望運(yùn)滔 王營(yíng)娟 白艷紅
(1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450000;2. 河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 鄭州 450000;3. 河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 鄭州 450000)
蛋白質(zhì)是關(guān)系到人類健康的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一,在食品加工中,蛋白質(zhì)經(jīng)常被用作食品乳化劑。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)具有親水性和疏水性基團(tuán),可以向油水界面遷移,并且蛋白質(zhì)會(huì)在界面展開(kāi)并重新排列,疏水基團(tuán)朝向油相移動(dòng),而親水性基團(tuán)朝向水相移動(dòng),其獨(dú)特的界面性質(zhì)可以降低油水界面張力,且在界面處的蛋白質(zhì)聚集在油滴周圍形成黏彈性膜[1],能夠阻止油滴聚集,從而穩(wěn)定乳液[2]。蛋白質(zhì)所穩(wěn)定的乳化液在食品加工中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值,如人造奶油、冰淇淋和蛋黃醬等[3],因此蛋白質(zhì)作為乳化劑被廣泛研究。
然而天然蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)不能滿足實(shí)際生產(chǎn)加工需求,如某些蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性差等,并且在加工過(guò)程中容易受到環(huán)境因素(溶液pH值,離子強(qiáng)度和溫度)的影響而變性[4],從而影響其功能特性及在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此,為了改善蛋白質(zhì)的乳化性,需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性處理。文章對(duì)國(guó)內(nèi)外最新蛋白質(zhì)改性以提高其乳化性的研究進(jìn)行綜述,以期為蛋白質(zhì)改性的應(yīng)用及研究提供一定理論參考。
蛋白質(zhì)特異的空間結(jié)構(gòu)決定其獨(dú)特的功能性質(zhì),而影響蛋白質(zhì)乳化性的內(nèi)部因素主要包括蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、分子大小、疏水性、表面電荷量等[5]。采用高新技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾就是通過(guò)物理和化學(xué)作用力對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行人為修飾,使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,柔性結(jié)構(gòu)展開(kāi),剛?cè)嵝詤^(qū)域重排,非極性基團(tuán)暴露,從而改善蛋白質(zhì)在油水界面的吸附特性[6]。
物理改性主要是通過(guò)超聲波、高壓均質(zhì)、擠壓蒸煮、水動(dòng)力空化等物理手段改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)分子間的聚集狀態(tài),從而改善其乳化特性。物理改性的優(yōu)點(diǎn)在于廉價(jià)、安全、處理時(shí)間短以及對(duì)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)性能影響小[7]。
2.1.1 超聲處理改善蛋白乳化性 超聲處理過(guò)程中產(chǎn)生的空化效應(yīng)可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)聚集和展開(kāi)[8],改變蛋白質(zhì)分子之間的相互作用,如疏水相互作用,氫鍵和二硫鍵等,增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子的柔韌性并提高蛋白質(zhì)在油水界面的吸附能力,改善蛋白質(zhì)的乳化性[9]。目前,單獨(dú)超聲處理已被廣泛應(yīng)用于改善花生蛋白[10]、核桃蛋白[11]、向日葵蛋白[12]、肌原纖維蛋白[13]以及鱈魚(yú)蛋白[14]等蛋白質(zhì)的乳化性。結(jié)果表明單獨(dú)超聲處理可以有效地改善蛋白質(zhì)的乳化性,但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)以及超聲功率過(guò)高會(huì)使蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性,降低乳化性[15]。
超聲處理也可以與一種或多種改性方法相結(jié)合來(lái)改善蛋白質(zhì)的乳化性,Shen等[16]采用超聲協(xié)同熱處理改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì),與未處理的乳清蛋白相比,單獨(dú)超聲和加熱處理使乳清蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性都分別提高了1.5倍和2.0倍,二者有相同的改善作用,沒(méi)有明顯差異。而對(duì)加熱后的乳清蛋白進(jìn)行超聲處理后,它的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別是未處理組1.9倍和2.5倍,乳清蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值,表明超聲協(xié)同熱處理可以更有效地改善蛋白質(zhì)的乳化性。超聲協(xié)同其他方法改性蛋白質(zhì)可以集合多種改性方法的優(yōu)點(diǎn)或彌補(bǔ)單一改性效果的不足,最大程度提高蛋白質(zhì)的乳化性。
2.1.2 高壓均質(zhì)改善蛋白質(zhì)的乳化性 高壓均質(zhì)是一種非熱加工技術(shù)[17],主要包括靜態(tài)高壓均質(zhì)和動(dòng)態(tài)高壓均質(zhì)。靜態(tài)高壓均質(zhì)改性蛋白質(zhì)是指將蛋白質(zhì)放置在具有靜電場(chǎng)的密閉容器內(nèi),在常溫條件下對(duì)蛋白質(zhì)施加一定靜壓力,通過(guò)破壞蛋白質(zhì)分子的非共價(jià)鍵,改變其理化性質(zhì)[18]。動(dòng)態(tài)高壓均質(zhì)改性蛋白質(zhì)是指蛋白質(zhì)溶液通過(guò)高壓閥流動(dòng)時(shí),高壓產(chǎn)生的強(qiáng)烈剪切力、空化和湍流作用會(huì)使蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而改變其功能性質(zhì)[19]。高壓均質(zhì)技術(shù)因其高效快捷的作用方式,經(jīng)濟(jì)性、便捷性和安全性,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。
Ma等[20]通過(guò)高壓均質(zhì)改變鱈魚(yú)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)提高其油水乳化液的貯藏穩(wěn)定性。高壓均質(zhì)處理后鱈魚(yú)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi),疏水性和親水性基團(tuán)的暴露可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)在油水界面的吸附作用,提高鱈魚(yú)蛋白的乳化穩(wěn)定性。Cha等[19]發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)處理可以顯著提高由貽貝肌原纖維蛋白和卵磷脂穩(wěn)定O/W乳狀液的乳化活性和穩(wěn)定性。當(dāng)壓力從40 MPa增加到120 MPa時(shí),乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)逐漸增大,在80 MPa時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)楦邏壕|(zhì)處理后,蛋白質(zhì)的溶解度增加,乳液表觀黏度和電荷量增大。溶解性的增加可以促進(jìn)蛋白質(zhì)在油水界面的擴(kuò)散速度,乳狀液黏度的改善有助于降低液滴的懸浮速度,使其保持較好的穩(wěn)定性,而分散的油滴表面電荷增加,乳液液滴之間斥力增大,不易發(fā)生于凝結(jié)或絮凝,使穩(wěn)定性提高。
2.1.3 擠壓蒸煮技術(shù) 擠壓蒸煮改性蛋白質(zhì)是將蛋白質(zhì)放在高溫、高壓和機(jī)械剪切力條件下,在短時(shí)間內(nèi)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)和聚集的技術(shù)[21-22]。擠壓蒸煮過(guò)程中產(chǎn)生的高溫會(huì)改變蛋白質(zhì)表面親水和疏水性位點(diǎn)的分布規(guī)律,使蛋白質(zhì)的官能團(tuán)暴露出來(lái),而蛋白質(zhì)的適當(dāng)變性通常會(huì)提高蛋白質(zhì)的表面活性[23],有助于其在油—水界面處的吸附,并形成一層物理層,從而提高乳化穩(wěn)定性。
Mozafarpour等[24]研究了擠壓溫度(110,130,160 ℃)和水分含量(18%,25%)對(duì)大豆?jié)饪s蛋白結(jié)構(gòu)和乳化性能的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)水分含量為18%時(shí),蛋白質(zhì)的乳化活性隨著溫度的升高而增大,在160 ℃時(shí)達(dá)到最大值,大約提高了2.2倍,而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中的水分含量增加到25%時(shí),乳化活性大約提高了1.6倍,隨著溫度的升高,乳化活性變化不顯著,產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)水分含量為18%時(shí),擠壓蒸煮技術(shù)可以使大豆蛋白產(chǎn)生更多新的疏水位點(diǎn)并且蛋白質(zhì)柔性增強(qiáng),更多的疏水性基團(tuán)可以與油相更好接觸,并且結(jié)構(gòu)更靈活的蛋白質(zhì)能在油水界面更快吸附,使其具有更高的乳化活性。而當(dāng)水分含量為25%時(shí),蛋白溶液中水分含量增多,蛋白質(zhì)的流動(dòng)性更強(qiáng),由于蛋白質(zhì)在擠壓機(jī)內(nèi)平均停留時(shí)間較短,蛋白質(zhì)變性程度減弱,蛋白質(zhì)分子暴露出較少的疏水性基團(tuán),乳化性提高程度相對(duì)較低。因此,在擠壓蒸煮過(guò)程中,蛋白質(zhì)的含水量是影響改性后蛋白質(zhì)乳化性的一個(gè)重要因素。
另外,擠壓蒸煮技術(shù)也可以通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng),進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的乳化性。Chen等[25]發(fā)現(xiàn)由花生蛋白穩(wěn)定乳狀液的體積平均粒徑(D43)為29.4 μm。當(dāng)對(duì)花生蛋白進(jìn)行單一酶解處理,水解程度為0.9%時(shí),所穩(wěn)定乳液的D43為20.6 μm。而對(duì)于擠壓蒸煮后的花生蛋白,在相同酶解條件下,酶解程度為6.2%, 酶解產(chǎn)物所穩(wěn)定乳液的D43為4.5 μm,并且形成的乳狀液液滴分布均勻,表明經(jīng)擠壓蒸煮預(yù)處理后花生蛋白酶解所得產(chǎn)物具有更好的乳化性。這是因?yàn)閿D壓預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的剪切力和高溫可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象,蛋白質(zhì)分子展開(kāi)以及重新排列,使其形成易被蛋白酶利用的層狀結(jié)構(gòu),在相同的酶解條件下,與單一酶解相比,擠壓蒸煮之后蛋白的水解程度顯著升高,木瓜蛋白酶可以更有效地將擠壓蒸煮之后的不可溶蛋白質(zhì)多肽解聚成較小可溶性多肽,而蛋白質(zhì)的溶解度提高有利于其在油水界面的吸附,進(jìn)而改善其乳化性。這些結(jié)果表明,擠壓蒸煮協(xié)同酶解處理比單一的酶解處理能更有效改善花生蛋白的乳化性能。
2.1.4 旋流空化 旋流空化是一種新興的工藝技術(shù),旋流空化可以產(chǎn)生與超聲相同的空化現(xiàn)象[26]??栈莸钠屏褧?huì)引發(fā)各種物理化學(xué)效應(yīng),包括產(chǎn)生剪切力、沖擊波、高溫、壓力以及自由基。旋流空化產(chǎn)生的化學(xué)效果優(yōu)于超聲空化,并且旋流空化的能源效率高于超聲空化[27]。目前旋流空化技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)改性研究。Yang等[27]研究了不同壓力和時(shí)間的旋流空化對(duì)大豆分離蛋白(SPI)乳化性質(zhì)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未處理的SPI相比,處理后的SPI具有更高的乳化活性和乳化穩(wěn)定性,油滴尺寸和絮凝指數(shù)減小,界面吸附蛋白含量增大,表明旋流空化技術(shù)可能是改善大豆蛋白乳化性的一種有效技術(shù)。
化學(xué)改性蛋白質(zhì)主要是通過(guò)化學(xué)試劑作用使蛋白質(zhì)肽鏈部分?jǐn)嗔鸦蛞胄碌幕钚怨倌軋F(tuán)使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、電荷特性和親疏水基團(tuán)等發(fā)生改變,從而對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效修飾[28],主要包括pH偏移、磷酸化反應(yīng)等。
2.2.1 pH偏移對(duì)蛋白質(zhì)乳化性的影響 pH偏移改性蛋白質(zhì)是指在極端pH條件下使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi),然后在中性環(huán)境中誘導(dǎo)蛋白重新折疊[29]。蛋白質(zhì)經(jīng)歷展開(kāi)—再折疊過(guò)程,分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生部分改變,乳化性從而改變。研究[30]表明,大豆分離蛋白、豌豆蛋白和肌漿蛋白經(jīng)過(guò)pH偏移處理后,其功能特性顯著增強(qiáng)。Chen等[30]將乳清蛋白在pH 12條件下反應(yīng)1 h,隨后調(diào)回中性誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)折疊。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該條件下處理后花生蛋白的乳化活性指數(shù)從7.073 m2/g增加到了7.193 m2/g,乳化穩(wěn)定性指數(shù)從66.5 min增加到了73.34 min。這是因?yàn)閜H 12偏離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)較強(qiáng)的靜電排斥作用,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi),疏水基團(tuán)或區(qū)域暴露,蛋白質(zhì)分子靈活性增加。而這些改變均可以促進(jìn)乳清蛋白分子與水相及油相的接觸,增強(qiáng)其界面吸附特性。
另外,研究還發(fā)現(xiàn)pH—偏移協(xié)同溫?zé)崽幚砜梢愿行У馗纳频鞍踪|(zhì)的乳化特性。Wang等[31]將大麻種子蛋白在不同溫度(20~60 ℃) pH 12條件下處理5 min使其結(jié)構(gòu)展開(kāi),后將溶液的pH值調(diào)回pH 7誘導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊。結(jié)果發(fā)現(xiàn),未處理組蛋白質(zhì)的乳化活性指數(shù)為5.63 m2/g,pH 12處理之后蛋白質(zhì)的乳化活性指數(shù)為5.43 m2/g,表明單獨(dú)在pH 12條件下處理并沒(méi)有顯著改善蛋白質(zhì)的乳化性。而對(duì)于pH 12結(jié)合溫?zé)崽幚砀男缘牡鞍踪|(zhì),隨著熱處理溫度的升高(20~60 ℃),蛋白質(zhì)的乳化活性指數(shù)從5.43 m2/g增加到7.39 m2/g,蛋白質(zhì)的TSI值由8.81降低至1.08,共聚焦顯微鏡下油滴尺寸逐漸減小,且分布更均勻,表明pH 12結(jié)合溫?zé)崽幚砟芨@著改善蛋白質(zhì)的乳化性。溶解度和表面疏水性是影響蛋白質(zhì)乳化性的重要因素。單一的pH 12處理時(shí),蛋白質(zhì)溶解度改善不顯著(P>0.05),并且pH偏移過(guò)程中屏蔽了帶電基團(tuán),不利于蛋白與水之間的相互作用,進(jìn)而不能明顯改善蛋白質(zhì)的乳化性。而pH—偏移協(xié)同溫?zé)崽幚碇蟮牡鞍踪|(zhì)溶解度和表面疏水性明顯增大,二者的增加使蛋白質(zhì)的親水和親油性顯著增強(qiáng),從而使蛋白質(zhì)的乳化性增強(qiáng)。
2.2.2 磷酸化反應(yīng) 磷酸可以選擇性地與蛋白質(zhì)的側(cè)鏈基團(tuán),如絲氨酸、蘇氨酸、絡(luò)氨酸中的—OH基團(tuán),賴氨酸的ε-NH2,組氨酸咪唑環(huán)的1,3個(gè)氮原子發(fā)生反應(yīng),在蛋白質(zhì)分子表面引入更多的負(fù)電荷,增強(qiáng)蛋白質(zhì)的水化作用,從而提高蛋白質(zhì)的乳化性[32]。
磷酸化反應(yīng)改善蛋白乳化性的關(guān)鍵因素是控制其磷酸化程度。Hu等[32]將米糠蛋白在不同pH值(3,5,7,9,11)條件下采用三偏磷酸鈉進(jìn)行水熱磷酸化反應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 9.0條件下磷酸化所得米糠蛋白具有最高的溶解性和乳化活性,米糠蛋白的溶解度和乳化活性分別提高了8.7倍和8.1倍。一方面,隨著磷酸鹽含量的增加,米糠蛋白表面的凈負(fù)電荷增加。在乳液的制備過(guò)程中,液滴的電位絕對(duì)值越大,液滴的靜電斥力越強(qiáng),液滴之間不易聚集和結(jié)合。另一方面,親水性/疏水性平衡也可以影響蛋白質(zhì)的乳化活性,蛋白質(zhì)被吸收并迅速移動(dòng)到油/水界面后,可通過(guò)疏水相互作用來(lái)穩(wěn)定油滴的聚集狀態(tài)。磷酸化處理使米糠蛋白的表面疏水性增大,親水親油平衡較好,油滴更容易被蛋白質(zhì)固定,從而使其乳化性得到改善。同理, Sánchez-Reséndiz等[33]采用三偏磷酸鈉對(duì)花生蛋白和大豆蛋白進(jìn)行磷酸化處理也得到類似結(jié)論。
酶法改性主要是指通過(guò)酶解反應(yīng)使蛋白質(zhì)分子中多肽鏈斷裂、分子內(nèi)或分子間交聯(lián)以及蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變,從而使蛋白質(zhì)分子的組成、空間結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)發(fā)生變化,進(jìn)而改善其功能特性[34]。酶法改性常用酶的種類主要有蛋白酶[35]、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶[36]、胰蛋白酶[37]等。
選取最佳酶解反應(yīng)條件并控制蛋白水解度是改善蛋白質(zhì)乳化性的關(guān)鍵因素。Ghribia等[38]研究了堿性蛋白酶對(duì)鷹嘴豆分離蛋白乳化性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的乳化性隨著酶解程度的增加先增大后減小,在蛋白水解度較低(4%)時(shí),鷹嘴豆蛋白的乳化活性大約是未酶解蛋白質(zhì)的1.85倍。堿性蛋白酶可以將鷹嘴豆蛋白分解成小分子多肽,而多肽分子具有更強(qiáng)的靈活性,更易吸附到油水界面。而當(dāng)水解度>4%時(shí),蛋白質(zhì)的乳化活性逐漸下降,可能是因?yàn)槊附獬潭冗^(guò)高時(shí),水解過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)多的小分子多肽在界面的相互作用減弱,界面膜黏彈性下降,并且由于多肽分子間的電荷排斥作用,低分子量肽在界面上既不能展開(kāi)也不能重新定向排列,導(dǎo)致乳化性降低[38]。Liu等[39]發(fā)現(xiàn)經(jīng)微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)改性后的蠶豆分離蛋白是一種高效乳化劑,經(jīng)最佳改性時(shí)間(60 min)改性后的蠶豆分離蛋白,在改善乳液脂質(zhì)氧化穩(wěn)定性的同時(shí),還可保持乳液物理穩(wěn)定性,但延長(zhǎng)MTG處理時(shí)間(>60 min)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性,過(guò)高的表面疏水性會(huì)降低蛋白質(zhì)的水溶性和表面活性,不利于蛋白質(zhì)在油水界面吸附,從而減弱其乳化性。這些研究表明采用酶法改善蛋白乳化性時(shí),需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)來(lái)控制反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)條件。
酶法改性也可以和物理方法(高壓微射流,超微粉碎)相結(jié)合來(lái)改善蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)。張雪春等[40]采用胰蛋白酶處理花生蛋白得到花生蛋白酶解液,然后對(duì)酶解液進(jìn)行高壓均質(zhì)處理,研究均質(zhì)壓力對(duì)花生蛋白酶解液乳化性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在均質(zhì)壓力為100 MPa時(shí),乳化性達(dá)到最高。這可能是由于高壓均質(zhì)可使花生蛋白酶解物的粒徑變小,溶解性增大;同時(shí)蛋白酶解物的柔性增大,吸附到乳狀液表面量增多,乳化性增強(qiáng)。但均質(zhì)壓力過(guò)大時(shí)(>100 MPa),可能會(huì)使花生蛋白酶解物聚集,乳化性下降。Wang等[41]研究了超微粉碎處理時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)乳清分離蛋白結(jié)構(gòu)、理化及乳化性能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)超微粉碎結(jié)合轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理后乳清蛋白的乳化性和黏度高于單獨(dú)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理乳清蛋白的乳化特性和黏度。這是因?yàn)槌?xì)粉碎處理可以提高轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)度,從而改善了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)乳清蛋白的乳化性。
通過(guò)物理、化學(xué)以及酶法改性對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,可以得到乳化性較好的蛋白質(zhì),對(duì)于單一改性方法,控制改性過(guò)程參數(shù)是得到具有理想乳化性蛋白質(zhì)的關(guān)鍵。隨著單一物理化學(xué)方法被廣泛用于修飾蛋白質(zhì),多種高新技術(shù)相結(jié)合來(lái)改善蛋白質(zhì)的乳化性是今后蛋白質(zhì)改性研究的一個(gè)主要發(fā)展方向,且研究協(xié)同相互作用的內(nèi)在機(jī)理是以后研究需要解決的問(wèn)題。另外,隨著更多新型技術(shù)的誕生,采用更新穎和更高新的技術(shù)進(jìn)而更有效地改善蛋白質(zhì)的乳化性也是今后的一個(gè)研究方向。