎NS水平降低，提示M2與M3組存在血糖代謝紊亂。此外，M2組LDL-C含量顯著地升高，LDL-C的增高不利于脂質(zhì)代謝故引發(fā)M2組TG增高，形成高脂血癥，說明了M2組大鼠通過高脂飲食誘導(dǎo)了高血脂狀態(tài)，而M1組及M3組大鼠沒有明顯的高血脂狀態(tài)，且比較這四組大鼠的肝HE染色結(jié)果，也僅僅有M2組大鼠發(fā)生了明顯的脂肪肝病變現(xiàn)象，進(jìn)一步表明只有M2組大鼠出現(xiàn)了血脂紊亂。

本實(shí)驗(yàn)選擇了氧嗪酸鉀聯(lián)合不同飼料制備大鼠高尿酸血癥模型，與“氧嗪酸鉀+普通飼料”的M1 組相比，“氧嗪酸鉀+高糖高脂飼料”的M2組表現(xiàn)為明確的高尿酸血癥合并血糖血脂代謝紊亂，“氧嗪酸鉀+酵母膏飼料”的M3組表現(xiàn)為明確的高尿酸血癥合并血糖代謝紊亂，且該組部分大鼠的腎、心臟等器官發(fā)生病變，提示該造模方法可用于“尿酸升高-繼發(fā)性血糖紊亂”相關(guān)的心血管疾病的大鼠模型研究，而本組在本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)出血脂異常，可能與實(shí)驗(yàn)周期略短相關(guān)，需要后期進(jìn)一步優(yōu)化與探討。