鄭興飛 胡建林 董華林 王紅波 查中萍 殷得所 周黎 徐得澤

摘要 隨著人口的不斷增加以及生態(tài)系統(tǒng)的逐漸惡化，糧食安全問題成了近年來討論的熱點(diǎn)。糧食作物的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)是育種家的重要育種目標(biāo)。在我國(guó)，由于農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的不合理以及栽培模式的落后，使得糧食安全問題更加嚴(yán)峻。水稻是最重要的糧食作物之一，確保水稻的持續(xù)高產(chǎn)是保障糧食安全的關(guān)鍵。氮是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要礦質(zhì)元素，過少或過多施用氮肥均會(huì)造成作物的減產(chǎn)。因此，對(duì)水稻氮素吸收、利用與分配進(jìn)行深入研究，有利推進(jìn)化肥施用的精細(xì)調(diào)控，是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)研究的幾個(gè)必須課題。綜述了水稻氮高效相關(guān)基因的研究進(jìn)展，以期為水稻氮高效育種利用提供參考。

關(guān)鍵詞 水稻;氮素;基因;分子機(jī)理

中圖分類號(hào) S511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）24-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research Progress and Prospect of Genes Related to Nitrogen Efficient Utilization in Rice

ZHENG Xingfei，HU Jianlin，DONG Hualin et al （Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement，F(xiàn)ood Crops Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan，Hubei 430064）

Abstract With the continuous increase of population and the gradual deterioration of ecosystems，the issue of food security has become a hot topic in recent years.In China，the problem of food security is more serious due to the irrational agricultural structure，backward cultivation models，and large agricultural inputs and low output.Rice is one of the most important food crops.To ensure the sustainable high yield of rice is the key to ensure food security.Nitrogen is an essential element that affects plant growth and development.Too little or too much application of nitrogen fertilizer would reduce crop yield.The following are several necessary topics for the realization of modernization of ecoagriculture： indepth research on rice nitrogen absorption，utilization and distribution and the finetuning of fertilizer application and improve yield and quality of crops.We reviewed the research progress of nitrogen efficiency related genes，aiming at providing references for nitrogen efficiency utilization breeding in rice.

Key words Rice;Nitrogen;Gene;Molecular mechanisms

基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0102103，2018YFD0100806）;糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2018lzjj02，2018lzjj03）;湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目（2016-620-000-001-005）。

氮（N）素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的必需元素之一，也是植物從土壤中吸收最多的元素。氮素構(gòu)成了植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、氨基酸和激素等。這些物質(zhì)參與了植物體內(nèi)一系列的生理代謝調(diào)控，控制植物的各種生命活動(dòng)以及產(chǎn)量構(gòu)成。目前在我國(guó)，由于氮肥的不合理施用導(dǎo)致環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重[1]。氮肥的過多施用會(huì)出現(xiàn)以下幾個(gè)主要問題：首先，導(dǎo)致土壤中水勢(shì)下降，造成植物水分吸收困難，葉片萎蔫，在籽粒充實(shí)期過多施用氮肥，甚至?xí)?dǎo)致籽粒吸水不足，造成癟粒;其次，會(huì)產(chǎn)生氣體毒害，破壞臭氧層;另外，還可導(dǎo)致水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化等環(huán)節(jié)污染問題。在我國(guó)，氮肥的施用量已平均達(dá)到了180 kg/hm2，然而氮素的利用率卻只有28%～35%，比全球氮素平均利用水平低15%～20%[1-2]。根據(jù)《中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒》1980—2014年，我國(guó)的氮肥施用量增長(zhǎng)了近3倍，而糧食的總產(chǎn)量?jī)H增加了83%。研究水稻氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、分配的分子機(jī)理，可以從合理、科學(xué)施肥和培育高效氮素利用品種等方面來改良目前的農(nóng)業(yè)種植模式。同時(shí)，減少氮肥施用，提高氮素利用率，減輕環(huán)境污染，減少農(nóng)業(yè)成本也是現(xiàn)在重要的育種目標(biāo)之一[3-4]。

植物能夠利用的氮素主要有NH4+ 和 NO3-2種。目前，關(guān)于植物氮素高效利用的研究主要集中在根系對(duì)環(huán)境中氮素的吸收能力上[5]。在模式植物擬南芥中，利用突變體材料鑒定出一系列轉(zhuǎn)運(yùn)NH4+的AtAMT的基因和轉(zhuǎn)運(yùn)NO3-的AtNRT基因，并對(duì)這些基因與NH4+和NO3-的親和能力進(jìn)行了一系列的研究[6-7]。而在水稻中，由于表型鑒定困難，利用正向遺傳學(xué)的手段僅鑒定出少量氮素吸收相關(guān)基因。鑒于此，筆者在總結(jié)水稻氮素吸收利用的特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，對(duì)水稻氮素利用相關(guān)基因研究進(jìn)行總結(jié)展望。

1 水稻氮素吸收特點(diǎn)

植物對(duì)氮素的利用包括以下幾個(gè)主要步驟：吸收、同化和運(yùn)輸?shù)?。?dāng)葉片進(jìn)入衰老期后，同時(shí)還伴隨著氮素的循環(huán)和再分配。目前，在模式植物擬南芥和水稻中，研究比較深入的是氮素的吸收和同化，這2個(gè)步驟也決定了植物從外界攝取氮素的能力，是植物氮素利用率的關(guān)鍵限制因子。在土壤中，NH4+和NO3-的分布隨著土壤環(huán)境的變化而變動(dòng)，其中最大的影響因素是土壤的pH[8]。因此，植物在長(zhǎng)期的演化過程中，對(duì)土壤pH的適應(yīng)性決定了其在特定條件下偏好吸收的氮素類型。一般而言，適應(yīng)偏酸性、還原性土壤的植物偏好吸收NH4+，而適應(yīng)偏堿性土壤的植物偏好吸收NO3-[9]。因此，在不同的土壤條件下，施用不同類型的氮肥也有利于提高植物的利用率。

關(guān)于水稻氮素吸收的研究，Kronzucker等[10]利用13N同位素示蹤法研究銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻對(duì)硝態(tài)氮的吸收大于銨態(tài)氮。何文壽等[11]研究發(fā)現(xiàn)，從水稻移栽到開始分蘗，銨的吸收比例為53.5%，分蘗期吸收比例為71.8%，拔節(jié)期到乳熟期銨態(tài)氮與硝態(tài)氮吸收量基本一致，在蠟熟期吸收比例為57.6%。Yoneyama等[8]利用同位素示蹤法對(duì)水稻全生育期（約150 d）氮素吸收與分配情況進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到籽粒充實(shí)階段葉片生長(zhǎng)、分蘗形成、根系伸長(zhǎng)和小穗的分化等階段所需的氮源中，有50%來源于成熟的器官;這些成熟的器官在衰老階段將氮源以蛋白質(zhì)、氨基酸或含氮化合物的形式，通過韌皮部篩管運(yùn)輸?shù)秸谏L(zhǎng)的組織，以實(shí)現(xiàn)氮素的流轉(zhuǎn);另外一半的氮素來源于根系從土壤中吸收的無機(jī)氮源，通過同化作用之后，由木質(zhì)部導(dǎo)管向上運(yùn)輸;在水稻的籽粒充實(shí)階段，約80%的氮源來自于成熟器官的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)。

抽穗期是水稻根系各指標(biāo)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，抽穗后水稻的根系生長(zhǎng)緩慢、根系活力開始下降。生育后期，高的氮素供應(yīng)有利于維持根系活力、延緩根系衰老[12]。董桂春等[13]對(duì)不同抽穗期的水稻品種進(jìn)行了氮素吸收利用研究發(fā)現(xiàn)，生育期長(zhǎng)的品種吸氮能力強(qiáng)，并且促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)器官中氮素向穗部運(yùn)轉(zhuǎn)，降低莖葉中氮素分配比例，有利于生育期長(zhǎng)的品種氮素利用效率的提高。一些研究表明，全生育期較短的品種氮素籽粒生產(chǎn)效率較大[14]，生育期較長(zhǎng)的品種成熟期吸氮量較大[15-17]?？梢?，品種生育期的長(zhǎng)短與水稻氮素吸收利用有密切的關(guān)系，生育期不同的品種氮素吸收規(guī)律具有明顯的差異。葉利庭等[18]通過15N同位素標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)不同基因型水稻的氮積累量在齊穗期沒有差異，而在成熟期氮高效利用基因型在氮積累量具有優(yōu)勢(shì)。晏娟等[19]研究發(fā)現(xiàn)，增加施氮量提高了莖葉中15N的分配比例，但降低了15N在水稻籽粒中的分配比例，而在根中的分配比例不受施氮量和品種的影響。近年來，有關(guān)氮素在水稻不同器官的分配和轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)態(tài)變化已有不少研究，且已明確這些特征與產(chǎn)量的關(guān)系，認(rèn)為產(chǎn)量的高低與生育后期營(yíng)養(yǎng)器官中的氮素向經(jīng)濟(jì)器官的轉(zhuǎn)運(yùn)量有關(guān)。

2 水稻對(duì)銨態(tài)氮吸收與同化的分子機(jī)制

在土壤中，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量隨著土壤環(huán)境的變化而變化，因此植物進(jìn)化出針對(duì)不同氮源的2種吸收機(jī)制，這2種吸收機(jī)制保證了作物在不同環(huán)境下能夠感知土壤中氮素的狀態(tài)，從而響應(yīng)環(huán)境的變化，調(diào)整自身的吸收能力。目前，對(duì)植物吸收分子機(jī)制方面的研究，主要集中在模式植物擬南芥上，利用突變體材料，鑒定出了一系列植物銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ammonium transporter，AtAMT） 家族成員，他們大多在根系中表達(dá)，并且定位于質(zhì)膜，負(fù)責(zé)銨離子的高親和吸收[6]。

近年來，利用基因工程和正向遺傳學(xué)方法，在水稻中共鑒定到10個(gè)OsAMT基因，根據(jù)同源性的不同將其分為4類，3個(gè)OsAMT1、3個(gè)OsAMT2、3個(gè)OsAMT3和1個(gè)OsAMT4[20]。Sonoda等[21]利用同源比對(duì)的方法，克隆到水稻中與AtAMT同源的3條序列，分別命名為OsATM1∶1、OsATM1∶2和OsATM1∶3。在氮素吸收缺陷型酵母31019b表達(dá)這3個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)均能增強(qiáng)該突變體對(duì)氮素的吸收，結(jié)合OsATM1∶1，OsATM1∶2，OsATM1∶3的轉(zhuǎn)錄水平能夠受到銨態(tài)氮高效誘導(dǎo)，確認(rèn)這3個(gè)基因?qū)儆谒綩sAMT家族成員。Suenaga等[20]利用酵母突變體鑒定出OsAMT2.1具有NH4+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，同時(shí)研究表明，該基因在水稻的根系、莖中組成型表達(dá)，與介質(zhì)無機(jī)氮無關(guān);而OsAMT3.1表達(dá)相對(duì)較弱。因此推測(cè)，在與水稻NH4+吸收相關(guān)基因調(diào)控中，主要以O(shè)sAMT1家族為主，其余的形成1個(gè)小家族。此外，眾多學(xué)者在水稻中用15N標(biāo)記的銨態(tài)氮浸泡培養(yǎng)水稻，以觀察根系對(duì)銨態(tài)氮吸收和同化作用。研究表明，水稻根系通過OsAMT蛋白將NH4+轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，首先快速積累的是15N標(biāo)記的谷氨酰胺，這個(gè)過程是在谷氨酰胺合成酶1（GS1）的催化作用下完成，稱為NH4+的同化[22]。谷氨酰胺被轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體中，通過GS-GOGAT途徑（依賴鐵氧還蛋白的谷氨酸合成酶Fd-GOGAT或者依賴NADH的谷氨酸合成酶NADH-GOGAT）轉(zhuǎn)化成為谷氨酸[23]。此外，15N標(biāo)記天冬酰胺的含量逐漸積累，推測(cè)是由于谷氨酰胺含量的增加，在依賴谷氨酰胺的天冬酰胺合成酶1（OsAS1）的催化作用下合成天冬酰胺[24]。完成NH4+的同化之后，氮素以谷氨酰胺或者其他氨基酸的形式由木質(zhì)部向地上部分運(yùn)輸[8]。

3 水稻對(duì)硝態(tài)氮吸收與同化的分子機(jī)制

在水稻根系中存在著高親和力和低親和力2種不同的硝態(tài)氮吸收方式。當(dāng)土壤中硝態(tài)氮含量較低時(shí)，植物啟動(dòng)高親和硝態(tài)氮吸收機(jī)制;而當(dāng)土壤中硝態(tài)氮含量較高時(shí)，則以低親和硝態(tài)氮吸收機(jī)制為主，以維持植物體內(nèi)硝態(tài)氮的平衡。水稻硝態(tài)氮高親和轉(zhuǎn)運(yùn)是由NTR2基因家族編碼，與擬南芥中的AtNTR2高度同源。硝態(tài)氮低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)子由NTR1基因家族編碼，與擬南芥NTR1蛋白同源[25]。用15N標(biāo)記的硝態(tài)氮培養(yǎng)水稻，在根系中能夠陸續(xù)檢測(cè)到15N標(biāo)記的NH4+、谷氨酰胺和谷氨酸等，研究表明，水稻根系通過OsNTR蛋白將NO3-轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，大部分的NO3-被還原成NH4+，然后經(jīng)由GS-GOGAT途徑同化為谷氨酸，小部分的NO3-被依賴NADH的硝酸根還原酶（NADH-NR）還原成為NO2-，然后運(yùn)輸至質(zhì)體中，在依賴鐵氧還蛋白亞硝酸鹽還原酶（Fd-NiR）的作用下生成NH3。NH3在谷氨酰胺合成酶2（GS2）的作用下同化成為谷氨酰胺，然后由Fd-GOGAT途徑生成谷氨酸，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到木質(zhì)部[23]。

由此也能看出，植物對(duì)硝態(tài)氮的同化過程要比銨態(tài)氮更為復(fù)雜，需要消耗更多的能量，水稻對(duì)銨態(tài)氮的利用效率也高于硝態(tài)氮，因此被認(rèn)為是喜銨作物。此外，Yoneyama等[8]發(fā)現(xiàn)，由銨態(tài)氮同化產(chǎn)生的氨基酸大多運(yùn)輸至生長(zhǎng)旺盛的葉片，而由硝態(tài)氮同化產(chǎn)生的氨基酸則運(yùn)輸至成熟的葉片中。同時(shí)，AMT和NRT的轉(zhuǎn)錄水平能受到IDD、NLP和HY5等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，AMT和NRT蛋白能夠通過磷酸化修飾來調(diào)節(jié)根系對(duì)氮素的吸收能力[26]。為了嚴(yán)格控制根系的氮素吸收能力，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在各個(gè)層面上都受到嚴(yán)格的調(diào)控[27]。

4 反向遺傳學(xué)克隆氮素吸收關(guān)鍵基因

盡管水稻氮素吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的基因被定位，但這些基因多是基于擬南芥相關(guān)同源基因序列克隆獲得。由此鑒定的氮素相關(guān)基因盡管重要，但也相對(duì)保守，很難在水稻中直接進(jìn)行育種利用。從2001年農(nóng)業(yè)部948計(jì)劃“參與全球水稻分子育種計(jì)劃”項(xiàng)目開始，張啟發(fā)院士等逐步提出“綠色超級(jí)稻”的育種概念，其中重要目標(biāo)就是提高水稻肥料利用效率。

隨著水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的氮素吸收相關(guān)基因在水稻中的功能得到了有效的鑒定，為水稻的氮素高效育種提供了基因資源和種質(zhì)資源。2012年，Yan等[28]發(fā)現(xiàn)將水稻中的OsNAR2.1用RNAi的技術(shù)沉默之后，轉(zhuǎn)基因植株中和硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a表達(dá)量均下調(diào)，在施用相同含量硝態(tài)氮的情況下，轉(zhuǎn)基因水稻比對(duì)照材料生長(zhǎng)勢(shì)弱，對(duì)硝態(tài)氮的吸收能力下降。OsNAR2.1干涉之后不影響轉(zhuǎn)基因材料對(duì)銨態(tài)氮的吸收[28]。OsNAR2.1是OsNRT2家族成員（OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a）的伴侶蛋白，OsNAR2.1和OsNRT2形成的復(fù)合體是水稻中硝態(tài)氮高親和里轉(zhuǎn)運(yùn)子[9]。因此，提高水稻體內(nèi)OsNAR2.1的表達(dá)水平能夠增強(qiáng)水稻對(duì)硝態(tài)氮的吸收能力，同時(shí)也可以開發(fā)相關(guān)的標(biāo)記，作為水稻氮高效利用材料的篩選標(biāo)記。

目前，利用反向遺傳學(xué)的方法在水稻根系中鑒定到了一些氮素吸收的相關(guān)基因，但是氮素如何從根系向地上部分轉(zhuǎn)移，哪些蛋白參與了氮素的轉(zhuǎn)移仍然不清楚。有研究表明，OsNRT2.3存在可變剪切，編碼2種不同的蛋白產(chǎn)物OsNRT2.3a和OsNRT2.3b[28]。Tang等[29]發(fā)現(xiàn)OsNRT2.3a定位于根部木質(zhì)部中柱薄壁細(xì)胞的質(zhì)膜上，且在根系中高量表達(dá);原位雜交及組織表達(dá)模式分析表明，OsNRT2.3b主要在葉片的韌皮部表達(dá)。將水稻中的OsNRT2.3a用RNAi的技術(shù)沉默之后，轉(zhuǎn)基因植株根系中的氮素含量增加，莖稈中氮素含量減少，但是整個(gè)植株的總氮含量并沒有明顯的變化，說明OsNRT2.3a參與了氮素從根系向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)，但不影響植物對(duì)氮素的吸收。

雖然，利用反向遺傳學(xué)的手段進(jìn)行基因功能的分析存在一些局限性，其一般只研究單個(gè)或者少數(shù)基因的功能。但是不可否認(rèn)，反向遺傳學(xué)的手段給功能基因組學(xué)的研究帶來了很大的便利，能夠快速錨定其在作物中的候選基因并進(jìn)行功能驗(yàn)證，也有利于進(jìn)行分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究，結(jié)合現(xiàn)在成熟的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、表觀遺傳學(xué)的研究手段，可進(jìn)一步解析基因之間復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為植物育種提供更多的候選基因和種質(zhì)資源[30-31]。

48卷24期 鄭興飛等 水稻氮高效利用相關(guān)基因的研究進(jìn)展與展望

5 正向遺傳學(xué)挖掘氮素吸收關(guān)鍵基因

栽培稻主要包括秈稻和粳稻2個(gè)亞種。已有研究表明，相對(duì)秈稻而言，粳稻對(duì)氮肥的利用率低，對(duì)氮肥供應(yīng)敏感，且產(chǎn)量與氮肥供應(yīng)有顯著的相關(guān)性，這意味著粳稻種植需要更多的肥料施用，農(nóng)業(yè)成本更高[32]。秈粳稻之間對(duì)氮素利用效率差異的分子機(jī)制一直鮮見報(bào)道[33]。

2014年，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所傅向東實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了粳稻QZL2（Qianzhonglang 2）×秈稻NJ6（Nanjing 6）的重組自交系，其中RIL-D22這個(gè)株系表現(xiàn)為氮素敏感，RIL-D04表現(xiàn)為氮素不敏感。以RIL-D22作為供體，QZL2作為輪回親本，構(gòu)建了BC2F5群體，圖位克隆得到1個(gè)控制氮素高效利用的數(shù)量性狀基因QTL-qNGR9，并定位在第9號(hào)染色體上。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的是1個(gè)異源三聚體G蛋白的γ亞基，含有硝態(tài)氮高效利用等位變異qNGR9的水稻生長(zhǎng)對(duì)增加氮素供應(yīng)不敏感，表現(xiàn)為半矮化。相同的施氮條件下，近等基因系NIL-qNGR9的籽粒產(chǎn)量明顯高于NIL-qNGR9，這意味著要達(dá)到相同的產(chǎn)量，NIL-qNGR9必須施用更多的氮肥，而NIL-qNGR9由于氮肥利用效率高，需要較少的氮肥[32]。該研究不僅在理論上證明了G蛋白能夠參與植物對(duì)氮素的利用，而且為水稻高效氮素利用育種提供了優(yōu)良的基因資源。

2015年，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所儲(chǔ)成才團(tuán)隊(duì)對(duì)34個(gè)秈稻和粳稻品種的氮肥利用率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)秈稻對(duì)硝態(tài)氮的利用率明顯高于粳稻，而對(duì)銨態(tài)氮的利用率與粳稻沒有明顯差異。為了研究秈稻和粳稻對(duì)氮素吸收的遺傳差異，首先氯酸鹽模擬硝酸鹽毒害，研究了134個(gè)水稻品種對(duì)氯酸鹽的敏感性，發(fā)現(xiàn)秈稻比粳稻對(duì)氯酸鹽處理更加敏感。進(jìn)一步以對(duì)氯酸鹽高度敏感秈稻品種IR24作為供體，對(duì)氯酸鹽低敏感的粳稻品種日本晴作為受體，構(gòu)建了BC2F5群體，共315個(gè)株系。對(duì)這315個(gè)株系進(jìn)行氯酸鹽敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示有7個(gè)株系表現(xiàn)為對(duì)氯酸鹽的高度敏感，其中對(duì)氯酸鹽最敏感的株系NI10-1在第10號(hào)染色體上插入了來自IR24的染色體片段，從而表現(xiàn)出相對(duì)受體材料（日本晴）而言，更高的氯酸鹽敏感性和硝態(tài)氮吸收能力。將NI10-1和日本晴進(jìn)行雜交，F(xiàn)2代材料氯酸鹽敏感性表現(xiàn)出1∶2∶1 的分離情況，推測(cè)該插入片表現(xiàn)為半顯性。進(jìn)一步精確差異區(qū)段，最終將候選基因定位在了第10號(hào)染色M10-21和M10-23共2個(gè)遺傳標(biāo)記之間，并且這2個(gè)標(biāo)記之間只有1個(gè)編碼基因序列—NRT1.1B （OsNPF6.5）。日本晴和IR24的NRT1.1B基因編碼序列存在2個(gè)SNP位點(diǎn)，其中的1個(gè)產(chǎn)生的是同義突變，另外1個(gè)導(dǎo)致蘇氨酸（日本晴）突變成甲硫氨酸（IR24），在其他秈稻、粳稻品種中也發(fā)現(xiàn)了該SNP的存在，證實(shí)了秈粳稻間的硝態(tài)氮吸收差異是由于NRT1.1B的秈粳稻中等位基因的差異造成的，轉(zhuǎn)化來源于IR24的NRT1.1B的轉(zhuǎn)基因水稻也能夠提高水稻對(duì)氮素的利用效率[34]。NRT1.1B基因的發(fā)現(xiàn)為遺傳改良提升我國(guó)粳稻氮素利用效率提供了理論基礎(chǔ)和優(yōu)異的基因資源[35]。2018年，左建儒團(tuán)隊(duì)圖位克隆了1個(gè)控制水稻氮素利用效率的關(guān)鍵基因ARE1，該基因產(chǎn)物定位于葉綠體，在氮素限制條件下，ARE1突變體可以增強(qiáng)氮素利用效率，其啟動(dòng)子區(qū)的插入突變，導(dǎo)致ARE1表達(dá)量降低，水稻籽粒產(chǎn)量增加，該基因?yàn)榕嘤咝Ю盟咎峁┝酥匾蛸Y源[36]。

綜上可知，正向遺傳學(xué)是一個(gè)相對(duì)耗時(shí)且工作量大的研究方法，但是正向遺傳學(xué)定位出來的基因能夠快速應(yīng)用于育種和生產(chǎn)實(shí)踐，且效應(yīng)明顯。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及測(cè)序成本的不斷降低，多種簡(jiǎn)單快捷的利用測(cè)序手段定位基因的方法被開發(fā)出來。高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合正向遺傳學(xué)將成為從表型到基因到育種實(shí)踐最有效的手段。

6 問題與展望

氮素在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及產(chǎn)量形成中都是不可替代的元素，過多或過少使用氮肥都會(huì)造成經(jīng)濟(jì)損失，提高植物對(duì)氮素的利用效率，減少氮肥的施用量，可以減少農(nóng)業(yè)成本，控制環(huán)境污染，保證糧食安全。提高水稻對(duì)氮素的利用效率不僅包括氮素的吸收，還包括氮素的運(yùn)輸以及庫(kù)源之間的分配問題，如何使更多的能量從環(huán)境流入到庫(kù)中，實(shí)現(xiàn)水稻產(chǎn)量的增加，才是真正需要解決的科學(xué)問題。目前，水稻高效氮素利用機(jī)理研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但是仍然處于起步階段，還停留在研究水稻根系如何從土壤中吸收氮素。而這些與氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、分配相關(guān)的因子又是如何感知氮素含量的變化、受到哪些因子的調(diào)控仍然未知，還需要科研工作者進(jìn)一步挖掘和研究。

隨著各類組學(xué)的發(fā)展，進(jìn)一步結(jié)合新的技術(shù)手段，研究水稻對(duì)氮素吸收利用，從轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平、代謝水平，甚至表觀水平系統(tǒng)地研究水稻氮素的各個(gè)層面，提高水稻對(duì)氮素的利用效率。此外，在水稻品種高產(chǎn)高效遺傳改良的基礎(chǔ)上，要進(jìn)一步結(jié)合精確的大田管理栽培技術(shù)，最大限度地發(fā)揮品種的生物學(xué)潛能，實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好、高產(chǎn)、高效的“綠色超級(jí)稻”目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1]HAN M，OKAMOTO M，BEATTY P H，et al.The genetics of nitrogen use efficiency in crop plants[J].Annual review of genetics，2015，49（1）：269-289.

[2] LIU X J，ZHANG Y，HAN W X，et al.Enhanced nitrogen deposition over China[J].Nature，2013，494（7438）：459-462.

[3] FUKUSHIMA A，KUSANO M.A network perspective on nitrogen metabolism from model to crop plants using integrated ‘omics approaches[J].Journal of experimental botany，2014，65（19）：5619-5630.

[4] WU L L，YUAN S，HUANG L Y，et al.Physiological mechanisms underlying the highgrain yield and highnitrogen use efficiency of elite rice varieties under a low rate of nitrogen application in China[J].Front Plant Sci，2016，7：1-12.

[5] MASCLAUXDAUBRESSE C，DANIELVEDELE F，DECHORGNAT J，et al.Nitrogen uptake，assimilation and remobilization in plants：Challenges for sustainable and productive agriculture[J].Ann Bot，2010，105（7）：1141-1157.

[6] KAISER B N，RAWAT S R，SIDDIQI M Y，et al.Functional analysis of an Arabidopsis TDNA "knockout" of the highaffinity NH4+ transporter AtAMT1;1[J].Plant physiology，2002，130（3）：1263-1275.

[7] OKAMOTO M，VIDMAR J J，GLASS A D M.Regulation of NRT1 and NRT2 gene families of Arabidopsis thaliana：Responses to nitrate provision[J].Plant Cell Physiol，2003，44（3）：304-317.

[8] YONEYAMA T，TANNO F，TATSUMI J，et al.Wholeplant dynamic system of nitrogen use for vegetative growth and grain filling in rice plants （Oryza sativa L.） as revealed through the production of 350 grains from a germinated seed over 150 days： A review and synthesis[J].Front Plant Sci，2016，7：1-13.

[9] LIU X Q，HUANG D M，TAO J Y，et al.Identification and functional assay of the interaction motifs in the partner protein OsNAR2.1 of the twocomponent system for highaffinity nitrate transport[J].New Phytol，2014，204（1）：74-80.

[10] KRONZUCKER H J，GLASS A D M，SIDDIQI M Y，et al.Comparative kinetic analysis of ammonium and nitrate acquisition by tropical lowland rice：Implications for rice cultivation and yield potential[J].New phytologist，2000，145（3）：471-476.

[11] 何文壽，李生秀，李輝桃. 水稻對(duì)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收特性的研究[J].中國(guó)水稻科學(xué)，1998，12（4）：249-252.

[12] 孫靜文，陳溫福，曾雅琴，等.氮素水平對(duì)粳稻根系形態(tài)及其活力的影響[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34（5）：344-346.

[13] 董桂春，王熠，于小鳳，等.不同生育期水稻品種氮素吸收利用的差異[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（22）：4570-4582.

[14] 董桂春，李進(jìn)前，張彪，等.高氮素籽粒生產(chǎn)效率類型秈稻品種的一些相關(guān)性狀[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2009，23（3）：289-296.

[15] 單玉華.不同類型水稻品種氮素吸收利用的差異及控制[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2002.

[16] 張?jiān)婪?不同氮素累積量類型秈稻品種的基本特點(diǎn)及其對(duì)供氮濃度的響應(yīng)[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2006.

[17] 殷春淵，張洪程，張慶，等.水稻不同生育期類型品種精確定量施氮參數(shù)的初步研究[J].作物學(xué)報(bào)，2010，36（8）：1342-1354.

[18] 葉利庭，宋文靜，呂華軍，等.不同氮效率水稻生育后期氮素積累轉(zhuǎn)運(yùn)特征[J].土壤學(xué)報(bào)，2010，47（2）：303-310.

[19] 晏娟，尹斌，張紹林，等.不同施氮量對(duì)水稻氮素吸收與分配的影響[J].植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2008，14（5）：835-839.

[20] SUENAGA A，MORIYA K，SONODA Y，et al.Constitutive expression of a noveltype ammonium transporter OsAMT2 in rice plants[J].Plant Cell Physiol，2003，44（2）：206-211.

[21] SONODA Y，IKEDA A，SAIKI S，et al.Distinct expression and function of three ammonium transporter genes （OsAMT1;1-1;3） in rice[J].Plant Cell Physiol，2003，44（7）：726-734.

[22] FUNAYAMA K，KOJIMA S，TABUCHIKOBAYASHI M，et al.Cytosolic glutamine synthetase1;2 is responsible for the primary assimilation of ammonium in rice roots[J].Plant Cell Physiol，2013，54（6）：934-943.

[23] SUZUKI A，VIDAL J，GADAL P.Glutamate synthase isoforms in rice：Immunological studies of enzymes in green leaf，etiolated leaf，and root tissues[J].Plant physiology，1982，70（3）：827-832.

[24] OHASHI M，ISHIYAMA K，KOJIMA S，et al.Asparagine Synthetase1，but not asparagine Synthetase2，is responsible for the biosynthesis of asparagine following the supply of ammonium to rice roots[J].Plant Cell Physiol，2015，56（4）：769-778.

[25] LIN C M，KOH S，STACEY G，et al.Cloning and functional characterization of a constitutively expressed nitrate transporter gene，OsNRT1，from rice[J].Plant physiology，2000，122（2）：379-388.

[26] CHEN X B，YAO Q F，GAO X H，et al.Shoottoroot mobile transcription factor HY5 coordinates plant carbon and nitrogen acquisition[J].Curr Biol，2016，26（5）：640-646.

[27] HO C H，LIN S H，HU H C，et al.CHL1 functions as a nitrate sensor in plants[J].Cell，2009，138（6）：1184-1194.

[28] YAN M，F(xiàn)AN X R，F(xiàn)ENG H M，et al.Rice OsNAR2.1 interacts with OsNRT2.1，OsNRT2.2 and OsNRT2.3a nitrate transporters to provide uptake over high and low concentration ranges[J].Plant cell and environment，2011，34（8）：1360-1372.

[29] TANG Z，F(xiàn)AN X R，LI Q，et al.Knockdown of a rice stelar nitrate transporter alters longdistance translocation but not root influx[J].Plant physiology，2012，160（4）：2052-2063.

[30] CHANDRAN A K N，PRIATAMA R A，KUMAR V，et al.Genomewide transcriptome analysis of expression in rice seedling roots in response to supplemental nitrogen[J].J Plant Physiol，2016，200：62-75.

[31] DAI G J，CHENG S H，HUA Z T，et al.Mapping quantitative trait loci for nitrogen uptake and utilization efficiency in rice （Oryza sativa L.） at different nitrogen fertilizer levels[J].Genetics and molecular research，2015，14（3）：10404-10414.

[32] SUN H Y，QIAN Q，WU K，et al.Heterotrimeric G proteins regulate nitrogenuse efficiency in rice[J].Nat Genet，2014，46（6）：652-656.

[33] KOUTROUBAS S D，NTANOS D A.Genotypic differences for grain yield and nitrogen utilization in Indica and Japonica rice under Mediterranean conditions[J].Field crops research，2003，83（3）：251-260.

[34] HU B，WANG W，OU S J，et al.Variation in NRT1.1B contributes to nitrateuse divergence between rice subspecies[J].Nat Genet，2015，47（7）：834-838.

[35] CHEN Z C，MA J F.Improving nitrogen use efficiency in rice through enhancing root nitrate uptake mediated by a nitrate transporter，NRT1.1B[J].J Genet Genomics，2015，42（9）：463-465.

[36] WANG Q，NIAN J Q，XIE X Z，et al.Genetic variations in ARE1 mediate grain yield by modulating nitrogen utilization in rice[J].Nat Commun，2018，9：1-10.