高世武 傅志偉 陳 云 林兆里 許莉萍 郭晉隆,

甘蔗熱帶種金屬硫蛋白家族基因的克隆及響應重金屬脅迫的表達分析

高世武1傅志偉1陳 云1林兆里2許莉萍1郭晉隆1,*

1福建農(nóng)林大學 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室, 福建福州 350002;2福建農(nóng)林大學 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘蔗及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心, 福建福州 350002

金屬硫蛋白是一類富含巰基的低分子量蛋白, 在植物的重金屬解毒及細胞氧化還原調(diào)控等方面起重要的作用。本研究以甘蔗熱帶種Badila組培苗為材料, 分別測定了其在CdCl2、ZnSO4和CuCl2水溶液培養(yǎng)條件下地上部和地下部的重金屬含量, 結(jié)果顯示其對上述3種重金屬有較強的耐受與富集能力。繼而克隆了1 (登錄號為KJ504373)、2-1-5 (登錄號為MH191346)和3 (登錄號為KJ5043704) 3個金屬硫蛋白家族基因, 它們分別屬于植物MT亞家族中的MT1、MT2和MT3型基因。1含有1個內(nèi)含子和2個外顯子, 開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)長228 bp, 編碼75個氨基酸;2-1-5含有2個內(nèi)含子和3個外顯子, ORF長246 bp, 編碼81個氨基酸;3含有1個內(nèi)含子和2個外顯子, ORF長198 bp, 編碼65個氨基酸。RT-qPCR顯示, Cd2+脅迫下, 在甘蔗地上部和地下部,2-1-5均連續(xù)顯著上調(diào)表達, 而1的上調(diào)應答出現(xiàn)延遲。3在地上部的上調(diào)應答出現(xiàn)延遲, 在地下部呈“揚–抑”趨勢, 提示甘蔗響應Cd2+脅迫過程中2-1-5起更積極的作用,1參與脅迫后期的分子響應, 而3不起主導作用。Cu2+脅迫下, 地上部1連續(xù)顯著上調(diào)表達,2-1-5和3呈總體上調(diào)的表達趨勢; 地下部,1和2-1-5的上調(diào)表答均出現(xiàn)延遲, 僅在脅迫后期顯著上調(diào)表達, 而3僅在脅迫前期顯著上調(diào)表達。該結(jié)果提示了1、2-1-5和3在Cu2+脅迫響應過程中的協(xié)作關系, 三者共同參與了地上部的脅迫響應, 其中1起更積極的作用; 此外三者還先后參與了地下部對Cu2+脅迫的分子響應。Zn2+脅迫下,1和3分別僅在地上部和地下部顯著上調(diào)表達;2-1-5在地上部和地下部均呈“揚–抑”的應答趨勢; 提示了在甘蔗響應Cd2+脅迫應答過程中1和3分別在地上部和地下部起主要作用,2-1-5參與了脅迫前期的分子響應。1、2-1-5和3在甘蔗不同組織中及在重金屬(Cd2+、Zn2+或Cu2+)不同累積水平下呈現(xiàn)出相似或互補的應答特性, 提示上述甘蔗MT家族不同成員在重金屬解毒及細胞氧化還原調(diào)控等方面產(chǎn)生了功能分化, 且三者在應對過量Cd2+、Zn2+或Cu2+對甘蔗組織造成傷害的過程中存在時空上的協(xié)同作用。該研究為深入理解多倍體植物甘蔗中MT家族各成員基因在重金屬耐受過程中的協(xié)同作用機制奠定了基礎。

甘蔗; 金屬硫蛋白; 重金屬; 實時熒光定量PCR

金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是廣泛存在于生物中的一類富含半胱氨酸(cysteine, Cys)的低分子量蛋白[1]。自1957年被首次報道以來, 已在動物、植物、以及微生物中發(fā)現(xiàn)含有MT[2]。由于MT的Cys富集結(jié)構(gòu)域含有的巰基具有螯合金屬離子的能力, 其在參與細胞金屬離子代謝、調(diào)節(jié)金屬離子的定向運輸以及螯合解除重金屬離子毒害等方面起重要作用, 而引發(fā)研究者的廣泛關注[3-4]。植物中MT基因以基因家族的形式出現(xiàn), 在植物體內(nèi)主要參與金屬離子運輸、維持氧化還原平衡和調(diào)控基因表達等[1], 而且還參與一系列的植物生理調(diào)節(jié)過程, 包括通過結(jié)合重金屬離子而間接調(diào)控細胞內(nèi)活性氧水平[5-6]、調(diào)控細胞生長與增殖、調(diào)節(jié)酶和轉(zhuǎn)錄因子的活性[7], 參與細胞凋亡過程甚至可能扮演細胞氧化還原傳感器的角色[8-9]。

根據(jù)MT中Cys殘基的位置及排列方式, 前人將植物MT分為MT1、MT2、MT3和MT4四個類型[1,10]。其中, MT1型金屬硫蛋白在肽鏈的N端和C端分別含有3個保守的Cys-Xaa-Cys排列結(jié)構(gòu)(Cys代表半胱氨酸, Xaa代表其他氨基酸), 被一個不含Cys的中間區(qū)域分開; 肽鏈的兩端富含Cys, 不含芳香族氨基酸和疏水性氨基酸, 氨基酸個數(shù)大約在10~15; 而中間區(qū)域往往含有芳香族氨基酸和疏水性氨基酸而且保守性低, 氨基酸個數(shù)大約在30~45[10]。MT2型金屬硫蛋白氨基酸的排列方式與MT1型類似, N端和C端富含Cys且被一個含有大約40個氨基酸的中間區(qū)域分開; 但與MT1型不同的是, 在MT2型MT的前4個氨基酸位置具有其特有的Cys-Cys排列方式[10]。MT3型金屬硫蛋白在肽鏈的N端只含有4個Cys, 且前3個Cys按照保守的結(jié)構(gòu)Cys-Gly-Asn-Cys-Asp-Cys排列, C端一般含有6個Cys, 且都是以Cys-Xaa-Cys的排列方式存在[10]。上述3類MT在結(jié)構(gòu)上具有很高的相似性: 在氨基酸序列的N端和C端各存在一個富含Cys的結(jié)構(gòu)域, 即α和β結(jié)構(gòu)域; 這2個結(jié)構(gòu)域被一條不含Cys的中間區(qū)域分開。與其他3種類型的MT不同, MT4型MT含有3個富含Cys的結(jié)構(gòu)域, 平均散布在整條肽鏈中, 由2條含10~15個氨基酸殘基的中間區(qū)域隔開, 每個結(jié)構(gòu)域中含有大約5~6個Cys[10]。金屬綁定結(jié)構(gòu)域(Cys富集區(qū))的排列方式變化多樣, 表明了MT家族各成員功能的多樣性[11]。

研究者已相繼從多種植物中分離鑒定出植物MT家族成員基因[12]。目前, 已從大麥(L.)中分離到10個MT成員基因[13]; 從擬南芥(L.)中分離到8個MT成員基因(不計剪接變體), 其中有3個MT1型基因 (1a、1b和1c)、2個MT2型基因(2a和2b)、1個MT3型基因(3-1)和2個MT4型基因(4a-1和4b-1)(http://www. arabidopsis.org/index.jsp)。此外, 前人還基于全基因組分析, 表明水稻(L. subsp.)中共有13個MT基因編碼15個蛋白, 包括7個MT1型基因(、、、、、和)、4個MT2型基因(、、和)、1個MT3型基因和1個MT4型基因[14]。甘蔗(spphybrid)和擬南芥(L.)、水稻(L.)是迄今少數(shù)幾個含有4種類型MT的植物[1]?；贒NA凝膠雜交技術[15]和甘蔗EST數(shù)據(jù)庫分析[16]表明, 多倍體作物甘蔗基因組中含有典型的MT1型、MT2型和MT3型基因各8個, 含有MT4型基因1個, 但有核酸序列報道的目前僅有1個MT1型基因(1)[15]、4個MT2型基因(2-1-1、2-1-2、2-1-3和2-1-4)[15-18]和1個MT3型基因(3)[15]。研究者對植物MT家族基因各成員在基因結(jié)構(gòu)的差異和重金屬結(jié)合等功能上有一定的認識, 但對同一物種MT家族各成員基因相互間的進化關系、在植物應答重金屬等逆境脅迫中的協(xié)同作用及調(diào)控機理等研究鮮見報道。

甘蔗既是世界上最重要的糖料作物, 也是重要的生物能源作物, 具有重要的經(jīng)濟地位[17,19]。同時, 甘蔗作為大田栽培的高生物量C4禾本科作物, 具有適應性廣、抗逆性強、耐連作以及對鎘等重金屬具有良好的耐受和超富集能力, 是潛在的土壤重金屬污染的植物修復物種[15]。分離鑒定甘蔗應答重金屬脅迫的關鍵基因是解析其功能并進一步利用的基礎, 對篩選、培育和利用植物修復物種具有重要的現(xiàn)實和理論意義?，F(xiàn)代甘蔗栽培種是異源多倍體和非整倍體作物, 遺傳背景高度雜合[20-21]。為了明確甘蔗MT基因家族各成員的組成, 深入研究和闡明MT各成員在應答重金屬脅迫過程中的功能奠定基礎, 本研究以染色體的倍性相對明確、栽培面積最大的甘蔗熱帶原種Badila (L. cv. Badila) (2= 80)[22]為材料, 克隆了MT1、MT2和MT3三個類型的金屬硫蛋白基因, 分析了3類MT基因?qū)uCl2、ZnSO4或CdCl2脅迫的響應特點, 結(jié)合不同重金屬離子脅迫下甘蔗的表型、地上部和地下部富集重金屬離子的水平, 初步探討了甘蔗不同類型MT基因在甘蔗應答重金屬脅迫中的功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料處理

供試甘蔗材料為熱帶種原種Badila。挑選長勢一致的組培苗, 按單株置72孔穴盤中, 28℃, 光12 h/暗12 h培養(yǎng)4周。用1/10 Hongland營養(yǎng)液培養(yǎng), 每隔2 d更換一次培養(yǎng)液。待植株長至4~5片完全展開葉后, 開始脅迫試驗。將組培苗分為9組, 其中6組為處理組, 分別采用含有250mmol L-1CdCl2、250mmol L-1CuCl2和1000mmol L-1ZnSO4的1/10 Hongland營養(yǎng)液培養(yǎng)6 h和48 h; 另外3組為對照組, 以1/10 Hongland營養(yǎng)液分別培養(yǎng)0、6和48 h。將上述處理后的甘蔗組培苗全株洗凈, 分為地上部(根以上部分)和地下部(根部)取樣, 轉(zhuǎn)入下一步處理(重金屬含量檢測)或放置于液氮中速凍后轉(zhuǎn)到-80℃冰箱保存?zhèn)溆?RNA提取)。實驗設置3次生物學重復, 每個重復3株。

1.2 重金屬含量檢測

用雙蒸水反復沖洗整個植株表面3~5次, 然后將各植株的地下部分別浸沒在裝有1.0 mmol L-1EDTA溶液的燒杯中, 室溫條件下浸泡2 h, 以去除植物根部表面殘留的重金屬離子, 再用雙蒸水沖洗甘蔗植株, 用濾紙把植株表面的水吸干, 分為地上部和地下部取樣。用錫箔紙包好樣品后在105℃殺青30 min, 在90℃下烘干至恒重, 稱量其干物質(zhì)量, 最后將所有處理過的樣品放入干燥罐中保存?zhèn)溆?。依?jù)國家標準GB/T 5009.13-2003和GB/T 5009.14-2003, 采用火焰法測定銅和鋅含量; 依據(jù)國家標準GB/T 5009.15-2003, 采用石墨爐法測定鎘含量。

1.3 ScMTs基因的克隆與生物信息學分析

分別以已報道的甘蔗及其同源物種的MT1、MT2和MT3基因作為出發(fā)序列, 利用NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的blastn工具搜索甘蔗EST數(shù)據(jù)庫, 得到分別以甘蔗EST序列cf575433、ca231193和ca109790為代表的3個EST拼接群(Contig)。以上述EST拼接群的同源區(qū)段為模板, 應用Primer Premier 5.0軟件分別設計克隆1、2-1-5和3基因所用的特異性引物(表1)。

應用ORF Finder在線工具進行核酸及氨基酸序列組成分析、開放閱讀框(open reading frame, ORF)的查找和翻譯; 用DNAMAN5.2軟件進行多序列比對分析; 用Clustal W軟件對不同植物的金屬硫蛋白的氨基酸序列進行多序列比對后, 借助Mega 7.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。應用IBS (illustrator for Biological Sequences) 1.0.3軟件繪制基因結(jié)構(gòu); 氨基酸比對的序列分別來源于擬南芥(L.)、水稻(L.)和甘蔗(spphybrid)的MT1、MT2和MT3亞家族成員, 其中擬南芥(L.) 5個MT亞家族成員的名稱/登錄號信息為AtMT1A/AT1G07600.1、AtMT1C/ AT1G07610.1、AtMT2A/AT3G09390.1、AtMT2B/ AT5G02380.1和AtMT3-1/AT3G15353.1, 水稻(L.) 6個MT亞家族成員的名稱/登錄號信息為OsMT1A /XP_015617237.1、OsMT1B/XP_015628821.1、OsMT2A/ XP_015645105.1、OsMT2B/XP_015619130.1、OsMT2C/XP_015638726.1、OsMT3A/Os01g0200700, 甘蔗(spphybrid) 7個MT亞家族成員的名稱/登錄號信息為ScMT1/KJ504373、ScMT2-1-1/ scrufl3063a10.g、ScMT2-1-2/AAV50043、ScMT2-1-3/ AFJ44225、ScMT2-1-4/KJ504375、ScMT2-1-5/MH191346、ScMT3/KJ504374.1。

1.4 ScMTs基因表達模式分析

按照TRIzol Reagent (Invitrogen, 美國)說明書提取甘蔗材料總RNA; 按照RQ1RNase-Free DNase試劑說明書(Promega, 美國)逆轉(zhuǎn)錄前用DNA酶處理RNA樣品; 按照PrimeScript 1st StrandcDNA Synthesis Kit (TaKaRa, 中國大連)說明書逆轉(zhuǎn)錄; 按照SYBR Green PCR Master Mix Kit (Rox) (Roche, 美國)說明書配制定量反應體系。

根據(jù)所克隆到的甘蔗MT家族基因的序列信息, 應用Primer Premier 5.0軟件設計的定量引物。采用甘蔗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因作內(nèi)參基因[23], 引物具體信息見表2。qRT-PCR條件為50℃ 2 min; 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 40個循環(huán)。待反應停止, 進行融解曲線分析。采用2–DDCT算法分析實驗結(jié)果[24]。在ABIPRISM7300 (Applied Biosystems, 美國)型實時熒光定量PCR儀上進行基因定量表達分析。

表1 甘蔗金屬硫蛋白基因的克隆引物

表2 檢測甘蔗金屬硫蛋白家族基因表達的熒光定量PCR引物

2 結(jié)果及分析

2.1 重金屬脅迫下甘蔗幼苗的表型特征

甘蔗幼苗在250mmol L-1Cd2+或250mmol L-1Cu2+脅迫6 h和24 h時, 植株無明顯癥狀, 但當脅迫48 h時, 植株葉片卷曲、葉尖干枯發(fā)黃、根系褐化(圖1-B, D)。與Cd2+、Cu2+脅迫后的表現(xiàn)不同, 在所觀測的時間點內(nèi), 1000mmol L-1Zn2+脅迫下的甘蔗植株未表現(xiàn)出明顯的受害癥狀, 但有部分幼苗葉片的顏色變紫(圖1-C)。解除重金屬脅迫48 h時間后, 甘蔗幼苗表型開始恢復正常(圖略)。

圖1 不同重金屬脅迫48 h時甘蔗幼苗表型

A: CK; B; CdCl2; C: ZnSO4; D: CuCl2.

2.2 甘蔗幼苗中重金屬的累積特點

由圖2可知, 甘蔗植株對重金屬的富集量均隨著脅迫時間的延長而明顯上升, 其中, 地下部累積濃度遠遠超出地上部。甘蔗幼苗在Cd2+、Zn2+、Cu2+脅迫處理48 h后, 在地上部的累積量分別為(32.2±24.3) mg kg-1、(225.0±3.6) mg kg-1和(34.3± 15.9) mg kg-1, 在地下部的最大累積量分別為(196.7±26.6) mg kg-1、(1063.8 ±101.9) mg kg-1和(448.2±43.5) mg kg-1。

圖2 Cd2+、Zn2+、Cu2+脅迫下甘蔗幼苗地上部、地下部重金屬積累量

圖柱上不同的小寫字母表示5%水平下差異的顯著性。

Bars superscripted by different letters are significantly different at the 5% probability level.

2.3 ScMTs基因克隆與生物信息學分析

應用RT-PCR技術, 從Badila中獲得3個MT基因的cDNA序列(圖3), 分別命名為1、2-1-5和3 (對應的GenBank登錄號分別為KJ504373、MH191346和KJ504374)。其中,1的cDNA全長448 bp, 5￠非編碼區(qū)長67 bp, 3￠非編碼區(qū)長153 bp, ORF長228 bp, 共編碼75個氨基酸; 推導蛋白ScMT1氨基酸序列的N端和C端均含有3個CXC排列(C表示半胱氨酸殘基Cys, X表示除了Cys外的任意氨基酸), 排列方式符合植物MT1型的結(jié)構(gòu)特征(圖4-A)。2-1-5的cDNA全長461 bp, 5￠非編碼區(qū)長36 bp, 3￠非編碼區(qū)長179 bp, 開放閱讀框長246 bp, 共編碼81個氨基酸; 推導蛋白ScMT2-1-5氨基酸序列的N端含有CC、CXC和CXXC的排列結(jié)構(gòu), C端含有3個CXC排列, 符合植物MT2型的典型特征(圖4-B)。3的cDNA全長416 bp, 5￠非編碼區(qū)長64 bp, 3￠非編碼區(qū)長154 bp, 開放閱讀框長198 bp, 共編碼65個氨基酸; 推導蛋白ScMT3氨基酸序列N端的前3個Cys以CXXCXC方式排列, C端的Cys以3個CXC方式排列, 該排列方式符合植物MT3型的序列特征(圖4-C)。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果也表明, 甘蔗ScMT1、ScMT2-1-5和ScMT3分別屬于植物MT1、MT2和MT3型金屬硫蛋白(圖5)。

圖3 甘蔗金屬硫蛋白基因ScMTs的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

M: DNA ladder marker; 1:1; 2:2-1-5; 3:3.

圖4 ScMTs cDNA序列及其推導的氨基酸序列

A:1; B:2-1-5; C:3。*: 終止密碼子; C顯示的是Cys富集結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基。

A:1; B:2-1-5; C:3. *: Terminal codon; C shows the conservative cysteine residual of Cys-rich domain.

以gDNA為模板, 經(jīng)PCR擴增, 獲得甘蔗1、2-1-5和3基因的基因組DNA序列, 大小分別為615、1797和642 bp (圖略)。比較cDNA基因和基因組DNA基因序列可知,1基因組DNA基因含有2個外顯子, 由1個283 bp的內(nèi)含子連接;2-1-5基因組DNA基因含有3個外顯子, 由2個內(nèi)含子(大小分別為483 bp和583 bp)連接;3基因組DNA基因含有2個外顯子, 由1個內(nèi)含子(259 bp)連接(圖5)。上述內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)均符合GT-AG法則。

2.4 ScMTs基因表達模式

1受Cd2+脅迫的誘導而上調(diào)表達(圖6-A, B); 在Cd2+脅迫前期(6 h), 甘蔗地上部中1相對表達量的變化不明顯, 但在脅迫后期(48 h)顯著上調(diào), 為對照的2.36倍(圖6-B)。甘蔗地上部中1基因迅速正向響應Zn2+脅迫, 在6 h時顯著上調(diào)表達為對照的1.86倍, 并在處理周期內(nèi)維持高于對照的水平(圖6-C, D); 地下部中1的相對表達水平在處理前期和后期均無顯著變化(圖6-D)。甘蔗地上部中1也迅速響應Cu2+脅迫且呈連續(xù)上調(diào)表達趨勢, 在脅迫前期和后期, 該基因的表達水平分別為對照的1.51倍和2.19倍(圖6-E, F)。在Cd2+或Cu2+脅迫下, 地下部中1的相對表達水平均呈“抑–揚”趨勢, 在脅迫前期有所下調(diào), 但在脅迫后期均顯著上調(diào), 分別為對照的1.74倍(圖6-B)和3.27倍(圖6-F)。

圖5 甘蔗、水稻和擬南芥MTs的系統(tǒng)進化樹及外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖

方塊和條線分別代表外顯子和內(nèi)含子。Boxes and lines indicate exons and introns, respectively.

圖6 甘蔗ScMT1基因在不同重金屬脅迫下的表達模式

A、C和E分別為1在CdCl2、ZnSO4和CuCl2處理下的表達模式。B、D和F分別為1在CdCl2、ZnSO4和CuCl2處理下和相應對照中相對表達量的比值。誤差線為每組處理的標準誤(= 3)。圖柱上不同的小寫字母表示5%水平下差異的顯著性。

A, C, and E represent the expression patterns of1 in response to CdCl2, ZnSO4, and CuCl2, respectively. B, D, and F represent the ratio of1 expression level between treatment (CdCl2, ZnSO4,and CuCl2, respectively) and their control groups. The error bars represent the standard errors of each treating group (= 3). Bars superscripted by different letters are significantly different at the 5% probability level.

圖7 甘蔗ScMT2-1-5基因在不同重金屬脅迫下的表達模式

A、C和E分別為2-1-5在CdCl2、ZnSO4和CuCl2處理下的表達模式。B、D和F分別為2-1-5在CdCl2、ZnSO4和CuCl2處理下和相應對照中相對表達量的比值。誤差線為每組處理的標準誤(= 3)。圖柱上不同的小寫字母表示5%水平下差異的顯著性。

A, C, and E represent the expression patterns of2-1-5 in response to CdCl2, ZnSO4,and CuCl2, respectively. B, D, and F represent the ratio of2-1-5 expression level between treatment (CdCl2, ZnSO4,and CuCl2, respectively) and their control groups. The error bars represent the standard errors of each treating group (= 3). Bars superscripted by different letters are significantly different at the 5% probability level.

2-1-5的表達受Cd2+脅迫的誘導, 在甘蔗地上部和地下部均呈連續(xù)上調(diào)趨勢(圖7-A, B)。其中,2-1-5在地上部的相對表達量在處理6 h和48 h時分別為對照的1.84倍和2.05倍, 同時, 地下部該基因的表達水平分別為對照的1.64倍和4.46倍(圖7-B)。在處理前期,2-1-5在甘蔗地上部和地下部均受Zn2+脅迫的誘導而上調(diào)表達, 分別為對照的2.75倍和2.29倍(圖7-C, D); 其相對表達量在48 h時回落至低于對照的水平(圖7-D)。在甘蔗地上部和地下部,2-1-5的相對表達水平在Cu2+脅迫前期變化不明顯, 但在脅迫后期均顯著上調(diào), 分別為對照的1.62倍和3.69倍(圖7-E, F)。

甘蔗地上部3受Cd2+脅迫誘導, 呈上調(diào)表達趨勢, 在48 h時為對照的1.64倍; 甘蔗地下部3的相對表達量在Cd2+脅迫6 h時上調(diào)為對照的1.41倍, 但在48 h時下調(diào)為對照的0.47倍(圖8-A, B)。在Zn2+處理下, 甘蔗地上部3的相對表達水平也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢, 在脅迫6 h時就上調(diào)至對照的1.98倍, 并在處理后期維持在高于對照1.66倍的水平; 與地上部相比, Zn2+處理對地下部中3基因表達的誘導作用更加顯著, 其表達水平在脅迫6 h時就迅速上調(diào)至對照的10.09倍, 并在處理后期維持在高于對照4.38倍的水平(圖8-C, D)。甘蔗地上部3的表達受Cu2+處理的誘導而呈現(xiàn)上調(diào)趨勢, 在脅迫6 h時和48h時, 分別上調(diào)為對照的1.71倍和1.46倍; 甘蔗地下部3基因?qū)u2+脅迫的響應迅速且強烈, 其相對表達量在處理6 h時就達到最高, 為對照的3.96倍, 隨后回落為對照的1.24倍(圖8-E, F)。

3 討論

現(xiàn)代甘蔗栽培種(spp. hybrid)對重金屬鎘具有良好的耐受能力。甘蔗對Cd2+脅迫的臨界濃度在土壤栽培條件下達100 mg kg-1 [25], 在水培條件下達56.21 mg L-1 [15], 分別高于鎘超富集植物龍葵(L.)和青葙(Linn.)的25 mg kg-1 [26]和20 mg kg-1 [27]?，F(xiàn)代甘蔗栽培種對鎘還具有一定的富集能力。在上述臨界濃度下, 龍葵葉和根分別可富集到124.6 mg kg-1和259.9 mg kg-1 [26], 青葙葉和根分別可富集到388 mg kg-1和238 mg kg-1 [27], 而甘蔗地上部和地下部富集到的鎘含量分別為451 mg kg-1和9621 mg kg-1(干重)[15]。與前二者相比, 盡管甘蔗對鎘的轉(zhuǎn)運系數(shù)小于1, 但基于其高生物量及對鎘的高度富集能力, 依然被Sereno 等[15]認為是潛在的鎘修復植物。此外, 甘蔗還對重金屬銅具有一定的耐受與富集能力[15]。

圖8 甘蔗ScMT3基因在不同重金屬脅迫下的表達模式

A、C和E分別為3在CdCl2、ZnSO4和CuCl2處理下的表達模式。B、D和F分別為3在CdCl2、ZnSO4和CuCl2處理下和相應對照中相對表達量的比值。誤差線為每組處理的標準誤(= 3)。圖柱上不同的小寫字母表示5%水平下差異的顯著性。

A, C, and E represent the expression patterns of3 in response to CdCl2, ZnSO4, and CuCl2, respectively. B, D and F represent the ratio of3 expression level between treatment (CdCl2, ZnSO4, and CuCl2, respectively) and their control groups. The error bars represent the standard errors of each treating group (= 3). Bars superscripted by different letters are significantly different at the 5% probability level.

與現(xiàn)代甘蔗栽培種類似, 本研究中原始熱帶種Badila對鎘、鋅、銅等重金屬也有一定的耐受與富集能力, 組培幼苗能在含有100mmol L-1CdCl2、500mmol L-1ZnSO4或100mmol L-1CuCl2的培養(yǎng)液中生長而不發(fā)生毒害癥狀(圖略); 當Cd2+或Cu2+的處理濃度為250mmol L-1(Cd2+或Cu2+的含量分別相當于28.10 mg L-1和15.89 mg L-1)時, 幼苗在脅迫48 h時表現(xiàn)出受脅迫的表型(圖1), 但生物量未見顯著下降(結(jié)果略); 同時幼苗地上部中上述3種重金屬的累積量分別達(32.2±24.3) mg kg-1、(225.0±3.6) mg kg-1和(34.3±15.9) mg kg-1, 在地下部的最大累積量分別為(196.7±26.6) mg kg-1、(1063.8±101.9) mg kg-1和(448.2±43.5) mg kg-1(圖3)。上述3種重金屬離子經(jīng)由Badila根部吸收并運輸和分配到地上部分, 進而引發(fā)了相應的表型變化, 這為后續(xù)深入研究金屬脅迫下MT等功能蛋白對甘蔗吸收與耐受重金屬的機理奠定了基礎。

植物金屬硫蛋白(MT)被認為是細胞內(nèi)維持金屬離子平衡的關鍵蛋白[1]。MT基因各型亞家族成員的克隆及其在重金屬脅迫下的表達特性研究在擬南芥[28]、水稻[14]和大麥[13]等植物中已有較系統(tǒng)有報道。甘蔗是除了擬南芥、水稻以外的少數(shù)幾個含有全部4類MT的植物[1]。一般認為, MT4僅在發(fā)育的種子中表達[1,29], 考慮到甘蔗是中日性植物, 開花結(jié)實需要特定的光溫條件, 且生產(chǎn)上采用蔗莖進行無性繁殖, 因此本研究暫未關注甘蔗MT4類型的基因。MT2型基因在甘蔗中的報道最多, 例如克隆自甘蔗現(xiàn)代栽培種的2-1-1、2-1-2和2- 1-3[15-17], 以及來源于Badila的2-1-4[18]。Guo等[17]將植物MT2型分為3個亞類, 本研究中2- 1-5與上述甘蔗MT2型基因的推導蛋白序列均屬于MT2-1亞類, 序列一致性為94.46%。2-1-5與2-1-4一樣, 均來源于Badila, 且二者的推導蛋白序列一致性為96.39%。其中, ScMT2-1-4比ScMT2-1-5多了2個氨基酸殘基, 且還有1個氨基酸殘基的不同, 這3個氨基酸殘基位于不含Cys的中間區(qū)域(圖略), 初步推測二者為等位基因, 但還需要通過克隆該基因上下游區(qū)段等方法做進一步確認。關于甘蔗MT1型和MT3型基因的報道較少, Sereno等[15]應用RNA點雜交技術研究了甘蔗MT1 (GenBank登錄號為CA287650)、MT2 (CA232620)和MT3 (CA109591) 3個類型的MT基因在Cu2+和Cd2+脅迫下的應答模式, 但上述基因均來源于甘蔗EST序列, 并無實體克隆的報道。本研究進一步對其推導的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn), 該MT1 (GenBank登錄號為CA287650) C端的Cys富集區(qū)結(jié)構(gòu)域缺失, 而MT3 (CA109591)的N端和C端的Cys富集區(qū)結(jié)構(gòu)域也缺失, 均不符合植物MT1型和MT3型的結(jié)構(gòu)特征。本研究克隆的1、2-1-5和3基因, 其推導的氨基酸序列分別符合植物MT1型、MT2型和MT3型的結(jié)構(gòu)特征(圖3)。進一步比較擬南芥、水稻和甘蔗中上述3個類型的MT基因的結(jié)構(gòu), MT1型MT基因的外顯子與內(nèi)含子的構(gòu)成在擬南芥、水稻和甘蔗中較為保守, 均只含有1個內(nèi)含子; 擬南芥MT2型MT基因含有1個內(nèi)含子, 而禾本科的水稻和甘蔗的MT2型MT基因含有2個內(nèi)含子; 值得指出的是, 甘蔗MT3型MT基因僅含有1個內(nèi)含子, 與擬南芥和水稻MT3型含有2個內(nèi)含子的基因結(jié)構(gòu)不同(圖4)。

MT1型基因成員在鎘、鋅或銅的富集和耐受方面的功能已分別在擬南芥[28,30]和水稻[31]等模式植物中得到實驗證據(jù)的支持。檉柳(sp.) MT1基因也被證明有助于提高轉(zhuǎn)基因煙草植株對Cd2+的抗性[32]。不同植物的MT1基因?qū)χ亟饘倜{迫的應答模式有類似的特點。大麥葉片中受到不同濃度Zn2+脅迫的誘導, 在脅迫48 h時均顯著上調(diào)表達; 而不同濃度的Cd2+脅迫均抑制了該基因的表達; 此外,對Cu2+脅迫的響應存在劑量效應, 低濃度Cu2+脅迫(50mmol L-1CuSO4)下的表達水平變化不大, 而高濃度Cu2+脅迫(500mmol L-1CuSO4) 48 h時誘導的表達[13]。與類似, 水稻幼苗中基因受低濃度Zn2+(10mmol L-1)脅迫的誘導顯著上調(diào)表達, 而對低濃度Cu2+(10mmol L-1)脅迫無明顯響應[31]。本研究中,1對Cd2+脅迫的響應相對滯后, 在甘蔗地上部和地下部的表達水平在脅迫前期變化均不明顯(圖5-A), 隨著甘蔗地上部和地下部鎘的富集量從15.5 mg kg-1和93.7 mg kg-1分別上升到32.2 mg kg-1和196.7 mg kg-1(圖2), 甘蔗地上部和地下部1分別顯著上調(diào)表達為對照的2.37倍和1.75倍(圖5-B)。上述結(jié)果表明1對Cd2+脅迫的響應存在域值或延后效應, 提示了1可能并不直接與Cd2+螯合, 但參與了脅迫后期過量Cd2+毒害引起的生理生化與分子響應。甘蔗地上部和地下部富集到的鋅含量均隨處理時間的延長呈連續(xù)上升的趨勢, 且甘蔗地下部富集到的鋅含量顯著高于地上部(圖2)。Zn2+脅迫下,1在甘蔗幼苗地上部的相對表達量總體上維持高于對照的水平, 但1在甘蔗幼苗地下部對Zn2+脅迫的響應卻不敏感(圖5-D), 提示了該基因在根中并不參與甘蔗對過量Zn2+脅迫的生理及分子響應, 而僅在地上部發(fā)揮其功能。1在Cu2+脅迫下的應答模式總體上與擬南芥類似, 后者也是在根和葉均受到Cu2+脅迫的誘導而上調(diào)表達[29], 而甘蔗地上部和地下部1對Cu2+脅迫的應答模式還是有所區(qū)別(圖5-E, F): 地上部1對Cu2+脅迫的響應呈連續(xù)上調(diào)趨勢(圖5-F); 而地下部1對Cu2+脅迫的正向響應則相對滯后(圖5-F)。這種滯后表現(xiàn)為甘蔗地下部富集到307.3 mg kg-1的銅時,1相對表達水平并不高于對照(圖5-F), 而當銅含量達到448.2 mg kg-1時, 顯著上調(diào)表達為對照的3.27倍(圖5-F)。大麥[13]和水稻[31]對Cu2+脅迫的響應也存在相類似的劑量效應。1在地上部對Cu2+脅迫相對敏感, 而在地下部的響應存在域值或延后效應, 提示1參與甘蔗對過量Cu2+脅迫的分子響應, 但在地上部和地下部的機制有所不同。

與MT1類成員主要參與植物對重金屬的富集有所區(qū)別, 已有的證據(jù)表明MT2類成員主要在提高植物對鎘等重金屬的耐受能力方面發(fā)揮功能。過表達提高了煙草對Cd2+的耐受能力, 但單獨過表達2b對Cd2+和Zn2+從根部向地上部運輸方面的促進作用不顯著[33],2b在Cu2+轉(zhuǎn)運或累積到擬南芥地上部方面也不起直接的作用[28]。過表達甘蔗2-1-3提高了重組大腸桿菌對Cd2+和Cu2+的耐受性[17], 也提示了甘蔗2基因有類似的功能。不同植物的MT2基因?qū)χ亟饘倜{迫的響應各有特點, 二色補血草((Bunge) O. Kuntze)基因的表達受Cd2+和Cu2+誘導, 在地上部和地下部總體上均上調(diào)表達[34]; 東南景天(Hance)2基因的表達受Cd2+和Zn2+誘導, 在地上部和地下部均上調(diào)表達[35]; 而2對Cu2+脅迫的響應具有組織特異性, Cu2+(25mmol L-1CuSO4)能誘導擬南芥2a和2b分別在葉和根中高表達[29]。上述2基因?qū)Σ煌亟饘倜{迫的差異應答, 體現(xiàn)了MT2基因在不同植物適應重金屬等氧化脅迫的進化過程中出現(xiàn)了功能分化。值得指出的是, 甘蔗是高度雜合的多倍體或非整倍體作物, 染色體組中2基因的等位基因數(shù)量較多, 對同一種重金屬脅迫的應答趨勢也不盡相同。2-1-3在甘蔗FN39組培苗(全株)中的表達受到Cu2+的促進, 然而卻受Cd2+的抑制[17];2-1-4在地上部受Cd2+脅迫的誘導呈先抑后揚的模式, 但在地下部受Cd2+的抑制而穩(wěn)定下調(diào); 其在地上部和地下部響應Zn2+脅迫而呈先揚后抑的表達趨勢; 并在地上部和地下部受Cu2+脅迫的誘導總體上有所上調(diào)[18]。本研究中2-1-5對Zn2+和Cu2+脅迫下的應答模式與2-1-4類似(圖6-D, F), 但其在地上部和地下部的表達受Cd2+脅迫的誘導均呈連續(xù)上調(diào)趨勢(圖6-B), 表明2-1-5在甘蔗耐受Cd2+脅迫過程中可能起相對主要的作用; 其與等位基因2-1-4在甘蔗對Zn2+和Cu2+響應過程中可能起正向協(xié)同作用, 而在甘蔗地下部響應Cd2+重金屬脅迫的過程中, 二者的功能及調(diào)控方式可能有所分化。2-1-4和2-1-5對同一種重金屬脅迫的差異應答現(xiàn)象, 為了解等位基因在高度雜合的多倍體或非整倍體——甘蔗中的復雜功能及相應的調(diào)控機制提供了進一步的證據(jù)與思路。

有證據(jù)表明, 植物MT3在應答Cd2+脅迫方面并不起主要作用。天藍遏藍菜(J. & C. Presl)基因在地上部的表達水平高于地下部, Cd2+脅迫(100mmol L-1)對該基因在地上部和地下部的表達影響不顯著[36], 而50mmol L-1Cu2+脅迫誘導該基因在地上部顯著上調(diào)表達。與3類似水稻3基因受到Cu2+脅迫的誘導在葉片中表達量顯著上調(diào)[37]。體外Cd2+、Zn2+或Cu2+脅迫下的酵母異源互補等實驗也表明, 大麥(L.) MT3是維持重金屬鋅和銅在體內(nèi)平衡的看家蛋白[38]。與3和3僅在地上部上調(diào)表達不同,3在地上部和地下部受Cu2+脅迫的誘導均上調(diào)表達, 并且在地下部上調(diào)幅度達3.96倍, 高于其在地上部的上調(diào)水平(圖7-F)。3與3分別在地下部與地上部正向響應Cu2+等重金屬脅迫或許與二者基因結(jié)構(gòu)(內(nèi)含子)的差異(圖4)有關。同時,3還受Zn2+脅迫的誘導上調(diào)表達, 并且在地下部的表達水平高于對照10倍, 也遠遠高于其在地上部的上調(diào)幅度。此外, 盡管甘蔗地上部及地下部也富集了相當水平的鎘(圖2),3受Cd2+脅迫的誘導也有所上調(diào)(圖7-B), 但上調(diào)表達的幅度明顯低于其在Zn2+和Cu2+脅迫時的上調(diào)表達水平(圖7-D, F)。上述結(jié)果提示了3主要在甘蔗地下部響應Zn2+和Cu2+脅迫時發(fā)揮更積極的作用。

盡管近年來已經(jīng)有不少關于植物MT功能的研究, 但植物MT家族成員豐富, 要闡明MT各成員的功能及之間的協(xié)同作用, 仍然需用更多的證據(jù)[11]。

4 結(jié)論

從甘蔗熱帶種Badila中克隆獲得金屬硫蛋白家族3個成員基因1、2-1-5和3, 它們分別歸屬于MT1、MT2和MT3型植物MT亞家族。在營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下Badila幼苗對重金屬Cd2+、Zn2+和Cu2+有一定的耐受和富集能力, 上述重金屬離子經(jīng)由根部吸收并運輸、分配到地上部, 引發(fā)了相應的表型和分子響應。1、2-1-5和3參與上述分子響應過程, 且在甘蔗不同組織中對Cd2+、Zn2+或Cu2+表現(xiàn)出協(xié)同或互補的應答特性, 提示了上述MT成員基因在甘蔗應對重金屬傷害及其代謝機理等方面的功能分化, 和在時空上的協(xié)同作用。該研究為深入理解多倍體植物甘蔗中MT家族各成員基因在重金屬耐受過程中的協(xié)同作用機制奠定了基礎。

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Cloning and expression analysis of metallothionein family genes in response to heavy metal stress in sugarcane (L.)

GAO Shi-Wu1, FU Zhi-Wei1, CHEN Yun1, LIN Zhao-Li2, XU Li-Ping1, and GUO Jin-Long1,*

1Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;2Sugarcane and Products Quality Supervisory Inspection and Test Center of Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

Metallothioneins (MTs) are cysteine-rich, low-molecular-weight proteins. Plant MTs play important roles in detoxi?cation and cellular redox regulation. In this study, hydroponic experiments of sugarcane (L. cv. Badila) were carried out to study the effects of CdCl2, ZnSO4, and CuCl2treatments on plantlet growth. And then three kinds of heavy metal content in both shoots and roots of sugarcane were detected, showing an enrichment and tolerance ability to Cd2+, Zn2+, and Cu2+in Badila seedlings. Three metallothionein genes, termed as1 (accession number: KJ504373),2-1-5 (accession number: MH191346), and3 (accession number: KJ5043704), were isolated from Badila.1 contained an open reading frame (ORF) of 228 bp encoding 75 amino acids residues. The first (52 bp) and second (176 bp) extrons of1 were separated by an intron (283 bp).2-1-5 contained an ORF of 246 bp encoding 81 amino acids residues. The first (64 bp), second (87 bp), and third (101 bp) extrons ofwere separated by two introns (483 bp and 853 bp).3 contained an ORF of 198 bp encoding 65 amino acids residues. The first (50 bp) and second (148 bp) extrons of3 were separated by an intron (259 bp). The deduce protein ScMT1, ScMT2-1-5, and ScMT3 were categorized into the subfamily of plant type1, type2, and type3 MTs, respectively. The expression profiles of the three genes under different heavy-metal stresses were investigated by real-time quantitative PCR (qRT-PCR) analysis. When treated with Cd2+, the expression of2-1-5 was continuously and significantly up-regulated in both shoots and roots, while that of1 showed a delayed up-regulation pattern. The expression of3 showed a delayed up-regulation pattern in shoots and a trend of first raising and then suppressing in roots. The results suggested that2-1-5 might play a more active role in response to Cd2+in sugarcane while3 might not, and1 is involved in the molecular responses of Cd2+stress at the later stage. When treated with Cu2+, the expression of1 was continuously and significantly up-regulated, and that of2-1-5 and3 general up-regulated in shoots. As in the roots, the expression of both1 and2-1-5 showed a delayed up-regulation pattern which was significantly up-regulated at the later stage, while that of3 significantly up-regulated at the early stage. It revealed that1 cooperated with2-1-5 and3 is involved in the positive response to Cu2+stress in roots, and might play a more positive role than2-1-5 and3, and the three genes are successively involved in the molecular responses of Cu2+stress in roots.When treated with Zn2+, the expression of1 and3 increased only in shoots and roots, respectively. The expression of2-1-5 was up-regulated at the early stage and then suppressed in both shoots and roots. It suggests that1 and3 mainly function in shoots and roots, respectively, when exposed to Zn2+stress.2-1-5 was involved in the molecular responses of Cd2+stress at the early stage.1,2-1-5, and3 showed similar or complementary expression patterns in different tissues of sugarcane when exposed to heavy metals, which revealed the functional diversity of sugarcane MTs in detoxi?cation and cellular redox regulation, and their spatiotemporal coordination in mitigating or even preventing tissue injury caused by excessive heavy metals. The results provide a basic information for further research on mechanisms in the synergistic enhancement of tolerance to heavy metals for MTs family genes in the highly polyploid sugarcane.

sugarcane (L.); metallothionein; heavy metal; real-time qPCR

10.3724/SP.J.1006.2020.84086

本研究由國家自然科學基金項目(31871690)和國家留學基金委留學基金項目(20163035)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31871690) and the Foundation for China Scholarship Council (20163035).

郭晉隆, E-mail: jl.guo@163com

E-mail: gaoshiwu2008@126.com

2019-06-10;

2019-09-26;

2019-10-14.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20191014.1354.008.html