黃小榮，黃衍恒，葉霖，楊陳，湯濟(jì)鑫，安寧，劉建興，劉華鋒

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病研究所，湛江市慢性腎臟病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524001)

巨噬細(xì)胞屬于單核吞噬細(xì)胞家族成員，既在固有免疫中起重要作用，也可通過(guò)招募其他免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)，進(jìn)而在機(jī)體免疫反應(yīng)、組織損傷和修復(fù)中起關(guān)鍵作用[1]。根據(jù)表型和功能不同，巨噬細(xì)胞可分為不同的亞類(lèi)，一般可分為經(jīng)典活化型M1促炎巨噬細(xì)胞(M1)和替代活化型M2抗炎巨噬細(xì)胞(M2)。M1可大量分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、活性氧簇(ROS)等促炎細(xì)胞因子；而M2則可分泌IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β1等炎癥抑制因子，及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及血小板衍生因子等促纖維化因子[2-3]。幾乎所有類(lèi)型的急性腎損傷和進(jìn)行性慢性腎臟病都可在腎小球及腎間質(zhì)中檢測(cè)到巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[4]，且根據(jù)腎臟微環(huán)境變化，巨噬細(xì)胞可在促炎表型和抗炎促纖維化表型之間進(jìn)行轉(zhuǎn)化[5]，從而在腎小管-間質(zhì)損傷、修復(fù)和纖維化各階段中發(fā)揮著不同作用[4, 6-8]，顯著影響腎小管-間質(zhì)損傷的最終轉(zhuǎn)歸。

近年來(lái)，自噬通路在腎小管-間質(zhì)損傷進(jìn)程中的作用越來(lái)越受關(guān)注；而目前對(duì)自噬的研究主要集中在TECs上[9-10]，免疫細(xì)胞自噬在腎臟疾病的作用研究尚涉及甚少?，F(xiàn)研究認(rèn)為，自噬可影響免疫細(xì)胞的增殖、凋亡、遷徙、分化、活化以及炎癥因子分泌[11]。有研究表明在眼色素層炎[12]、高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠[13]、半乳糖胺聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷[14]等諸多炎癥模型中，特異性阻斷巨噬細(xì)胞自噬通路，可引起巨噬細(xì)胞炎癥體降解受阻而分泌大量炎癥因子IL-1阻和IL-18，加劇疾病相關(guān)器官的炎癥反應(yīng)及損傷嚴(yán)重程度[12]。因此巨噬細(xì)胞自噬很可能參與調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)，影響疾病進(jìn)展。然而在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，自噬如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能，進(jìn)而影響腎臟疾病進(jìn)展尚未知曉。

ATG5是自噬通路中的關(guān)鍵蛋白，對(duì)于自噬泡形成及降解是必不可少的[15]。ATG12-ATG/ ATG16復(fù)合物通過(guò)參與LC3-PE偶聯(lián)途徑或直接與膜結(jié)合兩種方式形成自噬體膜[16]；并且ATG5可通過(guò)與自噬體膜上的TECRP結(jié)合，促進(jìn)自噬體與溶酶體融合[17-18]，形成自噬溶酶體，最終降解其所包裹的內(nèi)容物。敲低或敲除ATG5可導(dǎo)致自噬下調(diào)或完全抑制，表明ATG5在自噬通路中起關(guān)鍵作用[19]。因此，巨噬細(xì)胞條件性Atg5基因敲除小鼠模型的構(gòu)建，為在動(dòng)物水平上研究巨噬細(xì)胞自噬在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用是可行且非常必要的。在本實(shí)驗(yàn)中我們將探討最佳繁殖方案、繁育小鼠基因型鑒定及Atg5敲除效果分析，為研究巨噬細(xì)胞自噬在腎臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4月齡SPF級(jí)C57BL/6J-Atg5em2(flox)/SMOC小鼠共6只，雌雄各3只；LysM-Cre JAX stock No. 004781小鼠共4只，雌雄各2只，體重20 ～25 g，購(gòu)于上海南方模式生物科技股份有限公司【SCXK(瀘)2017-0010】，飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(粵)2015-0147】。所有小鼠飼養(yǎng)于12 h/12 h光照/黑暗條件下，自由采食和飲水，所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(GDY1801016)。

1.1.2 試劑與儀器

Premix Tag 2.0 plus(TaKaRa，日本)；BIOWEST AGAROSE，Gel red核酸凝膠染料(聯(lián)碩科技有限公司，中國(guó))；TAE緩沖液(廣州銳科生物有限公司，中國(guó))；雷帕霉素(Sigma，美國(guó))，氯喹(Sigma，美國(guó))，anti-LC3 II antibody(Sigma，美國(guó))；anti-SQSTM1/p62 antibody(MBL，日本)；anti-Atg5 antibody，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(Abcam，英國(guó))；anti-GAPDH antibody(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó))。

凝膠電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))；Azure biosystems c500雙激光近紅外成像分析儀(Azure biosystems，美國(guó))；ProFlexTM3 x 32-well PCR System(Applied Biosystems，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 小鼠尾部組織基因組DNA的提取、擴(kuò)增及鑒定

(1) DNA提?。翰捎脡A裂解法提取鼠尾組織基因組DNA。待新生小鼠達(dá)3～4周齡打耳標(biāo)后，剪取小鼠鼠尾約3 mm，置于1.5 mL EP管中；加入50 mmol/L NaOH溶液90 μL，置恒溫水浴鍋中95℃加熱30 min。待EP管冷卻后，加入1 mol/L Tris溶液(pH 8.0)10 μL充分震蕩混勻，以12 000 r/min離心2 min。取上清置于新1.5 mL EP管中，-20℃保存。

(2) PCR擴(kuò)增：Flox基因的上游引物：5′-TTCAGTGTACCCTGTGTATTGG-3′，下游引物：5′-GGGAAACAGTTGTGTTCTTTGT-3′和Cre基因的上游引物：5′-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3′，下游引物：5′-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3′，5′-TTACAG TCGGCCAGGCTGAC-3′；反應(yīng)體系25 μL；擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。

(3) PCR產(chǎn)物鑒定：PCR產(chǎn)物使用1.5%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察分析條帶位置。瓊脂糖凝膠上的PCR條帶出現(xiàn)與Flox基因、Cre基因PCR產(chǎn)物大小一致的條帶為陽(yáng)性結(jié)果，否則為陰性結(jié)果。

1.2.2 巨噬細(xì)胞Atg5基因敲除效果驗(yàn)證

將已進(jìn)行基因型鑒定的小鼠，進(jìn)行敲除效果鑒定。待小鼠8周齡后，取Atg5+/+小鼠及Atg5-/-小鼠骨髓細(xì)胞，使用M-CSF刺激7 d，誘導(dǎo)為成熟巨噬細(xì)胞，提取其RNA及蛋白質(zhì)。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物序列：5′-TTCAGTGTACCCTGTG TATTGG-3′，下游引物序列：5′-GGGAAACAGTTGTGTTCTTTGT-3′，然后將PCR產(chǎn)物送天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

用RIPA裂解液提取巨噬細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量；按每孔30 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF膜上；20 mL含5%BSA封閉液室溫封閉1 h；分別加入1× PBST稀釋的抗ATG5多克隆抗體(1∶1000)、抗LC3多克隆抗體(1∶1000)、抗P62多克隆抗體(1∶1000)和抗GAPDH單克隆抗體(1∶1000)，4℃孵育過(guò)夜；20 mL 1×PBST緩沖液中洗膜3次，每次5 min；加入1×PBST緩沖液稀釋的二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (1∶1000)，置搖床室溫孵育1 h；20 mL 1×PBST緩沖液中洗膜3次，每次5 min；在Azure biosystems c500雙激光近紅外成像分析儀曝光成像。通過(guò)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白(如LC3 II、p62等)，觀察雷帕霉素(Rapamycin，10 μmol/L)及氯喹(Chloroquine，10 μmol/L)刺激24 h后，是否能夠激活/抑制Atg5-/-小鼠巨噬細(xì)胞自噬，進(jìn)一步確定Atg5-/-小鼠巨噬細(xì)胞自噬功能缺陷。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的繁殖情況

為挑選出最佳繁殖方案，我們?cè)诘玫紽2代小鼠后，采用了2種配種方式進(jìn)行繁殖(圖1)；結(jié)果為若按F2a得到實(shí)驗(yàn)小鼠(Atg5flox/floxCre+/-或Atg5flox/floxCre-/-)共5只，占50%(5/10)，若按F2b得到實(shí)驗(yàn)小鼠(Atg5flox/floxCre+/-或Atg5flox/floxCre-/-)共3只，占25%(3/12)；以上兩種繁育方案的分離比例均符合基本孟德?tīng)栠z傳定律，表明巨噬細(xì)胞條件性敲除Atg5基因后對(duì)小鼠繁殖能力無(wú)明顯影響，且F2代采用F2a繁殖方式，獲得巨噬細(xì)胞條件性敲除Atg5基因小鼠及對(duì)照小鼠的效率更高。

2.2 小鼠基因型鑒定結(jié)果

將鼠尾組織基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增后電泳，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中小鼠Flox基因型鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2A，其中1為Flox/Flox純合小鼠(469 bp)，2、3和5為Flox/- 雜合子(469 bp和411 bp)，4為野生型(411 bp)。Cre基因型鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2B，其中1、2、4、5為Cre+/-(700 bp和350 bp)，3和6為Cre-/-(350 bp)。

注：“→”為F2a繁殖方式，“--→”為F2b繁殖方式。圖1 小鼠繁殖方案Note. “→”is the propagation mode of F2a and “--→”is the propagation mode of F2b.Figure 1 Mice breeding program

注：A為小鼠Flox基因型鑒定結(jié)果，其中1為Flox/Flox純合小鼠，2、3和5為Flox/- 雜合子，4為野生型。B為Cre基因型鑒定結(jié)果，其中1、2、4、5為Cre+/-，3和6為Cre-/-。圖2 部分小鼠基因型PCR鑒定Note: A shows the identification results of Flox genotype in mice, in which 1 is Flox/Flox homozygous mouse, 2, 3 and 5 are Flox/- heterozygotes, and 4 is wild type. B shows the identification result of Cre genotype in mice, in which 1, 2, 4, 5 were Cre+/-, and 3 and 6 were Cre-/-.Figure 2 Results of genotype identification of some mice by PCR

2.3 Atg5基因敲除效果鑒定

分別提取Atg5-/-小鼠和Atg5+/+小鼠骨髓細(xì)胞，誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞；

(1)基因水平敲除效果鑒定：提取該骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示Atg5-/-小鼠編碼區(qū)Exon3(約128 bp)被敲除(圖3A-D)。

(2)蛋白水平敲除效果鑒定：提取兩組小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示：與Atg5+/+小鼠相比，Atg5-/-小鼠 ATG5 蛋白表達(dá)水平明顯減少(圖3E)；且Atg5-/-小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)p62明顯增多，而LC3II明顯減少(圖3F)，提示Atg5-/-小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬水平低下。

(3)功能水平敲除效果鑒定：使用雷帕霉素(Rap)誘導(dǎo)自噬后，Atg5-/-小鼠巨噬細(xì)胞自噬不能恢復(fù)到正常基礎(chǔ)水平，提示Atg5-/-小鼠巨噬細(xì)胞自噬缺陷；綜上，巨噬細(xì)胞條件性Atg5基因敲除小鼠構(gòu)建成功。

注：A、B分別為Atg5-/-(實(shí)驗(yàn)組小鼠)和Atg5+/+(對(duì)照組小鼠)骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞Atg5 mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的測(cè)序結(jié)果。C、D為兩組小鼠Atg5 mRNA改變示意圖。E為兩組小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞ATG5蛋白表達(dá)情況。F為使用雷帕霉素(Rap)和氯喹(CQ)調(diào)控自噬后，兩組小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞對(duì)該調(diào)控的反應(yīng)情況。圖3 Atg5基因敲除效果鑒定Note. A and B are the sequencing results of Atg5-/- (experimental group) and Atg5+/+ (control group), respectively. C and D show the changes of Atg5 mRNA in mice of the two groups. E shows the expression of ATG5 protein in mouse bone marrow derived macrophages in the two groups. F shows the response of bone marrow derived macrophages of mice in the two groups to the regulation of autophagy by rapamycin (Rap) and chloroquine (CQ).Figure 3 Identification of the efficiency of gene Atg5 knockout

3 討論

基因敲除技術(shù)是利用一定的生物技術(shù)手段，使特定的目的基因缺失或者失活，從而排除其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果變得更可靠和直觀?；蚯贸ㄈ硇曰蚯贸皸l件性基因敲除兩種方法，其中全身性基因敲除是指在小鼠所有組織細(xì)胞中，將靶基因敲除掉，從而使靶基因的表達(dá)缺失。本文所提及的基因條件性敲除是利用Cre-Loxp重組系統(tǒng)，將Cre基因插入特定的啟動(dòng)子序列后面，即可人為地控制Cre基因在某些細(xì)胞譜系或者在機(jī)體發(fā)育的特定時(shí)間段亦或在外源性藥物誘導(dǎo)下表達(dá)，表達(dá)的CRE蛋白識(shí)別特定的 DNA 序列 (如 Loxp 位點(diǎn))，并進(jìn)行Loxp 位點(diǎn)之間的靶基因剪切，從而實(shí)現(xiàn)目的基因在特定細(xì)胞類(lèi)型中功能性缺失[20]。本研究中，我們選用了條件性Atg5基因敲除方案，一方面是出于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡目紤]，另一方面也是為了避免全身性敲除Atg5基因?qū)е滦∈笈咛テ谒劳龌虺錾谒劳龅牧觿?shì)[21]，我們引入的LysM-Cre小鼠是將CrecDNA靶向插入其內(nèi)源性M溶菌酶基因座，從而使CRE重組酶特異性表達(dá)在包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的髓樣細(xì)胞中。

由于巨噬細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，而且其基因表達(dá)譜和單核細(xì)胞、粒細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞之間有很大的重疊[22]；因此，一個(gè)完全針對(duì)巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因Cre小鼠在本質(zhì)上是不存在的。目前靶向巨噬細(xì)胞的Cre小鼠主要是基于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，如LysM、CSF1R、CD11b和CX3CR1等。其中Csf1r-Cre小鼠可用于研究巨噬細(xì)胞發(fā)育的命運(yùn)圖譜分析，雖然該轉(zhuǎn)基因小鼠巨噬細(xì)胞基因敲除效率較高，但特異性很低，因Csf1r-Cre可表達(dá)于所有白細(xì)胞[23]。CD11b-Cre小鼠對(duì)巨噬細(xì)胞基因敲除效率較低，而且CD11b-Cre不僅表達(dá)在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，在中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞也具有一定的活性。Cx3cr1-Cre小鼠主要針對(duì)單核/巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，對(duì)中性粒細(xì)胞的影響較小，但其在脾巨噬細(xì)胞以及外周血單核細(xì)胞基因的敲除效率相對(duì)較低[24]。雖然LysM也在大多數(shù)粒細(xì)胞和少數(shù)CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞中表達(dá)，但LysM-Cre小鼠對(duì)成熟巨噬細(xì)胞基因的敲除效率非常高[20]。因此，即使LysM-Cre小鼠對(duì)組織常駐巨噬細(xì)胞基因的敲除效率不高[24]，但其仍是研究巨噬細(xì)胞最常用的工具鼠。

為了研究自噬生物學(xué)功能，目前幾種自噬相關(guān)基因缺失小鼠已被報(bào)道構(gòu)建成功，包括Atg5-/-、Atg7-/-和Beclin1-/-小鼠[21, 25-26]；其中BECLIN 1通過(guò)與VPS34結(jié)合，調(diào)控吞噬泡的形成及成熟；而ATG5是自噬通路的上游蛋白，啟動(dòng)自噬體形成，并與ATG12和ATG16結(jié)合，促進(jìn)LC3與PE結(jié)合，使LC3沉積在自噬體膜上；ATG7是ATG12與ATG5結(jié)合所必需的一種類(lèi)似E1的酶[19]。因此，敲除Atg5、Atg7或者Beclin1都可以達(dá)到自噬抑制的作用。然而B(niǎo)eclin1在細(xì)胞凋亡途徑起到重要的作用，而且Beclin1+/-突變小鼠發(fā)生自發(fā)性腫瘤的幾率較高[26]，所以Beclin1并不是研究自噬的特異基因。雖然有研究表明Atg5或Atg7缺失小鼠的細(xì)胞仍然可以形成自噬體/自噬溶酶體，并在受到一定應(yīng)激時(shí)可進(jìn)行自噬介導(dǎo)的蛋白降解[27]，但由于ATG5不僅參與自噬泡形成，而且通過(guò)與TECRP結(jié)合，促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合[19]，所以Atg5-/-小鼠仍是目前用于研究自噬相關(guān)功能最常用的小鼠。

基因敲除小鼠的靶基因敲除后可能影響小鼠生殖功能[28]，我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明巨噬細(xì)胞條件性敲除Atg5后并不影響小鼠的生殖能力；在本實(shí)驗(yàn)中，我們探討總結(jié)了最佳繁育方案，該繁殖方案可在較短時(shí)間、較高概率獲得實(shí)驗(yàn)所需基因型小鼠，為后續(xù)研究巨噬細(xì)胞自噬在腎臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用提供小鼠數(shù)量保障。

基因型鑒定是進(jìn)行基因敲除小鼠繁育保種的重要環(huán)節(jié)[29]。本研究采用堿裂解法提取鼠尾組織基因組DNA，參照上海南方模式生物科技股份有限公司提供的引物序列，通過(guò)普通的PCR擴(kuò)增凝膠電泳成功鑒定巨噬細(xì)胞條件性Atg5基因敲除小鼠的基因型；與用DNA提取試劑盒提取基因組DNA相比，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，但堿裂解法耗時(shí)更短、費(fèi)用更低(結(jié)果未展示)，說(shuō)明該方法可以作為檢測(cè)巨噬細(xì)胞條件性Atg5基因敲除小鼠的基因型的一種快速可靠方法。

綜上，本研究成功建立了巨噬細(xì)胞條件性Atg5基因敲除小鼠模型且能正常繁殖。該小鼠模型為研究巨噬細(xì)胞自噬(Atg5)在腎臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用機(jī)制提供了可靠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>