殷家明 鐘榮棋 林 吶 唐章林 李加納

諸葛菜小孢子培養(yǎng)及其單倍體減數(shù)分裂染色體配對觀察

殷家明1,2,**鐘榮棋1,2,**林 吶1,2唐章林1,2李加納1,2

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715;2重慶市油菜工程技術(shù)研究中心, 重慶 400715

諸葛菜是一種極有價值的觀賞、蔬菜、飼料和油料作物種質(zhì)資源。為建立諸葛菜小孢子胚狀體誘導(dǎo)再生植株技術(shù), 并為諸葛菜染色體組的起源與進(jìn)化研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)資料, 本研究通過對諸葛菜游離小孢子的培養(yǎng), 研究了熱激培養(yǎng)時間和活性炭濃度對胚狀體產(chǎn)量的影響, 并采用常規(guī)壓片法對諸葛菜單倍體減數(shù)分裂染色體配對行為進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明, 添加活性炭和熱激培養(yǎng)對胚狀體誘導(dǎo)是必需的。在直徑6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4 mL密度為1花蕾花粉 mL-1的小孢子NLN懸液時, 每皿添加1 mg活性炭和32℃熱激3 d的培養(yǎng)條件下子葉形胚狀體和總胚狀體產(chǎn)量最高, 分別為每花蕾0.92±0.18個和1.32±0.25個。子葉形胚狀體在1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率為27.73%?；ǚ壑仓曛凶匀患颖堵蕿?5%, 加倍植株染色體數(shù)為24, 單倍體植株染色體數(shù)為12。諸葛菜單倍體減數(shù)分裂染色體的平均配對構(gòu)型為= 12 = 6.352I + 2.008II + 0.384III + 0.12IV, 具有二價體及三價體和四價體的細(xì)胞比例高達(dá)96%, 少量細(xì)胞的12條染色體聯(lián)會形成3個四價體, 說明諸葛菜很可能是起源于染色體基數(shù)= 3的同源八倍體。本試驗結(jié)果對于諸葛菜新材料新品種選育和基礎(chǔ)研究具有重要參考價值。

諸葛菜; 小孢子培養(yǎng); 胚狀體; 單倍體; 減數(shù)分裂; 染色體配對

諸葛菜()為十字花科(Bassicaceae)諸葛菜屬植物, 主要分布在中國, 在許多地區(qū)都有自然分布或人工引種栽培[1], 通常被用作園林、城市綠化地被植物和花壇花卉, 別稱“二月藍(lán)(蘭)”。除本身具有較高的觀賞價值外, 還是創(chuàng)造紅花觀光兼用型油菜品種的優(yōu)良基因供體材料。油菜近緣植物芥藍(lán)()與諸葛菜雜交, 雜種即開紫紅或粉紅花[2]。諸葛菜基因在油菜花瓣中異位表達(dá), 得到了開紅花的油菜[3]。諸葛菜具有角果長、每角粒多和粒大的特點, 在油菜育種新材料創(chuàng)制上有重要價值[4]。諸葛菜是極具開發(fā)前景的蔬菜和飼料種質(zhì)資源[5-6], 同時也具有潛在的藥用價值, 其種子提取物具有護(hù)肝和細(xì)胞保護(hù)作用[7-8]。諸葛菜可作為綠肥植物增加作物產(chǎn)量、減少氮肥流失以及用于土壤修復(fù)[9-10]。其種子油組份特殊, 含有特殊的雙羥基脂肪酸, 高溫潤滑性能優(yōu)于蓖麻油, 是一種十分有價值的新型工業(yè)用油料作物種質(zhì)資源, 可作為生產(chǎn)生物柴油和高級潤滑油的原材料[11-12]。

諸葛菜在我國分布廣, 遺傳變異大, 多樣性豐富, 通過花藥或花粉培養(yǎng)可以快速獲得單倍體和純合二倍體, 這為諸葛菜的新材料新品種選育提供了材料基礎(chǔ)[1,13-18]。吳沿友等[19]進(jìn)行諸葛菜花藥培養(yǎng), 得到了少量胚狀體和再生植株, 而且所得植株為混倍體。賈勇炯等[20]從4℃低溫處理4 d的諸葛菜花藥中分離小孢子進(jìn)行培養(yǎng), 獲得了愈傷組織和再生植株。然而, 關(guān)于諸葛菜游離小孢子培養(yǎng)通過胚胎發(fā)生途徑獲得胚狀體和再生植株還未見報道。

諸葛菜屬()的系統(tǒng)分類位置存在較大爭議, 甚至在十字花科中不能被有力支持聚到任何進(jìn)化枝[21]。諸葛菜屬于諸葛菜復(fù)合群(complex)的一種, 體細(xì)胞染色體數(shù)目2= 24[13,15]。減數(shù)分裂染色體配對觀察結(jié)果表明, 該物種可能為自然多倍體[22]。李再云等[23-24]根據(jù)甘藍(lán)型油菜與諸葛菜屬間雜種染色體的細(xì)胞學(xué)行為的觀察結(jié)果提出, 諸葛菜可能為= 6的同源四倍體。吳建國等[25]對甘藍(lán)型油菜與諸葛菜的五倍體(AACCO)雜種及其后代的細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明, 諸葛菜可能是一天然的多倍體, 基數(shù)= 3。李再云等[26]利用原位雜交技術(shù), 在諸葛菜體細(xì)胞染色體中檢測到8個45S rDNA位點, 暗示諸葛菜染色體基數(shù)為3。Lysak等[27]通過染色體涂染分析發(fā)現(xiàn), 十字花科祖先核型的保守區(qū)段F和U在諸葛菜減數(shù)分裂粗線期染色體中檢測到2個同源異源拷貝。因此, 諸葛菜被認(rèn)為是一個四倍體或中四倍體(mesotetra- ploid)[27-28]。對諸葛菜單倍體減數(shù)分裂染色體配對的觀察, 可為了解諸葛菜染色體組的起源和進(jìn)化提供新的數(shù)據(jù)。本研究通過諸葛菜游離小孢子培養(yǎng), 觀察胚胎發(fā)生過程和胚狀體形態(tài), 研究熱激培養(yǎng)時間和活性炭濃度對胚狀體產(chǎn)量的影響, 并觀察諸葛菜單倍體減數(shù)分裂染色體配對行為, 其研究結(jié)果可為諸葛菜的利用和研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

諸葛菜(二月蘭)種子收集于重慶北碚西南大學(xué)校園內(nèi)野生開放授粉植株, 由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心繁殖保存。9月中旬播種育苗, 成苗后將幼苗移栽到玻璃溫室內(nèi)土壤中, 成活后每窩施復(fù)合肥約5 g, 根據(jù)需要澆水。溫室光照為自然光, 溫度不做特殊控制。次年2月, 植株開花后取樣進(jìn)行小孢子培養(yǎng), 10月將小孢子植株移栽到試驗地, 來年開花后進(jìn)行形態(tài)觀察和結(jié)實性鑒定, 并取樣用于觀察花粉育性和減數(shù)分裂染色體配對構(gòu)型。

1.2 方法

1.2.1 小孢子培養(yǎng)程序 花期上午8:00—9:00時, 從生長健康植株取4~5 mm長花蕾, 經(jīng)5%氨替福民溶液消毒10~15 min后用無菌水清洗, 置培養(yǎng)皿中, 加適量B5-13培養(yǎng)液(pH 5.8, 含13%蔗糖), 用玻璃注射器內(nèi)筒研磨擠壓出花粉, 400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾, 將花粉懸液轉(zhuǎn)移到離心管中, 160 ×離心3 min, 棄上清液, 再加入B5-13培養(yǎng)液搖勻離心。如此重復(fù)離心3次后, 用NLN-13培養(yǎng)液(pH 6.0)按1蕾花粉 mL-1密度懸浮。將小孢子懸液混勻, 分裝于直徑6 cm培養(yǎng)皿, 每皿4 mL, 在每皿中添加一定量的活性炭, 封口膜封口后在32℃暗培養(yǎng)數(shù)天, 然后轉(zhuǎn)移到25℃下繼續(xù)暗培養(yǎng), 肉眼可見胚狀體時轉(zhuǎn)入25℃的振蕩培養(yǎng)箱中60 r min-1培養(yǎng)14~20 d后統(tǒng)計胚狀體產(chǎn)量。

1.2.2 活性炭儲存液的配制 在100 mL超純水中加入1 g活性炭和0.5 g瓊脂糖, 121℃高溫滅菌后儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熱激培養(yǎng)時間對胚狀體產(chǎn)量的影響 每皿添加1 mg活性炭, 32℃下分別熱激培養(yǎng)0、1、3、5和7 d, 研究熱激培養(yǎng)時間對胚狀體產(chǎn)量的影響。在初花5 d后1周內(nèi)重復(fù)取材3次, 每處理每次重復(fù)5皿。

1.2.4 活性炭濃度對胚狀體產(chǎn)量的影響 每皿添加0、1、2和3 mg活性炭, 在32℃下熱激培養(yǎng)3 d, 研究活性炭濃度對胚狀體產(chǎn)量的影響。在初花5 d后1周內(nèi)重復(fù)取材3次進(jìn)行試驗, 每處理每次重復(fù)5皿。

1.2.5 胚狀體發(fā)生過程和形態(tài)觀察 以每皿添加1 mg活性炭、32℃熱激3 d的培養(yǎng)物為對象, 經(jīng)1、3、5、7、10和14 d培養(yǎng), 分別在倒置顯微鏡下觀察胚狀體發(fā)生過程。振蕩培養(yǎng)14~20 d后, 在體式顯微鏡下觀察胚狀體形態(tài)。

1.2.6 植株再生、移栽、育性和倍性鑒定以及單倍體染色體配對觀察 將振蕩培養(yǎng)14~20 d的子葉胚轉(zhuǎn)移到1/2MS+3%蔗糖+7 g L-1瓊脂培養(yǎng)基(pH 5.8)上, 在20℃、12.5 μmol m-2s-116 h d-1光照條件下培養(yǎng)。出芽后將芽切下繼代保存和擴(kuò)繁到每個花粉植株無性系具有3~5芽。移栽前1個月, 將芽轉(zhuǎn)移到1/2MS+0.5 mg L-1IBA+3%蔗糖+7 g L-1瓊脂培養(yǎng)基(pH 5.8)上生根。生根后的試管苗經(jīng)煉苗1周后移栽到試驗地, 最初1周內(nèi)用白色塑料膜遮蔽。在花期, 對植株進(jìn)行形態(tài)觀察, 取即將開放花朵, 取出花藥并擠出花粉用2%醋酸洋紅染液染色后在顯微鏡下觀察統(tǒng)計花粉育性。取幼嫩花蕾用卡諾氏固定液(3份95%乙醇∶1份冰乙酸)固定24 h后轉(zhuǎn)入75%酒精于冰箱內(nèi)4℃保存?zhèn)溆? 用改良卡寶品紅液染色觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后期I或前期II染色體數(shù)目, 觀察單倍體減數(shù)分裂終變期-中期I染色體配對構(gòu)型。對加倍的植株采用人工輔助授粉自交, 以了解自交結(jié)籽率; 同時, 輔助授以天然諸葛菜混合花粉, 以了解異交結(jié)籽率。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚狀體發(fā)生過程和形態(tài)

培養(yǎng)1 d后, 部分小孢子體積明顯增大, 呈圓球形; 另一部分小孢子體積沒有明顯變化(圖1-A)。培養(yǎng)3 d后, 觀察到一些小孢子發(fā)生第1次細(xì)胞分裂。分裂方式有2種, 多為對稱分裂, 形成2個大小近等的細(xì)胞(圖1-B); 另一種是非對稱分裂, 形成2個大小明顯不同的細(xì)胞(圖1-C)。培養(yǎng)5 d后, 可觀察到多細(xì)胞團(tuán)(圖1-D)和具有胚柄狀結(jié)構(gòu)的原胚(圖1-E)。培養(yǎng)7 d后, 胚發(fā)育到球形原胚階段(圖1-F)。培養(yǎng)10 d后, 胚發(fā)育到球形胚時期(圖1-G)。培養(yǎng)14 d, 肉眼可見細(xì)小的白色顆粒狀培養(yǎng)物, 在倒置顯微鏡下可見球形胚狀體和心形胚狀體, 包括圓球形(圖1-H)和卵球形(圖1-I)胚狀體以及桃心形(圖1-J)和心臟形胚狀體(圖1-K)。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)14 d后, 胚狀體發(fā)育到子葉期(圖1-L)。

圖1 諸葛菜小孢子胚胎發(fā)生過程

A: 部分小孢子膨大; B: 小孢子近均等分裂; C: 小孢子不均等分裂; D: 多細(xì)胞團(tuán); E: 具胚柄狀結(jié)構(gòu)的原胚; F: 球形原胚; G: 球形胚; H: 具胚柄狀結(jié)構(gòu)的圓球形胚狀體; I: 卵球形胚狀體; J: 桃心形胚狀體; K: 心臟形胚狀體; L: 培養(yǎng)28 d后的胚狀體。

A: some swelled microspores; B: microsporal equal cell division; C: microsporal unequal cell division; D: multicell cluster; E: proembryo with a suspensor-like structure; F: globular proembryo; G: globular embryo; H: round sphere embryoid with a suspensor-like structure; I: oval sphere embryoid; J: heart embryoid; K: cordate embryoid; L: embryoids after 28 days of culture.

振蕩培養(yǎng)14~20 d后在體式顯微鏡下觀察胚狀體形態(tài)。胚狀體可分為子葉形胚狀體(圖2-A~E)、魚雷形胚狀體(圖2-F)、心形胚狀體(圖2-G)、球形胚狀體(圖2-H)和不規(guī)則形胚狀體(圖2-I) 5種類型。同一類型的胚狀體又有多種多樣的形態(tài)。如子葉期胚狀體就有雙子葉胚狀體(圖2-A)、三子葉胚狀體(圖2-B~C)、單子葉胚狀體(圖2-D)和2個雙子葉胚狀體合生(圖2-E)等多樣的形態(tài)表現(xiàn); 球形胚狀體有橄欖球形、橢球形、卵球形和圓球形胚狀體等形態(tài)差異(圖2-H)。

2.2 熱激培養(yǎng)時間對胚狀體產(chǎn)量的影響

相對于持續(xù)25℃培養(yǎng), 32℃熱激培養(yǎng)對于胚狀體誘導(dǎo)和形成是必需的。未經(jīng)熱激培養(yǎng)不能誘導(dǎo)形成任何形態(tài)的胚狀體, 熱激培養(yǎng)1 d便能誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體。試驗以熱激培養(yǎng)3 d獲得的總胚狀體產(chǎn)量最高, 子葉形胚狀體產(chǎn)量也最高。熱激培養(yǎng)時間再延長, 總胚狀體產(chǎn)量和子葉形胚狀體產(chǎn)量都有降低的趨勢(表1)。

圖2 諸葛菜小孢子胚狀體形態(tài)

A: 雙子葉胚狀體; B: 三子葉胚狀體; C: 具1胚根狀結(jié)構(gòu)三子葉胚狀體; D: 單子葉胚狀體; E: 合生雙胚; F: 魚雷形胚狀體; G: 心形胚狀體; H: 球形胚狀體; I: 不規(guī)則形胚狀體; 標(biāo)尺= 2 mm。

A: dicotyledonous embryoid; B: tricotyledonous embryoid; C: tricotyledonous embryoid with an additional radicle; D: monocotyledonous embryoid; E: twin dicotyledonous embryoids; F: torpedo-shaped embryoids; G: heart-shaped embryoids; H: globular embryoids; I: anomalous embryoids; Bar = 2 mm.

表1 不同熱激時間下諸葛菜小孢子胚狀體產(chǎn)量

同一列數(shù)字后字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

Data followed by a different letter in the same column are significantly different at the 0.05 probability level.

2.3 活性炭濃度對胚狀體產(chǎn)量的影響

添加活性炭對于胚狀體的形成是必需的, 不添加活性炭的處理未獲得任何形態(tài)的胚狀體。每皿添加1 mg活性炭時, 總胚狀體產(chǎn)量和子葉形胚狀體產(chǎn)量最高, 但與每皿添加活性炭2 mg時的總胚狀體產(chǎn)量和子葉形胚狀體產(chǎn)量相比, 沒有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。添加活性炭過多不利于胚狀體的形成, 對子葉形胚狀體的形成影響更大(表2)。

表2 不同活性炭濃度下諸葛菜小孢子胚狀體產(chǎn)量

同一列數(shù)字后字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

Data followed by a different letter in the same column are significantly different at the 0.05 probability level.

2.4 植株再生、形態(tài)、育性和倍性

將子葉形胚狀體轉(zhuǎn)移到1/2MS固體培養(yǎng)基上, 有的胚狀體逐漸褐化死亡; 有的胚狀體胚軸伸長但不出芽; 也有的胚狀體很快便開始萌發(fā)并出芽, 其下胚軸伸長, 長出白色的根, 在子葉節(jié)處長出幼芽(圖3-A)。共培養(yǎng)子葉胚119個, 經(jīng)過30 d培養(yǎng), 有33個胚狀體萌發(fā)出芽, 萌發(fā)率為27.73%。胚狀體萌發(fā)產(chǎn)生的根纖弱且數(shù)量少, 將芽切下轉(zhuǎn)移到1/2MS固體培養(yǎng)基繼代保存和擴(kuò)大繁殖到每個無性系有3~5芽。移栽前1個月, 將繼代保存的無性系32個轉(zhuǎn)移到1/2MS+IBA 0.5 mg L-1固體培養(yǎng)基上生根, 有22個無性系生根, 生根率為68.75%。生根后的試管苗經(jīng)煉苗1周后移栽到試驗地, 共移栽22個無性系, 到開花期有12個存活, 移栽存活率為54.55%。

開花期觀察, 根據(jù)植株形態(tài)特別是花器官大小, 植株可分為2種類型, 即加倍的植株(圖3-B)和單倍體植株(圖3-C)。加倍植株生長健壯, 花蕾較多, 花朵和花蕾較大; 而單倍體植株較纖弱, 花蕾較少, 花朵和花蕾較小(圖3-B~D)。在存活的12個花粉植株無性系中, 有3個為自然加倍植株, 自然加倍率為25%。加倍植株花藥飽滿, 內(nèi)含大量可育花粉(圖3-E)。不同加倍植株間花粉育性有差異, 3個加倍花粉植株可育花粉率分別為58.35%、62.68%和76.03%。單倍體植株花藥干癟, 內(nèi)含花粉粒少, 在顯微鏡下觀察全為小而不可染色的敗育花粉(圖3-F)。染色體數(shù)量觀察表明, 加倍植株染色體為24條(圖3-G), 單倍體植株染色體為12條(圖3-H)。加倍植株自交能結(jié)少量種子, 表現(xiàn)自交高度不親和, 3個加倍花粉植株平均每角果結(jié)籽數(shù)分別為0、0.25和0.65。對3株加倍植株輔助授以天然諸葛菜混合花粉則能結(jié)較多種子, 平均每角果結(jié)籽數(shù)分別為10.20、12.65和16.40。單倍體植株開放式授粉和人工輔助授以天然諸葛菜混合花粉均不能結(jié)籽。

圖3 諸葛菜小孢子植株的再生、形態(tài)、育性和倍性

A: 胚狀體萌發(fā); B: 加倍的小孢子植株; C: 單倍體植株; D: 加倍和單倍體植株的花和花蕾; E: 加倍植株花粉; F: 單倍體植株花粉; G: 加倍植株花粉母細(xì)胞染色體(2= 24); H: 單倍體植株花粉母細(xì)胞染色體(2= 12); 標(biāo)尺= 10 μm。

A: germination of embryoids; B: doubled microspore-derived plantlet; C: haploid plantlet; D: flowers and buds of double haploid and haploid plantlets; E: pollens of double haploid plantlet; F: pollens of haploid plantlet; G: chromosomes in the pollen mother cell of doubled plantlet (2= 24); H: chromosomes in the pollen mother cell of haploid plantlet(2= 12); bar = 10 μm.

2.5 單倍體減數(shù)分裂染色體配對構(gòu)型

在125個花粉母細(xì)胞中, 共觀察到24種染色體配對構(gòu)型(表3和圖4)。染色體可聯(lián)會形成單價體、二價體、三價體和四價體, 單價體數(shù)變化在0~12個, 二價體數(shù)變化在0~6個, 三價體數(shù)變化在0~2個, 四價體數(shù)變化在0~3個, 平均配對構(gòu)型為= 12 = 6.352I+2.008II+0.384III+0.12IV。染色體聯(lián)會形成二價體及三價體和四價體的細(xì)胞比例達(dá)到96%, 只有4%的細(xì)胞形成12個單價體(表3)。值得注意的是, 有少量細(xì)胞(0.8%)的12條染色體聯(lián)會形成3個四價體(表3, 圖4-H)。這說明諸葛菜具有多倍體的性質(zhì), 很可能起源于染色體基數(shù)= 3的同源八倍體。

表3 諸葛菜單倍體減數(shù)分裂染色體配對構(gòu)型

圖4 部分諸葛菜單倍體(2n = 12)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體配對構(gòu)型(標(biāo)尺= 10 μm)

A: 12I; B: 1II+10I; C: 6II; D: 1III+3II+3I; E: 1IV+4II; F: 1IV+1III+1II+3I; G: 2IV+1III+1I; H: 3IV.

3 討論

小孢子胚胎發(fā)生和胚狀體形態(tài)觀察表明, 諸葛菜小孢子胚胎發(fā)生經(jīng)歷了均等或非均等細(xì)胞分裂、多細(xì)胞團(tuán)、球形原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚等時期, 這與同為十字花科的蕓薹屬植物的情形相似[29-32]。本試驗觀察到具有胚柄狀結(jié)構(gòu)的胚。由于具胚柄小孢子胚與合子胚更相似, 因此具胚柄小孢子胚發(fā)育途徑誘導(dǎo)體系在研究胚胎發(fā)育機(jī)制方面有重要價值而受到重視[32-33]。形成胚柄狀結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象在甘藍(lán)型油菜和芥菜型油菜小孢子胚胎發(fā)生中都有報道。在甘藍(lán)型油菜中, 小孢子培養(yǎng)溫度和時間是影響胚柄樣結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵因素。Ilic-Grubor等[34]報道在35℃熱激1 h、33℃熱激14~18 h后轉(zhuǎn)移到24℃培養(yǎng)時, 甘藍(lán)型油菜部分小孢子球形胚、心形胚和魚雷形胚上存在胚柄狀結(jié)構(gòu)。Joosen等[32]和Supena等[35]研究表明, 短暫溫和的32℃熱激處理促進(jìn)甘藍(lán)型油菜具胚柄小孢子胚發(fā)育途徑, 隨著熱激處理時間縮短該途徑比例越高, 小孢子胚胎發(fā)育與合子胚胎發(fā)生極其相似, 胚柄結(jié)構(gòu)從第1次分裂發(fā)生持續(xù)到心形胚階段。而Prem等[33]則建立了一種新的與合子胚發(fā)生相似的小孢子胚胎發(fā)生體系, 即在持續(xù)18℃下進(jìn)行甘藍(lán)型油菜“Topas” 的小孢子培養(yǎng), 小孢子的發(fā)育有3條途徑, 為配子體樣發(fā)育途徑、不具胚柄狀結(jié)構(gòu)的胚胎發(fā)育途徑和具有胚柄狀結(jié)構(gòu)的胚胎發(fā)育途徑, 其中具有胚柄狀結(jié)構(gòu)的胚胎發(fā)育途徑為主要途徑, 占50%以上, 與合子胚胎發(fā)生相似, 胚柄結(jié)構(gòu)從第1次分裂發(fā)生持續(xù)到心形胚階段。在芥菜型油菜中, 基因型和供體植株生長條件影響具胚柄狀結(jié)構(gòu)小孢子胚的形成。Chanana等[36]對3種生長條件的6個芥菜型油菜品種進(jìn)行小孢子培養(yǎng), 在32℃熱激3 d后轉(zhuǎn)移到25℃下培養(yǎng), 結(jié)果只有在晝/夜溫度為10℃/5℃的生長條件下1個品種“PR-45”形成了具胚柄狀結(jié)構(gòu)的胚狀體, 胚柄結(jié)構(gòu)可持續(xù)到子葉胚。本試驗觀察到胚柄狀結(jié)構(gòu)可持續(xù)到魚雷形胚狀體(圖2-F), 而子葉形胚狀體上未觀察到胚柄狀結(jié)構(gòu)。這是因為具胚柄狀結(jié)構(gòu)胚胎發(fā)育較緩慢還是在魚雷期后降解消失需要進(jìn)一步考察。

在十字花科植物小孢子培養(yǎng)中, 溫度脅迫是誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生的重要因素, 常用的處理方式是32~35℃熱激處理1至數(shù)天后轉(zhuǎn)移到常溫(25℃)培養(yǎng)。本試驗結(jié)果表明, 熱激對諸葛菜小孢子胚的發(fā)生具有重要作用, 相對于持續(xù)25℃培養(yǎng)來說, 32℃熱激培養(yǎng)對于胚狀體誘導(dǎo)和形成是必需的。Prem等[33]在持續(xù)18℃低溫脅迫下進(jìn)行甘藍(lán)型油菜“Topas”的小孢子培養(yǎng)獲得成功, 建立了一種新的小孢子胚胎發(fā)生體系。低溫脅迫和傳統(tǒng)的高溫脅迫下成熟胚狀體形態(tài)相似, 胚狀體萌發(fā)成苗率和花粉植株染色體自發(fā)加倍率都沒有顯著差異, 而低溫脅迫較高溫脅迫下胚狀體產(chǎn)量要低得多, 所需培養(yǎng)時間也較長[33]。另外, 高溫脅迫處理在十字花科植物小孢子培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用, 而小孢子低溫脅迫培養(yǎng)體系在包括諸葛菜在內(nèi)的其他基因型材料上的適用性還需進(jìn)一步研究。

活性炭具有吸附和減少培養(yǎng)基中的抑制成分和有毒代謝產(chǎn)物的能力, 經(jīng)常用于植物組織培養(yǎng)中, 來改善細(xì)胞的生長和發(fā)育[37]?；钚蕴吭谑只浦参锔仕{(lán)[38-40]、白菜[41-44]、黑芥[45-46]、甘藍(lán)型油菜[47-51]、芥菜型油菜[52]和芝麻菜[53]的小孢子培養(yǎng)中都得到廣泛而成功應(yīng)用, 對小孢子胚胎發(fā)生和植株再生表現(xiàn)出促進(jìn)作用。本試驗也說明了活性炭在小孢子培養(yǎng)中的重要性, 表明添加活性炭對諸葛菜小孢子胚胎發(fā)生是必需的。

諸葛菜單倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體配對觀察表明, 諸葛菜很可能是一個起源于染色體基數(shù)= 3的同源八倍體, 這與吳建國等[25]和李再云等[26]的觀點一致, 而與Lysak等[27]和Franzke等[28]的觀點不同。在試驗中, 還觀察到一定比例的花粉母細(xì)胞染色體聯(lián)會形成6個二價體(表3, 圖4-C), 但花粉育性和結(jié)實性觀察結(jié)果都表明, 諸葛菜單倍體雌雄都不育。這說明, 即使這6個染色體構(gòu)成的一組染色體, 其遺傳結(jié)構(gòu)和功能是不平衡的。盡管觀察到形成3個四價體的細(xì)胞, 但其比例極低, 加上形成6個二價體的細(xì)胞, 總的比例也僅為3.2%; 形成12個單價體的細(xì)胞比例也僅占4%; 絕大多數(shù)細(xì)胞都是不規(guī)則的配對構(gòu)型(表3)。因此, 本研究推測諸葛菜起源于= 3的同源八倍體, 但在進(jìn)化過程中染色體和染色體組的結(jié)構(gòu)已發(fā)生了較大變化, 正處于向二倍化轉(zhuǎn)變的過程中。Lysak等[27]的研究支持諸葛菜是四倍體, 這是否就是該多倍體二倍化過程中間環(huán)節(jié)的體現(xiàn), 還需進(jìn)一步研究。值得注意的是, Lysak等[27]在研究中還發(fā)現(xiàn), 諸葛菜粗線期染色體中, 十字花科祖先核型F區(qū)段的1個拷貝與祖先核型的排列相似, 另1個拷貝只保留了祖先核型F區(qū)段的頂端部分, 這也說明諸葛菜染色體和染色體組結(jié)構(gòu)發(fā)生了重排。

4 結(jié)論

初步建立了諸葛菜小孢子培養(yǎng)技術(shù), 通過游離小孢子胚胎發(fā)生途徑獲得了單倍體和染色體加倍的植株?；钚蕴亢蜔峒づ囵B(yǎng)對諸葛菜游離小孢子胚狀體誘導(dǎo)是必需的, 在直徑6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4 mL 1花蕾花粉 mL-1的小孢子NLN懸液時, 每皿添加1 mg活性炭和32℃熱激3 d的培養(yǎng)處理, 子葉形胚狀體和總胚狀體產(chǎn)量最高。諸葛菜單倍體減數(shù)分裂染色體配對行為的觀察結(jié)果支持諸葛菜為起源于染色體基數(shù)= 3的同源八倍體的觀點。

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Microspore culture and observations on meiotic chromosome pairing of the haploid in

YIN Jia-Ming1,2,**, ZHONG Rong-Qi1,2,**, LIN Na1,2, TANG Zhang-Lin1,2, and LI Jia-Na1,2

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;2Chongqing Rapeseed Eengineering and Technology Research Center, Chongqing 400715, China

is extremely valuable as the ornamental, vegetable, forage and oil germplasm resource. In order to develop the technique of microspore-derived embryoid induction and plant regeneration, and provide dada for the origin and evolution of the genome, the effects of the heat-shock incubation duration and the content of additional activated charcoal on embryoid yield were studied through microspore culture, and the meiotic chromosome pairing behavior of the haploid was observed by conventional squashing method in. The activated charcoal addition and heat shock culture were required for embryoid induction. When 4 mL microspore suspension with 1 bud per mL was incubated in aF6 cm petri dish at 32℃ of heat shock for three days and supplemented with 1 mg activated charcoal in each dish, the cotyledon-shaped embryoid yield and total embryoid yield were highest, which were 0.92 ± 0.18 and 1.32 ± 0.25 embryoids per bud, respectively. The germination rate of the cotyledon-shaped embryoids in 1/2MS medium was 27.73%. The natural chromosome doubling rate was 25% among the survival microspore-derived plantlets. The chromosome number of the double haploid plants and the haploid plants was 24 and 12, respectively. The meiotic chromosome pairing configuration of the haploid inwas averaged as= 12 = 6.352I + 2.008II + 0.384III + 0.12IV. The percentage of the pollen mother cells with bivalent, trivalent and tetravalent was up to 96%. The 12 chromosomes in 0.8% of pollen mother cells synapsed into three tetravalents. The chromosome pairing behavior strongly suggested thatoriginated from a homologous octoploid with the basic chromosome number of= 3. The above results provide a reference for breeding new materials and cultivars and for basic research in.

; microspore culture; embryoid; haploid; meiosis; chromosome pairing

10.3724/SP.J.1006.2020.94065

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0100503), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-12)和重慶市社會事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(cstc2016shms-ztzx80010, cstc2017shms-xdny80009)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Plan (2018YFD0100503), the China Agriculture Research System (CARS-12), and the Chongqing Science and Technology Innovation Special Project for Social Affairs and People’s Livelihood Insurance (cstc2016shms-ztzx80010, cstc2017shms-xdny80009).

殷家明, E-mail: 1661096534@qq.com; 鐘榮棋, 1457139712@qq.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

2019-04-24;

2019-08-09;

2019-10-12.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20191011.1719.011.html