鄧 姍，褚云霞，3*，林 艷，郭偉珍，楊旭紅，李壽國，陳海榮，3**

（1上海市農業(yè)科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海201403；2農業(yè)農村部植物新品種測試（上海）分中心，上海201415；3上海市設施園藝技術重點實驗室，上海201403；4河北省林業(yè)科學研究院，石家莊050061；5農業(yè)部科技發(fā)展中心，北京100122）

仙客來（Cyclamen persicumMill.）為報春花科仙客來屬多年生球根草本花卉，其葉片心形或近心形，造型可愛；花色豐富，有白色，紫色，紅色及復色等，花瓣上有復輪、爪、眼睛狀斑塊等圖案，極具觀賞性；仙客來花期長，開花時間為11月至翌年5月，恰逢圣誕、元旦、春節(jié)等重大節(jié)日，深受廣大消費者的喜愛［1］。

18世紀中葉，英、法、德的園藝家開始了仙客來新品種的培育，20世紀仙客來已發(fā)展成國際性的重要盆花。日本、荷蘭、瑞典、美國、以色列和澳大利亞紛紛開展仙客來的育種。至今已培育出數(shù)千個園藝品種，并推廣到世界各地［2］。盡管仙客來品種眾多，但除保護所有種屬的國家外，僅中國和比利時將仙客來納入了保護名錄，除歐盟外，僅日本和韓國有申請量，申請量也較少，僅授權105件，因此國際植物新品種保護聯(lián)盟（UPOV）尚未開展國際DUS測試指南的研制。

中國沒有仙客來野生資源的天然分布，20世紀20—30年代開始引入仙客來進行栽培［3］，目前市場上的主要栽培品種均為國外引進的仙客來 F1代雜交種［4］，主要來自莫萊爾公司（The Morel Diffusion company）、荷蘭先正達種子有限公司（Syngenta Seeds BV）、荷蘭斯好萊花卉公司（Schoneveld Breeding）、艾羅仙客來育種公司（Eyraud Plants）幾大國際知名育種公司。隨著育種和栽培技術的不斷提高和完善，仙客來的發(fā)展取得了長足進步，早在20世紀70年代末，天津仙客來盆花在全國就有了一定知名度，現(xiàn)已建立160多個品種的仙客來種質基地［5］。近年來，我國仙客來的生產和銷售更是呈快速增長趨勢［5］，在各大省市的銷售排名均在前十位。目前在山東、河北、遼寧、四川、山西、云南、內蒙古、上海、北京等地均建立了仙客來生產基地，2018年仙客來每盆售價在60元（人民幣，下同）到150元不等，每年都有一定數(shù)量仙客來盆花出口日本。我國仙客來育種工作也取得了一定成績，如天津市園林綠化研究所通過自交和雜交的方法推出七大系列40多個類型的仙客來新型材料［6］、山西省農業(yè)科學院園藝研究所的銀葉系列新品種［7］、山東萊州育成的新潮系列、長袍系列和大酒瓶系列、萊州大紅等［8］。同時在突變育種［9］、單倍體育種［10］方面也進行了一定的研究。

DUS（特異性、一致性和穩(wěn)定性）是品種的基本屬性，植物品種具備DUS三性是獲得植物品種權的必要條件［11］。為了規(guī)范市場，保護育種者權利，促進更多更好國外品種引入我國市場及我國新優(yōu)品種走出國門，進入國際市場，均需實行新品種保護。具有相應種（屬）的測試指南是開展DUS測試的必備條件之一。本研究闡述仙客來DUS測試指南研制的主要過程和制訂的主要方式，列出所有數(shù)量性狀的分級標準，以期較好地指導仙客來DUS測試實踐。

1 研制的目標和過程

1.1 研制目標

仙客來DUS測試指南的研制以《中華人民共和國植物新品種保護條例》為準則，以《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則》（GB/T 19557.1—2004）［12］、《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性審查和性狀統(tǒng)一描述總則》［13］和《植物新品種測試指南的研制》（UPOV TGP/7/4）［14］等文件為指導，結合我國仙客來育種和生產的現(xiàn)狀，研制出符合我國國情的仙客來DUS測試指南。

1.2 研制過程

1.2.1 參考資料的收集

收集日本測試指南以及與仙客來相關的育種、資源等20余篇文獻以及《中國植物志》等資料。

1.2.2 仙客來資源收集與栽培

共收集28份仙客來品種，種植于農業(yè)部植物新品種測試（上海）分中心玻璃溫室中，按植物大小不同分別種植于12—15 cm花盆，以泥炭∶珍珠巖（3∶1）混合為栽培基質，單株盆栽。

1.2.3 仙客來DUS測試指南研制的主要內容的確定

（1）依據相關資料對仙客來的抗病性，抗逆性等特性進行預判；

（2）依據《中國植物志》及日本的測試指南，初步確定候選性狀；

（3）通過田間試驗，篩選性狀，對數(shù)量性狀進行分級，并依據此數(shù)據確定標準品種；

（4）結合田間試驗和室內分析試驗，研究仙客來DUS三性的測試方法，包括樣本數(shù)量、測試時期、測試部位以及觀察方法；

（5）確定分組性狀，編寫技術問卷。

2 仙客來DUS測試指南的制訂

按照農業(yè)部科技發(fā)展中心撰寫的《植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南編寫規(guī)則》，仙客來DUS測試指南由10個章節(jié)和3個規(guī)范性附錄組成（表1）。

表1 仙客來新品種DUS測試指南的結構Table 1 The structure of guidelines for the conduct of tests for distinctness，uniform ity and stability：Cyclamen

2.1 適用對象的確定

仙客來屬（Cyclamen）約20個種［15］。其中仙客來（C.persicum）是本屬最著名、栽培最廣泛的植物，于20世紀30年代就引入我國栽培?，F(xiàn)在的仙客來品種大部分是從原種仙客來經過多年培育改良而來，該原種有兩個變種，即大花形變種（var.giganteumHort）和暗紅色變種（var.spendensHort）［16］。國際上申請品種權也主要集中在地中海仙客來（C.hederifoliumAiton）、仙客來（C.persicumMill.）、仙客來與歐洲仙客來雜交種（C.persicumMill.×C.purpurascensMill.）、歐洲仙客來（C.purpurascensMill.）。已有的形態(tài)學［17］、細胞學［18］、分子生物學［19］研究均表明，三種仙客來的親緣關系較遠，特別是仙客來與其他兩種均有顯著差別。其中歐洲仙客來和地中海仙客來染色體數(shù)目均為34，花期夏秋季，而仙客來為48，花期冬春季。三種仙客來形態(tài)上有較大差別，如地中海仙客來根從塊莖的上部和側邊長出，葉心形到箭形，由于具較強耐寒性，多用于庭院種植；歐洲仙客來根從塊莖的側邊和底部長出，葉腎形到心形，冬季不落葉，花香；而仙客來一般從底部長出，葉心形到近圓形。由于目前我國市場上收集到品種均為仙客來，因此規(guī)定本指南僅適用于仙客來（C.persicumMill.）新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試和結果判定，仙客來屬的其他種可參考。

2.2 測試性狀的選擇與確定

日本仙客來測試指南包括了42個性狀，其中41個形態(tài)性狀，1個物候期性狀，有些性狀極為繁瑣，如花瓣顏色需分先端、中部、基部分別進行比色，有些性狀難以觀測，例如花莖結實后的螺旋程度等。因此結合國內科研、生產等實際情況，以及多年來田間觀測，最終確定了該標準中的40個性狀（表2）。

表2 仙客來DUS測試指南性狀Table 2 The characteristics in DUS test guidelines of C.persicum

（續(xù)表2）

注：QN：數(shù)量性狀 QL：質量性狀 PQ：假質量性狀VG：群體目測 MS：個體測量；灰色是特別提示測試性狀的適用范圍

仙客來的葉和花均具有較高的觀賞性，因此大部分性狀集中在葉和花上，分別為15個和23個。按照性狀的表達類型進行分類，質量性狀8個，數(shù)量性狀20個，假質量性狀12個（表3）。

表3 仙客來DUS測試指南選用的性狀分類Table 3 The type of characteristics in DUS test guidelines of C.persicum 個

日本測試指南適用范圍為仙客來屬［20］，其中較多性狀由于在其他種上表現(xiàn)出多態(tài)性，并不適合仙客來，因此我國指南刪除了15個性狀，增加了13個性狀（表4）。刪除的性狀中，“花瓣：邊緣缺刻數(shù)量”和“花瓣：邊緣缺刻程度”在實際的觀察中難于區(qū)分，增加了測試誤差，因此中國指南中在保留了“花瓣：邊緣缺刻”的性狀的同時，將表達狀態(tài)調整為無、弱、強三種；仙客來的花瓣次色不僅分布在邊緣及先端，也可能分布在縱向分布，而僅分別觀測花瓣先端、中部和基部顏色，不能區(qū)分主色和次色，無法對花瓣顏色進行準確描述，因此改為分別觀測花瓣的主色與次色，并觀測次色的類型和位置分布；日本指南中開花習性有春季開花、秋季開花、四季開花三種表達狀態(tài)，而仙客來花期受溫度、水分、光照以及施肥的因素影響較大且可長達6個月，另外由于仙客來屬于日照中性植物，日照長度的變化對花芽分化和開花沒有決定性的作用［21］。其花期主要受生長狀態(tài)影響，一般播種后12—15個月開花，因此刪除了該性狀。

表4 仙客來DUS測試指南中日版對比Table 4 Difference between DUS test guidelines of China and Japan

在收集到的品種中未觀測到花萼瓣化現(xiàn)象，反而有雄蕊發(fā)生瓣化（圖1），而雄蕊瓣化到一定程度后可能成為重瓣品種，因此，在未計數(shù)花瓣數(shù)的情況下，有必要觀測雄蕊的瓣化情況。

圖1 花：雄蕊的瓣化Fig.1 Flower：petalody of stamen

一般情況下仙客來的萼片數(shù)為5片，觀測中發(fā)現(xiàn)有數(shù)量增減情況，大多數(shù)情況下，萼片數(shù)與花瓣數(shù)相同，如4花瓣和4萼片，6花瓣和6萼片，也有可能不同，如同樣為6萼片，則存在5花瓣和7花瓣的情況，由于這種變異在品種中并不完全一致，因此僅觀測萼片是否出現(xiàn)變異，而并不計數(shù)萼片的數(shù)目（圖2）。

圖2 花：萼片變異Fig.2 Flower：variation of sepal number

花藥顏色有黃色、褐色和紫紅色，塊莖顏色分別為淺褐色、灰褐色和紅褐色，這兩個性狀觀測方便，受環(huán)境影響小，滿足DUS測試性狀的其他要求，因此增加為測試性狀。

對于仙客來來說，花是重要的觀賞部位，花莖的數(shù)量是評價仙客來盆花商品價值的重要指標，而且隨著仙客來作為切花應用，花莖數(shù)量多必將成為育種的主要目標。盡管花葉的數(shù)量具有明顯的相關性，但Neuray［22］認為莖的表面可以直接形成不定芽，不定芽可以分化葉芽和花芽，因此，花葉的數(shù)量并不呈現(xiàn)一對一的相關性。因此，有必要增加花莖：數(shù)量作為測試性狀。

2.3 數(shù)量性狀分級

依據《植物新品種特異性、一致性及穩(wěn)定性測試及統(tǒng)一描述總則》（TG/1/3）的說明，參照朱頂紅新品種DUS測試數(shù)量性狀的分級方法［23］，結合田間試驗，對仙客來的9個需進行個體測量的數(shù)量性狀進行分析，9個數(shù)量性狀的最小值、最大值、平均數(shù)、標準差和變異系數(shù)等值見表5?？梢钥闯觯@些品種的平均變異系數(shù)分布在8.3%—17.7%，除葉片數(shù)量和葉柄長度外，其他性狀的變異系數(shù)均小于15%，表明這些性狀在品種內表達滿足一致性要求。按照級差大于等于2倍平均標準差的要求，將9個性狀進行分級（表6）。

表5 仙客來DUS測試數(shù)量性狀Table 5 The data of quantitative characteristics used for DUS testing of C.persicum

表6 仙客來DUS測試數(shù)量性狀的分級Table 6 The scales of quantitative characteristics used for DUS testing of C.persicum

2.4 標準品種的選用

在植物新品種測試中，用于性狀示例、校準環(huán)境對性狀的影響的品種，稱為標準品種。標準品種的選用原則是容易獲得且性狀表達穩(wěn)定，盡可能用最少量的標準品種涵蓋所有性狀及其表達狀態(tài)［24］。本指南中采用了大量的圖片及圖例進行性狀解釋，而僅選用了4個標準品種：日本模瓣粉、艾羅紅皺邊、清芬大花紅、荷蘭小花白，分別使用了15次、6次、31次和13次，為9個數(shù)量性狀的年度間及地點間的校準提供依據，大大減少了測試工作量、降低了測試成本。

2.5 分組性狀的選用

按照TGP/7/2的說明，分組性狀必須是質量性狀或者在不同地點的表達狀態(tài)能夠明顯區(qū)分已知品種的數(shù)量性狀或假質量性狀；能夠排除已知品種或者在進行DUS測試時能夠安排近似品種相鄰種植［25］。分組性狀的數(shù)量不是固定的，如果只有少數(shù)性狀滿足以上的標準，則它們可能全部被選為分組性狀；如果滿足上述條件的性狀較多，則選擇部分為分組性狀。

依據上述標準，仙客來測試指南選用了6個分組性狀，分別是（1）植株：大小（性狀1）；（2）花莖：數(shù)量（性狀 16）；（3）花瓣：邊緣波狀程度（性狀 25）；（4）花瓣：長度（性狀 26）；（5）花瓣：主色（性狀 30）；（6）花：雄蕊的瓣化（性狀35）。

2.6 仙客來DUS判定標準

2.6.1 特異性判定

特異性是如果一個品種明顯區(qū)別于申請時其他任何已知品種，則認為該品種具有特異性。在測試中，當申請品種至少在一個性狀上與近似品種具有明顯且可重現(xiàn)的差異時，即可判定申請品種具備特異性。

2.6.2 一致性判定

如果一個品種“考慮到其有性繁殖或無性繁殖表現(xiàn)出足夠的同質性”，則認為其具備一致性。

種子繁殖是仙客來的主要繁殖方式，而雜交育種是仙客來的主要育種方式，因此在DUS測試中，一致性判定時，允許相對較多的異型株，采用了2%的群體標準和至少95%的接受概率。當樣本大小為19—41株時，最多可以允許有2個異型株，當樣本大小為42—60株時，最多可以允許有3個異型株。而葉片斑紋由于受光照、營養(yǎng)等因素影響較大，在一致性判定時，品種的變異程度不能顯著超過同類型品種。

2.6.3 穩(wěn)定性判定

如果一個品種經過重復繁殖后，或在每個特定的繁殖周期結束時，如果其相關性狀仍保持不變，則應認為其具備穩(wěn)定性。一般情況下，不對穩(wěn)定性做測試，當遞交的材料具有一致性，則認為具有穩(wěn)定性。必要時，可以種植該品種的下一批種子，與以前提供的種子相比，若性狀表達無明顯變化，則可判定該品種具備穩(wěn)定性。對于雜交種的穩(wěn)定性判定，還可以通過測試其親本的一致性和穩(wěn)定性來進行判定。

3 結論與討論

我國仙客來DUS測試指南在調查市場上主栽品種的基礎上，充分考慮我國的育種現(xiàn)狀，選擇了40個表達穩(wěn)定、多態(tài)性好且易于觀察的性狀作為DUS測試性狀。其中20個QN性狀僅有8個性狀需個體測量，在減少測試工作量的同時保證了性狀的區(qū)分能力。仙客來品種分類至今沒有統(tǒng)一的標準，多以花型分類，分為皇冠型、平瓣型、洛可可型、大花型四種［26］。分組性狀綜合考慮了生產上常用的分組方式，依據花瓣長度可以先將大花型品種、皇冠型品種與平瓣型和洛可可型分成兩組，再根據花瓣：邊緣波狀程度將大花型品種與皇冠型品種區(qū)別開。同時通過植株：大小區(qū)分巨型品種、中型品種及微型品種。

對于數(shù)量性狀，根據品種內的變異程度、品種間差異程度、育種水平、品種的繁殖方式等不同可采用目測或測量的方式。個體測量可以取得較多的信息，在一致性和特異性分析時不僅可以采用代碼法，還能用統(tǒng)計分析方法，但同時也將耗費較多的時間采集數(shù)據。有些數(shù)量性狀如“花莖：粗度”，經分析其品種內變異系數(shù)僅8.3%，且只分3級，級差較大，在測試任務量大的情況下，可以考慮采用群體測量或群體目測的方式，以提高測試效率。

盡管在仙客來品種內存在個別花朵萼片與花瓣數(shù)不為5的情況，但在“花：花瓣數(shù)”的觀測時，以占多數(shù)的花瓣數(shù)為整個品種該性狀的表達狀態(tài)，因此所有收集到的品種都只有一種表達狀態(tài)，該性狀不能區(qū)分品種的特異性，不滿足作為DUS測試的要求，因此刪除了這個性狀。而許多文獻（如《中國植物志》［27］）均表示仙客來有重瓣品種，且有報道日本已成功育成了重瓣系仙客來。雖然在我國市場上還未見到重瓣品種，但是隨著育種的進程，未來有可能出現(xiàn)半重瓣和重瓣品種，為了提高指南的適用性，當該類型品種大量出現(xiàn)時，應對指南進行修改，增加“花：類型”或“花：花瓣數(shù)”為測試性狀。

我國仙客來DUS測試指南的研制過程中參考了日本仙客來屬DUS測試指南，刪除了在仙客來品種中缺乏多態(tài)性的性狀，同時增加了利于區(qū)分品種的性狀，提高了我國指南的適用性和可操作性。但是，早在2009年河北省林業(yè)科學研究院為培育適合我國栽培的地中海仙客來，就從國際仙客來協(xié)會荷蘭分會先后引進多種不同類型的地中海仙客來［4］。另外歐洲仙客來等大量的不為人們所熟知的種在歐洲市場上都早已被利用起來［28］，我國仙客來DUS測試指南是否能適用于仙客來屬其他種，或者經過修訂后能否擴大適用范圍至仙客來屬，還需收集其他原生種進行觀測驗證。