徐敏銘，溫子歡，官 偉，王緒君，黃常盛

1.上饒惠陽醫(yī)院骨科，上饒 334000

2.上饒市立醫(yī)院骨科，上饒 334000

3.上饒清水醫(yī)院骨科，上饒 334000

椎間盤位于椎體之間，司職脊柱旋轉(zhuǎn)、屈曲和背伸活動的密閉性結(jié)構(gòu)，包括中央髓核、外圍纖維環(huán)以及上下兩端軟骨終板［1-2］。髓核位于椎間盤核心位置，在椎間盤發(fā)揮功能時起著至關(guān)重要的作用。椎間盤發(fā)生退行性變時，髓核變化最為明顯，表現(xiàn)為以細胞外基質(zhì)代謝紊亂為主的多種病理生理反應(yīng)［3］。含Ⅰ型血小板反應(yīng)蛋白的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS）是一種Zn2+依賴的基質(zhì)降解酶［4］。研究表明，ADAMTS家族成員中的ADAMTS-4和ADAMTS-5可大量降解細胞外基質(zhì)成分中的蛋白聚糖（ACAN），在退行性疾病中發(fā)揮重要作用［5］。SOX-9是軟骨分化和早期睪丸發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)ACAN和膠原纖維等細胞外基質(zhì)成分的表達［6］。研究表明，SOX-9單倍體功能不全可引起嚴重的軟骨發(fā)育不良、長骨彎曲等骨骼畸形，表明SOX-9對軟骨細胞具有重要的調(diào)控作用［7］。然而，關(guān)于SOX-9在椎間盤中的表達情況以及SOX-9與ADAMTS-4、ADAMTS-5相互作用對椎間盤退行性變的影響，目前研究較少。因此，本研究擬探討SOX-9和ADAMTS-4、ADAMTS-5在椎間盤退行性變中的作用及其相互之間的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

ADAMTS-5抗體（a6727）購自Sigma-Aldrich公司；ADAMTS-4抗體（sc-25582）、Ⅱ型膠原（COL2A1）抗體（sc-28887）、ACAN抗體（sc-25674）、β-actin抗體（sc-47778）和SOX-9抗體（sc-20095）購自Santa Cruz Biotechnology公司；軟骨寡聚物基質(zhì)蛋白（COMP）抗體（ab128893）購自Abcam公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）、SYBR Green premix（RR420A）購自TaKaRa公司。GeneAmp 9700型熒光定量PCR儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.2 臨床標(biāo)本采集和處理

組織標(biāo)本來源于40例因椎間盤退行性變或外傷后需行椎間盤摘除術(shù)的患者，標(biāo)本收集均獲得患者知情同意。對收集的標(biāo)本采用Pfirrmann分級［8］系統(tǒng)進行退行性變等級界定，將一部分標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定，通過HE染色、Masson染色和番紅O-固綠染色鑒定椎間盤組織退行性變程度，其中Ⅱ級7例，Ⅲ級13例，Ⅳ級15例，Ⅴ級5例；一部分標(biāo)本采用免疫組織化學(xué)染色觀察ADAMTS-4、ADAMTS-5的表達；一部分標(biāo)本組織用于分離髓核細胞；其余組織用于提取總蛋白及RNA。

1.3 人髓核細胞分離和培養(yǎng)

根據(jù)Risbud等［9］報道的髓核細胞提取方法從髓核組織中分離人髓核細胞。人髓核細胞采用含10%胎牛血清并添加抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)，72 h后觀察細胞貼壁情況并進行換液，以后每3 d換液1次，待細胞生長至約80%匯合時進行傳代或凍存，取2 ～ 6代的細胞進行實驗。

1.4 小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染和腺病毒感染

siSOX-9、siADAMTS-4、siADAMTS-5和FAM-siRNA均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染前1 d將髓核細胞均勻鋪于6孔板中，將siRNA和Lipofectamine 3000混合液加入細胞中，轉(zhuǎn)染后24 ～ 48 h收集細胞進行后續(xù)實驗。SOX-9過表達腺病毒購自上海漢恒生物科技有限公司，摸索最佳感染復(fù)數(shù)后直接加入細胞中，完成腺病毒感染。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

組織蛋白提?。航M織標(biāo)本離體后立即凍存于液氮，然后使用機械研磨將組織磨成粉末，加入含有蛋白酶抑制劑混合液的RIPA裂解液冰上裂解；細胞蛋白提?。核韬思毎麖呐囵B(yǎng)箱取出立即放在冰上冷卻，用預(yù)冷PBS洗滌3次，加入含有蛋白酶抑制劑混合液的RIPA裂解液，用細胞刮收集細胞及細胞裂解液。收集的裂解液于4℃條件下12 000 r/min（離心半徑8 cm）離心15 min取上清，采用BCA法測定蛋白濃度；加入蛋白上樣緩沖液，95℃加熱5 min，然后進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入相應(yīng)的一抗、二抗進行孵育，顯色后觀察，計算目的蛋白相對表達量。

1.6 實時熒光定量PCR

采用RNeasy mini spin columns（Qiagen公司）提取總RNA，測定濃度后取2 μg反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：cDNA模板、目的基因特異性正向和反向PCR引物、滅菌水和SYBR Green premix（TaKaRa公司）。反應(yīng)條件 ：95℃ 30 s；95℃5 s、60℃ 10 s、72℃ 25 s，40個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，組間比較采用Student’st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 椎間盤組織病理學(xué)觀察

根據(jù)Priffmann分級系統(tǒng)，將Ⅱ級退行性變組織設(shè)為對照，通過HE染色、Masson染色和番紅O-固綠染色觀察椎間盤組織退行性變程度，結(jié)果顯示，正常組織（Ⅱ級）內(nèi)髓核細胞數(shù)量較多，為大小較為均一的類圓形軟骨樣細胞，膠原纖維排列規(guī)整，層次清晰，細胞外基質(zhì)ACAN含量豐富；而發(fā)生退行性變組織（Ⅳ級）內(nèi)細胞數(shù)目少，散在稀疏，膠原纖維排列紊亂，各層之間出現(xiàn)斷裂、崩解，ACAN含量明顯減少，符合椎間盤退行性變的組織學(xué)變化（圖1）。

圖1 椎間盤組織病理染色Fig. 1 Histopathological staining of intervertebral disc tissues

2.2 椎間盤組織中ADAMTS的表達

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，ADAMTS-4、ADAMTS-5主要位于胞質(zhì)中（圖2a），發(fā)生退行性變的組織中二者的表達水平均高于Ⅱ級組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，圖2b）。實時熒光定量PCR（圖2c）和蛋白質(zhì)印跡分析（圖2d）結(jié)果顯示，發(fā)生退行性變的組織中ADAMTS-4、ADAMTS-5的表達在mRNA和蛋白水平均上調(diào)，與Ⅱ級組織相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖2 椎間盤組織中ADAMTS的表達Fig. 2 Expression of ADAMTS in intervertebral disc tissues

2.3 椎間盤組織中SOX-9和細胞外基質(zhì)成分的表達

通過免疫組織化學(xué)染色及半定量分析（圖3a，b）、實時熒光定量PCR（圖3c）和蛋白質(zhì)印跡分析（圖3d）檢測椎間盤組織中SOX-9和細胞外基質(zhì)成分（COL2A1、ACAN和COMP）的表達，結(jié)果顯示，發(fā)生退行性變的組織中SOX-9、COL2A1、ACAN和COMP的mRNA及蛋白表達均低于Ⅱ級組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖3 椎間盤組織中SOX-9和細胞外基質(zhì)成分的表達Fig. 3 Expression of SOX-9 and extracellular matrix component in intervertebral disc tissues

2.4 SOX-9對人髓核細胞ADAMTSs、COL2A1、ACAN和COMP表達的影響

提取正常椎間盤組織中髓核細胞進行原代培養(yǎng)（對照組），利用siRNA干擾或腺病毒過表達載體調(diào)節(jié)髓核細胞內(nèi)SOX-9表達，通過siRNA陰性攜帶FAM［SOX-9（-）］及腺病毒攜帶GFP熒光［SOX-9（+）］表達可見轉(zhuǎn)染效率達80%（圖4a），同時蛋白質(zhì)印跡分析證實干擾和過表達效率可靠（圖4b）。蛋白質(zhì)印跡分析（圖4b）和實時熒光定量PCR（圖4c）結(jié)果顯示，干擾SOX-9表達后，細胞外基質(zhì)成分COL2A1、ACAN和COMP表達下調(diào)，同時基質(zhì)降解酶ADAMTS-4、ADAMTS-5表達上調(diào)；而SOX-9過表達可抑制基質(zhì)降解酶ADAMTS-4、ADAMTS-5表達，并促使細胞外基質(zhì)成分COL2A1、ACAN和COMP表達上調(diào)。上述結(jié)果提示，SOX-9在髓核細胞中可促進細胞外基質(zhì)成分合成，并抑制降解反應(yīng)。

圖4 SOX-9對人髓核細胞ADAMTS、COL2A1、ACAN和COMP表達的影響Fig. 4 Effect of SOX-9 on expression of ADAMTS，COL2A1，ACAN and COMP

2.5 SOX-9通過ADAMTS調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)成分的表達

蛋白質(zhì)印跡分析（圖5a）和實時熒光定量PCR檢測（圖5e）結(jié)果顯示，抑制ADAMTS-4、ADAMTS-5表達后，COL2A1、ACAN和COMP表達均上調(diào)，表明COL2A1、ACAN和COMP的表達受到ADAMTS-4、ADAMTS-5調(diào)控。蛋白質(zhì)印跡分析（圖5b，c）結(jié)果顯示單一抑制SOX-9活性可下調(diào)COL2A1、ACAN和COMP表達，而同時抑制SOX-9和ADAMTS-4/ADAMTS-5后，COL2A1、ACAN及COMP表達相較于單一抑制SOX-9后上升，表明SOX-9通過ADAMTS-4、ADAMTS-5影響細胞外基質(zhì)成分的表達。雙熒光素酶報告基因檢測（圖5d）結(jié)果顯示，SOX-9可下調(diào)ADAMTS-4、ADAMTS-5啟動子活性，表明SOX-9可直接調(diào)控ADAMTS-4、ADAMTS-5表達。

圖5 SOX-9通過ADAMTS影響細胞外基質(zhì)成分的表達Fig. 5 SOX-9 affects expression of extracellular matrix components through ADAMTS

3 討 論

有研究表明，ADAMTS家族中的ADAMTS-4和ADAMTS-5可通過酶切位點Glu373、Glu1545、Glu1714、Glu1819和Glu1919等降解ACAN，引發(fā)細胞外基質(zhì)合成與分解代謝失衡，在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用［5，10］。Tian等［11］證實上述2種酶在椎間盤退行性變中的作用主要表現(xiàn)為促進細胞外基質(zhì)，如ACAN、COMP、COL2A1等的降解。本研究結(jié)果顯示，抑制髓核細胞內(nèi)ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達可引起ACAN、COMP、COL2A1在蛋白及mRNA水平的整體上調(diào)，提示ADAMTS-4和ADAMTS-5不僅在蛋白水平發(fā)揮降解作用，同時在mRNA水平抑制轉(zhuǎn)錄活性，表明ADAMTS-4和ADAMTS-5促進ACAN、COMP、COL2A1降解的同時抑制合成，在細胞外基質(zhì)成分的代謝中發(fā)揮雙重作用，協(xié)同促進椎間盤退行性變的發(fā)生。

轉(zhuǎn)錄因子SOX-9已被證實在軟骨細胞中發(fā)揮多重作用，其表達失調(diào)與骨關(guān)節(jié)炎息息相關(guān)［12］。鑒于關(guān)節(jié)炎與椎間盤退行性變發(fā)生機制類似，且髓核細胞與軟骨細胞具有一定同源性，本研究組推測SOX-9在椎間盤中具有同等地位。有研究報道，SOX-9可促進ACAN、COMP、COL2A1等細胞外基質(zhì)成分表達，而ADAMTS顯著抑制ACAN、COMP、COL2A1表達［13-14］，與本研究結(jié)果一致，表明SOX-9和ADAMTS在調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)表達層面存在一定競爭關(guān)系。關(guān)于SOX-9和ADAMTS之間是否存在調(diào)控關(guān)系目前尚未有統(tǒng)一觀點，Kadaja等［15］通過染色質(zhì)免疫沉淀測序（CHIP-seq）發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子SOX-9可結(jié)合ADAMTS家族成員，而后通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）證實ADAMTS在SOX-9基因敲除小鼠中表達明顯上調(diào)，表明ADAMTS表達受到SOX-9調(diào)控，但具體機制仍不明確。本研究直接在細胞層面通過基因過表達和干擾技術(shù)探索SOX-9對ADAMTS的調(diào)控作用關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制SOX-9表達促使ADAMTS表達上調(diào)，而過表達SOX-9后ADAMTS表達明顯下調(diào)。結(jié)合Kadaja等［15］的研究結(jié)果，推測轉(zhuǎn)錄因子SOX-9可能通過結(jié)合ADAMTS啟動子位點進而影響啟動子活性的方式調(diào)節(jié)ADAMTS轉(zhuǎn)錄水平。為此，本研究開展雙熒光素酶報告基因檢測試驗，證實SOX-9確實被募集到ADAMTS啟動子位點，降低了啟動子活性，表明SOX-9可通過直接作用方式抑制ADAMTS的表達。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生退行性變的椎間盤組織中ADAMTS對細胞外基質(zhì)成分的表達調(diào)控具有雙重作用，表現(xiàn)為促進降解并抑制合成。SOX-9在椎間盤內(nèi)通過直接作用的方式影響ADAMTS表達，進而調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)成分的表達，最終發(fā)揮保護椎間盤的作用。關(guān)于椎間盤發(fā)生退行性變時SOX-9表達減少及功能紊亂的機制仍需進一步研究。