馬青雯，楊子彪，錢白萍，吉佳佳，張卜文，黃艾祥，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南大理671002；3.云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南昆明650223）

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）被稱為“二十一世紀(jì)的新型營(yíng)養(yǎng)素”[1]，主要存在于乳及乳制品和反芻動(dòng)物的肉中[2]。隨著人民生活水平的提高和對(duì)優(yōu)質(zhì)不飽和脂肪酸需求的增加，CLA 因其具有抗癌[3]、降脂[4]、抗氧化[5]等眾多生理功能，逐漸成為研究熱點(diǎn)[6]，CLA 在藥物研發(fā)、營(yíng)養(yǎng)保健等行業(yè)都有巨大的研究?jī)r(jià)值。

目前國(guó)內(nèi)外的CLA 保健品均為化學(xué)合成，由于化學(xué)合成過(guò)程中得到較多的副產(chǎn)物，這為CLA 的純化增加了成本[7]。由于微生物合成CLA 可得到更純的CLA異構(gòu)體，且反應(yīng)條件較為溫和，許多研究者將CLA 合成途徑的研究轉(zhuǎn)向微生物合成CLA[6]。Lee 等[8]和劉春曉[9]的結(jié)果表明許多乳酸菌具有產(chǎn)CLA 的能力。本研究通過(guò)篩選云南7 個(gè)地區(qū)的牛乳、水牛乳樣品中分離的40 株乳酸桿菌，得到產(chǎn)CLA 乳酸桿菌，并分析影響菌株產(chǎn)生CLA 的因素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

分離自云南省7 個(gè)地區(qū)的水牛乳、牛乳樣品中的40 株乳酸桿菌由云南省皇氏來(lái)思爾乳業(yè)有限公司提供，具體來(lái)源如表1 所示。

表1 乳酸桿菌來(lái)源及采樣地點(diǎn)Table 1 Lactobacillus collection site

1.1.2 試劑

油酸（97 %）、共軛亞油酸（98 %）、MRS（de man rogosa sharpe）培養(yǎng)基：Sigma 公司；吐溫-80、正己烷：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器設(shè)備如表2 所示。

表2 主要儀器及設(shè)備Table 2 Equipments and instruments in the experiment

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)CLA 乳酸菌的篩選

1.3.1.1 亞油酸和CLA 紫外吸收峰的確定

用正己烷將亞油酸（linoleic acid，LA）和CLA 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至10 μg/mL。以正己烷為參比，利用紫外分光光度法在190 nm～1 100 nm 的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，波長(zhǎng)間隔2 nm 的條件下分別對(duì)LA，CLA 標(biāo)準(zhǔn)品和LA、CLA 混合樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描確定LA 和CLA 吸收峰[10]，探究?jī)煞N物質(zhì)在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)是否存在干擾。

1.3.1.2 CLA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

調(diào)整文獻(xiàn)[11]的方法，準(zhǔn)確稱取2.50 mgCLA 標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL 容量瓶中，用正己烷定容后，分別從中吸取0.25、0.50、0.75、1.25、2.50、3.75、5.00、6.25 mL 溶液于25 mL 容量瓶中，用正己烷定容，即得1、2、3、5、10、15、20、25 μg/mL 的CLA 溶液。以正己烷為參比，在全波長(zhǎng)掃描結(jié)果得到的CLA 最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定不同濃度CLA 溶液的吸光度。以CLA 濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制CLA 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.3 乳化液的制備

調(diào)整文獻(xiàn)[12-13]的方法，將0.10%（吐溫-80/液體培養(yǎng)基）吐溫-80 和0.20%[14]（LA/液體培養(yǎng)基）LA 混合后，加入少量蒸餾水再次混合后在冰水浴下進(jìn)行超聲乳化：超聲功率60 W，超聲工作時(shí)間10 s，間歇時(shí)間15 s，總超聲工作時(shí)間10 min。

1.3.1.4 發(fā)酵

將菌種活化至第三代，鏡檢后按5%[15]的接種量接種于35 mL 添加了0.20%LA 乳化液的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)48 h。

1.3.1.5 脂肪酸的萃取

發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后離心（4 000 r/min，30 min），在文獻(xiàn)[16-17]的基礎(chǔ)上略作調(diào)整：取30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液和30 mL 正己烷加入250 mL 分液漏斗中振蕩萃取，靜置20 min 后再加入30 mL 正己烷進(jìn)行第二次萃取，其他步驟同上，3 次萃取結(jié)束后，待液體靜置分層，棄去下層液體，收集上層有機(jī)相并用少量蒸餾水洗分液漏斗3 次，所得上層正己烷層即為脂肪酸萃取液。加入少量無(wú)水硫酸鈉吸水干燥脂肪酸萃取液，將干燥后的脂肪酸萃取液用0.22 μm 濾膜過(guò)濾后移至50 mL 的容量瓶，并用正己烷定容后進(jìn)行紫外檢測(cè)。以未接種的發(fā)酵液為參比，于CLA 最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定萃取液吸光度。

1.3.2 高產(chǎn)菌株中CLA 主要異構(gòu)體的檢測(cè)

1.3.2.1 脂肪酸的甲酯化

將1.3.1.5 中得到的脂肪酸萃取液蒸餾，將蒸餾后得到的脂肪采用文獻(xiàn)[18]中的方法進(jìn)行甲酯化[6]。甲酯化結(jié)束后加入300 μL 正己烷，振蕩5 min 后加入無(wú)水硫酸鈉干燥，干燥結(jié)束后用0.22 μm 濾膜過(guò)濾后移至10 mL 容量瓶，用正己烷定容后將樣品于4 ℃下保存，備檢。

1.3.2.2 CLA 異構(gòu)體的測(cè)定

以未接種CLA 最高產(chǎn)菌株的發(fā)酵液為對(duì)照組（a），接種CLA 最高產(chǎn)菌株的發(fā)酵液為試驗(yàn)組（b）。調(diào)整GB 5009.168-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定》和文獻(xiàn)[19-20]的方法，利用氣相色譜法分析高產(chǎn)菌株中CLA 的主要異構(gòu)體。色譜柱為熔融石英毛細(xì)管柱（110 mm×0.25 mm×0.2 μm），進(jìn)樣量為1 μL，載氣為氦氣（流速：2.0 mL/min）。將初始溫度調(diào)節(jié)至120 ℃，保持8 min 后以6 ℃/min 的速率升至200 ℃，保持15 min；以4/min 的速率升高溫度，保持10 min，直到溫度升至220 ℃；最后以4 ℃/min 的速度升高溫度并保持5 min，直至溫度升至240 ℃。分流比為50 ∶1。利用面積歸一化法計(jì)算各組分所占比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 LA 和CLA 最大吸收峰

LA 和CLA 標(biāo)準(zhǔn)品全波長(zhǎng)掃描圖如圖1、圖2 所示；圖3 為L(zhǎng)A 和CLA 標(biāo)準(zhǔn)品混合后全波長(zhǎng)掃描圖。

由圖1 可知LA 標(biāo)準(zhǔn)品在208 nm 處有最大收峰，由圖2 可知CLA 標(biāo)準(zhǔn)品在233 nm 處有最大吸收峰，由圖3 可知LA 和CLA 兩種物質(zhì)的最大吸峰不在同一波長(zhǎng)下。由此可知：在233 nm 處LA 不會(huì)對(duì)CLA 的吸收峰造成干擾，后續(xù)試驗(yàn)可采用紫外分光光度法于233 nm 處測(cè)定發(fā)酵液中CLA 的吸光度。

圖1 LA 全波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 LA full wavelength scan

圖2 CLA 全波長(zhǎng)掃描圖Fig.2 CLA full wavelength scan

圖3 混合標(biāo)品全波長(zhǎng)掃描圖Fig.3 Mixed standard full wavelength scan

2.2 CLA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

CLA 在233 nm 處標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖4 所示。

圖4 CLA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Conjugated linoleic acid standard curve

由圖4 可知，在波長(zhǎng)233 nm 處CLA 標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.999 3，線性關(guān)系良好；線性回歸方程為y=0.078 1x-0.050 8，式中：x 為CLA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μg/mL；y 為吸光度。在后續(xù)試驗(yàn)中可使用該方程計(jì)算發(fā)酵液中CLA 的吸光度，從而推算發(fā)酵液中CLA 的含量。

2.3 產(chǎn)CLA 菌株

CLA 產(chǎn)生菌及產(chǎn)量如圖5 所示。

圖5 CLA 產(chǎn)生菌株及產(chǎn)量Fig.5 Transformation generated by the strain

由圖5 可知，分離自牛乳的40 株乳酸菌中有5 株乳酸菌產(chǎn)CLA。M2、M9、M16、M25、M28 產(chǎn)量分別為：25.54、34.56、15.48、20.46、14.79 μg/mL，其中M9 為高產(chǎn)菌株。結(jié)合表1 可知，M2 為植物乳桿菌，M9、M6、M25、M28 為發(fā)酵乳桿菌，故部分植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌均有產(chǎn)生CLA 的能力。M25、M28 均為發(fā)酵乳桿菌，且分離自同一地區(qū)同種樣品，但CLA 產(chǎn)量不同；而與M25、M28 分離自同一地區(qū)同種樣品的其余發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌均不產(chǎn)CLA，由此可得：不是所有的植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌均具有產(chǎn)CLA 的能力，且分離自同種樣品的同種菌產(chǎn)CLA 的能力也不同。分離自不同地區(qū)牛乳中的M9（發(fā)酵乳桿菌）、M16（發(fā)酵乳桿菌）CLA 產(chǎn)量也不同，Hosseini 等[21]、Liu 等[22]在研究中指出CLA 產(chǎn)量的差異與菌種的來(lái)源、生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)；此外CLA 產(chǎn)量差異還與菌種基因結(jié)構(gòu)有關(guān)，因?yàn)榛蚪Y(jié)構(gòu)的差異影響菌種代謝[23-24]。5 株CLA 產(chǎn)生菌來(lái)自4 個(gè)不同的地區(qū)，各地區(qū)海拔、溫度、濕度等[25]均存在差異，而相同的菌種自身的基因結(jié)構(gòu)等也存在差異，一些菌株可能因基因片段插入[26]、環(huán)境誘變[27]等因素的影響進(jìn)而導(dǎo)致CLA 異構(gòu)酶[28]編碼基因產(chǎn)生差異，從而造成菌株代謝差異。

2.4 高產(chǎn)菌株中CLA 主要異構(gòu)體

標(biāo)準(zhǔn)品氣相譜圖如圖6 所示，對(duì)照組（a）色譜圖如圖7 所示，試驗(yàn)組（b）色譜圖如圖8 所示，試驗(yàn)組和對(duì)照組的各組分占比如表3 所示。

由圖6 可得，C18 ∶1（油酸）保留時(shí)間為32.04 min、C18 ∶2（亞油酸）保留時(shí)間為34.31 min，C18 ∶2 9c，11t（CLA 異構(gòu)體）保留時(shí)間為39.00 min。由圖7 可得未接種的發(fā)酵液中主要含有油酸和亞油酸兩種物質(zhì)，其中油酸和亞油酸所占比例分別為：6.17 %、93.83 %（表3）。由M9 的色譜圖（圖8）可知：發(fā)酵產(chǎn)物主要含有：油酸，亞油酸和C18 ∶2 9c，11t，三者所占比例分別為：4.85 %、93.43%、1.71%。M9 發(fā)酵液與空白相比，M9發(fā)酵液中亞油酸和油酸的占比均降低，而有9c，11t-CLA 產(chǎn)生，這驗(yàn)證了Dipasquale 等[29]提出的：油酸和亞油酸可能是菌株產(chǎn)生CLA 的底物，因?yàn)閬営退?、油酸?c，11t-CLA 均為18 碳酸，在菌株內(nèi)的共軛亞油酸異構(gòu)酶的作用下，可將碳元素含量相同的亞油酸、油酸異構(gòu)為9c，11t-CLA。值得注意的是9c，11t-CLA 是CLA 主要的活性成分之一[30]，利用此菌株作為媒介進(jìn)而發(fā)酵產(chǎn)生CLA 有很高的應(yīng)用價(jià)值。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.6 Standard chromatograms

圖7 對(duì)照組色譜圖Fig.7 Control group chromatogram

圖8 試驗(yàn)組色譜圖Fig.8 Experimental group chromatogram

表3 試驗(yàn)組和對(duì)照組的各組分占比表Table 3 Comparison of the components of the experimental group and the control group

3 結(jié)論

從奶牛中分離鑒定得到的部分乳酸桿菌具有產(chǎn)CLA 的能力，不同的菌產(chǎn)CLA 的能力不同。高產(chǎn)菌株M9 中CLA 的異構(gòu)體主要為9c，11t-CLA，與對(duì)照組相比，油酸、亞油酸和C18：2 9c，11t 的含量變化證明油酸、亞油酸是M9 生成C18：2 9c，11t 的底物。由于C18：2 9c，11t 是CLA 的主要功能活性物質(zhì)之一，在今后的研究中可通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件提高M(jìn)9 中CLA 產(chǎn)量，從而得到含量更高、更純的C18：2 9c，11t。