譚文甫，楊俊濤，夏雪，向仁堃，王曉旭

0 引言

骨肉瘤常見于兒童和青少年長骨的干骺端[1]，國內(nèi)發(fā)病率約為3/100萬，占惡性腫瘤的0.2%，是青少年骨腫瘤中主要的死亡因素[2]。治療上雖然已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但患者的預(yù)后及生活質(zhì)量仍令人失望[3]。

近年來，骨肉瘤基因組學(xué)和蛋白組學(xué)研究得到了快速發(fā)展[4]，但臨床獲益十分有限，進(jìn)而轉(zhuǎn)向腫瘤微環(huán)境研究[5-6]。據(jù)報道微環(huán)境通過多種途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[7-9]。如巨噬細(xì)胞作為微環(huán)境中最豐富的白細(xì)胞，被認(rèn)為與各種人類惡性腫瘤的血管生成、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10]以及化療耐藥[11]有關(guān)。M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-12、IL-23和CD68，具有抗腫瘤作用。M2型巨噬細(xì)胞分泌高水平的IL-10、CD163和CD204，通常具有促瘤作用。

有研究證明骨肉瘤微環(huán)境中存在M2型巨噬細(xì)胞[10,12]，但尚未系統(tǒng)地探討M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。有學(xué)者提出酸性微環(huán)境在M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化中至關(guān)重要，缺氧產(chǎn)生的酸性微環(huán)境可能引發(fā)巨噬細(xì)胞中的HIF-1α活化及精氨酸酶-1和IL-10的過表達(dá)[13]。

研究發(fā)現(xiàn)M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）升高導(dǎo)致骨肉瘤預(yù)后不良[14]。由于PKM2能促進(jìn)乳酸分泌，而乳酸對酸性微環(huán)境具有廣泛的促進(jìn)作用，本實(shí)驗(yàn)研究了M2型巨噬細(xì)胞浸潤及PKM2在骨肉瘤中表達(dá)的預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2010—2014年南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科88例原發(fā)性骨肉瘤石蠟包埋標(biāo)本。回顧性分析年齡、性別、發(fā)病部位、腫瘤大小、組織學(xué)分級、ALP、LDH、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、局部疼痛和Eneeking分期等臨床參數(shù)。根據(jù)Eneeking分期系統(tǒng)對腫瘤進(jìn)行分期，并根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級。獲得患者書面知情同意及南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 材料

組織微陣列的構(gòu)建由上海生物芯片公司制作；PKM2兔多克隆抗體為美國CST公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（HRP）及Gene Tech GTVision Ⅲ檢測試劑盒為中國上?；蚩萍脊井a(chǎn)品；Human CD163試劑盒為美國R&D公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織芯片及標(biāo)本處理 對患者的石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行組織微陣列構(gòu)建，該微陣列的構(gòu)建是與上海生物芯片合作建造。來自原發(fā)腫瘤的蘇木精和伊紅（HE）染色切片用于定義代表性腫瘤區(qū)域和鄰近的正常組織；代表性腫瘤區(qū)域定義為包含超過75%癌細(xì)胞而沒有壞死的腫瘤區(qū)域，隨機(jī)選擇與腫瘤區(qū)域相距至少5.0 cm的相鄰正常組織作為對照。使用組織微陣列儀（USA）從組織塊的限定區(qū)域沖壓圓柱體（直徑1.5 mm）并插入受體石蠟塊中，將這些切片轉(zhuǎn)移到載玻片上。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 將組織微陣列載玻片用二甲苯脫石蠟，然后用乙醇浸泡水化。在含有0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）的壓力鍋中進(jìn)行熱介導(dǎo)的抗原修復(fù)，修復(fù)液沒過切片組織，再將上述容器放入加有適量自來水的高壓鍋內(nèi)，加蓋加熱2 min后熄火并冷卻至室溫。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，3%過氧化氫孵育5 min阻斷多余的過氧化物酶活性。滴加兔抗人多克隆抗體PKM2抗體（1:100）于切片上置濕盒4℃下培養(yǎng)過夜，樣品與辣根過氧化物酶在室溫下孵育40 min。在PBS中洗滌3～5 min后，用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液檢測PKM2。

1.3.3 鏡下觀察及評估 M2巨噬細(xì)胞定義為卵圓形或圓形細(xì)胞核，具有膜或細(xì)胞質(zhì)CD163染色。低倍（×100）下掃描染色的切片以確定巨噬細(xì)胞浸潤最豐富的區(qū)域。高倍鏡（×400）下對5個區(qū)域的巨噬細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)將浸潤巨噬細(xì)胞密度分為4類:（0）缺失（＜20/mm2）；（1）弱浸潤（20～40/mm2）；（2）中度浸潤（40～60/mm2）；（3）高度浸潤（60/mm2）。在統(tǒng)計(jì)分析中，分為陰性（0～1）或陽性（2～3）浸潤。由對臨床信息不知情的兩名病理科醫(yī)師進(jìn)行評估。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Pearsonχ2檢驗(yàn)研究臨床病理學(xué)參數(shù)和CD163表達(dá)之間的關(guān)系，采用Spearman秩檢驗(yàn)評價PKM2與CD163的相關(guān)性，Kaplan-Meier分析預(yù)后價值，Cox回歸模型進(jìn)行參數(shù)與患者預(yù)后的相關(guān)性分析。多因素分析進(jìn)一步檢驗(yàn)單因素分析中與總體生存率相關(guān)的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M2巨噬細(xì)胞在骨肉瘤組織中高度浸潤

為了證實(shí)M2巨噬細(xì)胞在骨肉瘤中的生物學(xué)意義，首先檢測了CD163的表達(dá)來觀察其是否存在于骨肉瘤中，CD163染色范圍從陰性到陽性，見圖1A、1B。70.5%的患者M(jìn)2巨噬細(xì)胞浸潤陽性，提示M2巨噬細(xì)胞在骨肉瘤中高度浸潤。此外，骨肉瘤組織中M2巨噬細(xì)胞的浸潤較癌旁組織更為豐富（P＜0.05），見表1、圖1C。

表1 CD163在骨肉瘤的癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Table 1 CD163 expression in osteosarcoma and adjacent tissues

2.2 CD163細(xì)胞與臨床病理特征的相關(guān)性

基質(zhì)中M2巨噬細(xì)胞與Eneeking分期呈正相關(guān)（P=0.003），與年齡、性別、腫瘤部位等參數(shù)無關(guān)，見表2。

2.3 M2巨噬細(xì)胞浸潤情況

M2巨噬細(xì)胞浸潤陽性的患者存活率明顯低于陰性患者（P=0.009），見圖1C?；|(zhì)中M2巨噬細(xì)胞浸潤的升高是患者的獨(dú)立不良預(yù)后因素（P=0.010,HR=2.02,95%CI:1.16～3.49），見表3。

2.4 PKM2過表達(dá)與間質(zhì)M2巨噬細(xì)胞浸潤

表2 骨肉瘤中CD163表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 Relation between CD163 expression and clinicopathological parameters of osteosarcoma patients

在顯微鏡下觀察PKM2和CD163的連續(xù)切片染色情況，發(fā)現(xiàn)PKM2表達(dá)升高的患者伴有高M(jìn)2巨噬細(xì)胞浸潤，見圖2A。Spearman測定表明癌細(xì)胞的PKM2表達(dá)與骨肉瘤中的M2巨噬細(xì)胞浸潤正相關(guān)（P＜0.001,r=0.390），見圖2B。進(jìn)一步研究PKM2和CD163在骨肉瘤中的組合模式，發(fā)現(xiàn)它們的過表達(dá)都給患者帶來了極不良的預(yù)后（P＜0.05），見圖2C～D。Cox回歸分析表明骨肉瘤中PKM2表達(dá)升高，巨噬細(xì)胞CD163表達(dá)是骨肉瘤的獨(dú)立不良預(yù)后因子（P=0.001,HR=2.71,95%CI:1.53～4.80），見表3。

3 討論

近期，越來越多研究開始探索有氧糖酵解在惡性腫瘤中的作用，前者與后者的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，腫瘤細(xì)胞需要多種生物分子才能增殖與遷移，而腫瘤細(xì)胞中更高水平的有氧糖酵解途徑可以為其提供這些物質(zhì)[15-16]。作為參與有氧糖酵解的關(guān)鍵酶，PKM2在惡性腫瘤患者中表達(dá)明顯升高，骨肉瘤亦不例外，且PKM2高表達(dá)與腫瘤中的不利表型相關(guān)[17-19]。Morfouace等[20]的一項(xiàng)研究表明，PKM2升高可通過上調(diào)Oct4的表達(dá)，從而抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)而降低膠質(zhì)瘤發(fā)生。此外，還有報道稱PKM2表達(dá)升高可通過增強(qiáng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[21]。但關(guān)于PKM2促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討，本研究發(fā)現(xiàn)PKM2與M2巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)，這表明PKM2可能通過促進(jìn)免疫抑制表型巨噬細(xì)胞浸潤作用從而促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展。

圖1 CD163的表達(dá)與骨肉瘤預(yù)后的關(guān)系Figure 1 Relation between CD163 expression and prognosis of osteosarcoma patients

圖2 PKM2和CD163過表達(dá)為骨肉瘤患者預(yù)后不良因素Figure 2 Overexpression of PKM2 and CD163 was poor prognostic factor for osteosarcoma patients

圖3 在骨肉瘤中聯(lián)合M2巨噬細(xì)胞與PKM2的模型Figure 3 Proposed model of M2 macrophages combined with PKM2 in osteosarcoma

M2巨噬細(xì)胞可能與腫瘤形成密切相關(guān)[10,17]。本研究發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞高度浸潤組生存結(jié)果較差，CD163不只是M2巨噬細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物，因此尚需研究M2巨噬細(xì)胞的其他標(biāo)志物以進(jìn)一步完善該實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

M2巨噬細(xì)胞亦被認(rèn)為有促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展的作用，因此抑制M2巨噬細(xì)胞可能具有很大的臨床意義?？傊?，針對惡性腫瘤中M2巨噬細(xì)胞的潛在治療策略包括抑制單核細(xì)胞聚集，抑制單核細(xì)胞極化和消除完全成熟的M2巨噬細(xì)胞[11]。本研究結(jié)果提示，針對PKM2或聯(lián)合M2巨噬細(xì)胞的靶向治療可能為骨肉瘤的替代治療方法。

本研究探討了M2巨噬細(xì)胞的生物學(xué)意義及其在骨肉瘤中轉(zhuǎn)化的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞在骨肉瘤中高度浸潤，可能為患者預(yù)后不良的相關(guān)因素，同時發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤中PKM2表達(dá)與M2巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，其中M2細(xì)胞高度浸潤及PKM2高表達(dá)組預(yù)后最差?；诒狙芯拷Y(jié)果，推測PKM2升高可促進(jìn)乳酸分泌，從而激活巨噬細(xì)胞的p38/MAPK信號通路，導(dǎo)致M2巨噬細(xì)胞極化，最終促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展。

上述數(shù)據(jù)提示PKM2和CD163在骨肉瘤中存在交叉表達(dá)。對文獻(xiàn)的全面綜述表明M2巨噬細(xì)胞極化部分獨(dú)立于酸性微環(huán)境，考慮到乳酸是酸性條件的重要貢獻(xiàn)者，并且PKM2是乳酸生成的關(guān)鍵酶，因此我們擬提出將骨肉瘤中的PKM2和M2巨噬細(xì)胞聯(lián)系起來的模型，見圖3，其包括PKM2表達(dá)升高和癌細(xì)胞的乳酸表達(dá)，p38/MAPK巨噬細(xì)胞的激活以及M2極化。

表3 骨肉瘤患者臨床病理單因素和多因素生存分析Table3 Univariate and multivariate survival analyses of clinicopathologic features of osteosarcoma patients