吳新杰 榮松柏 江瑩芬 費維新 初明光 李強生 梅新全 陳鳳祥

摘要 化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育是油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途經(jīng)。苯磺隆是一種重要的化學(xué)雜交劑。對苯磺隆誘導(dǎo)油菜雄性不育機理以及技術(shù)方法進行綜述，并對其應(yīng)用技術(shù)進行展望。

關(guān)鍵詞 甘藍型油菜;雄性不育;化學(xué)雜交劑;苯磺隆

中圖分類號 S634.3文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）24-0005-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.002

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Review on Male Sterility of Brassica napus L. Induced by Tribenuronmethyl

WU Xinjie， RONG Songbai， JIANG Yingfen et al

（ Crop Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei Rapeseed Subcenter， National Oil Crop Improvement Center， Anhui Province Key Laboratory of Crop Quality Improvement，Hefei， Anhui 230031）

Abstract Male sterility induced by chemical product is an important method of heterosis utilization in Brasscia napus L. Tribenuronmethyl is a promising chemical hybridizing agent. The mechanism and technical methods of tribenuronmethylinduced male sterility in rapeseed were reviewed， and its application technology was prospected.

Key words Brassica napus L.;Male sterility;Chemical hybridizing agent;Tribenuronmethyl

油菜具有較強雜種優(yōu)勢，優(yōu)良雜交組合一般可增產(chǎn)20%左右。目前油菜雜種優(yōu)勢利用途徑主要有細胞質(zhì)雄性不育、細胞核雄性不育、化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育（chemical induced male sterility，CIMS）（又稱化學(xué)殺雄）、自交不親和等。CIMS途徑是指利用化學(xué)雜交劑（chemical hybridizing agent，CHA）（又稱化學(xué)殺雄劑）處理母本油菜品系，誘導(dǎo)花粉生理型敗育，再與其他父本油菜品系雜交來生產(chǎn)雜交種。CIMS具有親本來源廣泛，組合自由，易選配強優(yōu)勢雜交種，育種周期短，效率高，成本低以及雜交種沒有不育株等眾多優(yōu)點，已成為油菜雜種優(yōu)勢利用重要途徑[1-2]。

CIMS途徑的關(guān)鍵是CHA。1970年左右，CHA開始用于誘導(dǎo)油菜產(chǎn)生雄性不育，進而生產(chǎn)雜交種。目前，油菜CHA種類有20多種，主要包括氯代脂肪酸類、無機鹽類、激素類、甲基胂酸鹽類以及磺酰脲類除草劑、氨基磺酸類藥物，但真正推廣應(yīng)用的還很少，主要是殺雄效果不穩(wěn)定，容易受外界環(huán)境影響，使得殺雄效果與藥害不能夠得到很好平衡，育種風險較大，而磺酰脲類除草劑是在我國應(yīng)用最多、最成功的化學(xué)雜交劑。近年來，隨著高效低毒化學(xué)雜交劑如SX-1、化殺靈等的大面積應(yīng)用和推廣，CIMS途徑越來越受到油菜育種單位重視。目前利用該技術(shù)已選育出湘雜油6號、渝黃4號、秦優(yōu)33、中油雜19、陜1209、寧油1818、華油雜68等新品種，推廣面積達400多萬hm2[3-6]。

苯磺隆是一種低殘留、低毒、高效內(nèi)吸傳導(dǎo)選擇性磺酰脲類除草劑，通過植物根、莖、葉吸收后，迅速傳導(dǎo)，1 d左右停止生長，7 d嫩葉退綠發(fā)黃，14～21 d生長點心葉壞死，21～28 d后全株枯死。低劑量苯磺隆可誘導(dǎo)油菜雄性不育，常用于復(fù)配化學(xué)雜交劑，已經(jīng)成功運用于油菜雜交種大規(guī)模生產(chǎn)，但也存在不同品種、不同氣候環(huán)境殺雄效果有差異等問題。該研究對低劑量苯磺隆誘導(dǎo)油菜雄性不育機理以及技術(shù)方法進行綜述，并對其應(yīng)用技術(shù)進行展望。

1 苯磺隆誘導(dǎo)油菜雄性不育機理

1.1 敗育特征

趙倫[7]研究發(fā)現(xiàn)苯磺隆處理油菜后，雄性不育的油菜花絲未伸長，花粉粒干癟，顯微觀察發(fā)現(xiàn)從小孢子時期起，小孢子和絨氈層的細胞質(zhì)逐步降解和液泡化，小孢子不能進行正常有絲分裂，最終形成畸形褶皺花粉粒，其內(nèi)容物全部或大部分被降解。梁魁景等[8]研究苯磺隆處理甘藍型油菜中雙2號導(dǎo)致雄性不育，花絲不伸長，花藥皺縮，干癟缺水，顏色淡黃，不形成花粉粒等;在花粉發(fā)育各個時期，尤其是四分體時期后，都能觀察到花藥細胞有缺陷的絨氈層，絨氈層的破壞是導(dǎo)致雄性不育的主要原因。這些結(jié)果說明低劑量苯磺隆誘導(dǎo)油菜雄性不育的特征與不育性穩(wěn)定徹底的蘿卜質(zhì)雄性不育系蘿AⅠ和蘿AⅡ以及細胞核雄性不育系S45A和117A的敗育特征相似[9-10]。

1.2 不育機理

乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthetase，ALS）是植物體內(nèi)3種支鏈氨基酸合成的關(guān)鍵酶，包括亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸。苯磺隆除草機理是通過錨定ALS酶的催化亞基CSR1，抑制ALS酶活性，造成支鏈氨基酸合成受阻，導(dǎo)致植物死亡[7，11-12]。目前多數(shù)研究認為低劑量苯磺隆作為化學(xué)雜交劑的機理也是抑制ALS 酶活性。

Zhao等[13]研究表明ALS酶是苯磺隆的唯一靶標，ALS酶抑制是苯磺隆誘導(dǎo)油菜雄性不育的主要原因。葉面噴施的低劑量苯磺隆通過極性運輸，即通過葉片或韌皮部由形態(tài)學(xué)下端的葉片、莖干運輸?shù)叫螒B(tài)學(xué)上端的花藥，在花藥中積累，花藥中苯磺隆含量遠遠高于葉片和莖，分別為10.43、3.26和1.55 ng/g，造成花藥中ALS酶活明顯低于葉片和莖中的酶活，相對酶活分別為0.23、0.93和0.85，花藥中ALS酶幾乎全部被抑制，支鏈氨基酸合成受到抑制，最終誘導(dǎo)花藥自體吞噬型細胞死亡，小孢子大量細胞質(zhì)被降解，最終導(dǎo)致雄性不育[7，13]。

Li等[14-15]用單嘧磺隆鈉誘導(dǎo)甘藍型油菜雄性不育，發(fā)現(xiàn)碳水化合物和脂質(zhì)代謝受到影響，可溶性糖含量降低，而花藥糖含量減少通常被認為是誘導(dǎo)雄性不育的主要因素之一。Liu等[16]報道磺酰脲類除草劑引起的葉綠體和絨氈層纖毛體異常，對內(nèi)源乙烯合成有明顯促進作用，導(dǎo)致絨氈層細胞和小孢子在早期發(fā)育階段自噬。

劉志權(quán)[5]從苯磺隆處理后油菜花蕾轉(zhuǎn)錄組中篩選出727個差異表達轉(zhuǎn)錄本，其中437個上調(diào)和290個下調(diào)。富集出差異顯著基因本體物GO（Gene Ontology）432條，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）生物學(xué)途徑35條。一些重要GO terms主要有氨基酸代謝途徑、能量代謝途徑、碳水化合物脂質(zhì)蛋白質(zhì)代謝途徑、細胞分裂生長凋亡途徑、刺激和防御響應(yīng)途徑、葉綠體和線粒體、激素、過氧化氫酶、類黃酮生物合成等。此外，BnSPL、BnROXY2、BnEMS1、BnTPD1、BnDYT1、BnTDF1、BnAMS、BnMYB103、BnMS1等油菜育性相關(guān)基因表達均受到不同程度的抑制。

1.3 ALS酶抑制與雄性不育關(guān)系

1.3.1 ALS酶抑制類除草劑不一定都能誘導(dǎo)油菜雄性不育。

ALS酶抑制類除草劑主要有磺酰脲類、咪唑啉酮類、磺酰胺類、嘧啶水楊酸類等[17]，但不是所有ALS酶抑制類除草劑都可以誘導(dǎo)油菜雄性不育。任莉鎖[3]研究發(fā)現(xiàn)，0.5～1.0 mg/L甲咪唑煙酸與2.2～4.4 mg/L三氟啶磺隆鈉具有較好殺雄效果，而五氟磺草胺與乙氧磺隆即使對油菜在藥害比較嚴重的劑量下，對ALS酶有明顯抑制作用，也沒有殺雄效果。劉志權(quán)[5]研究發(fā)現(xiàn)，雙草醚、闊草清處理后油菜花蕾、幼葉ALS酶活性基本維持在40%～60%，對油菜生長有較強抑制作用，但不能誘導(dǎo)雄性不育。這些說明ALS酶活性降低不一定會導(dǎo)致油菜雄性不育，要誘導(dǎo)雄性不育還取決于化學(xué)除草劑自身結(jié)構(gòu)特性以及發(fā)揮藥效的分子作用機理[18]。

1.3.2 ALS酶活抑制程度與苯磺隆噴施量有關(guān)。

劉志權(quán)[5]研究發(fā)現(xiàn)苯磺隆處理后油菜花蕾、幼葉ALS酶活性基本保持在20%～40%，可以誘導(dǎo)雄性不育;苯磺隆濃度為1.5～6.0 mg/L時花蕾ALS酶活性與苯磺隆濃度之間具有線性關(guān)系（R2=0.546 5）;油菜植株出現(xiàn)明顯藥害時ALS 酶受抑制程度基本上超過50%。于澄宇[19]用0.2 mg/L苯磺隆溶液處理油菜，4 d后對花蕾ALS酶活性抑制達到最大，僅為對照的20%，之后緩慢恢復(fù)，18 d后約為對照的25%，28 d后也不到50%。付三雄等[20]用0.2 mg/L苯磺隆溶液處理后3 d，2種油菜中花蕾ALS相對酶活分別為40.63%和37.23%。這些研究結(jié)果暗示ALS酶活抑制程度與苯磺隆誘導(dǎo)的油菜雄性不育程度以及藥害程度有關(guān)。

影響化學(xué)雜交劑藥效的因素較多，而且在施用化學(xué)雜交劑后，不能在早期準確判斷其化學(xué)殺雄效果，這是影響化學(xué)雜交劑大面積推廣應(yīng)用的主要障礙?；瘜W(xué)殺雄效果一般需要等到初花期之后才能通過花瓣大小及直徑、柱頭長短、結(jié)實率、植株育性及植株高度等性狀直觀地觀察到，如果此時發(fā)生藥害或者殺雄效果不好，想再實施補救措施則為時已晚。根據(jù)ALS酶活性與不育性和藥害之間相關(guān)性，在早期通過檢測ALS酶活性，有望快速鑒定化學(xué)雜交劑噴施效果，進而根據(jù)需要盡早采取補救措施來提高化學(xué)殺雄效果。

2 苯磺隆化學(xué)殺雄效果的影響因素

苯磺隆化學(xué)殺雄效果與噴藥濃度、噴藥時期、施藥方式、噴藥技術(shù)等因素密切相關(guān)。

2.1 噴藥濃度

濃度是影響苯磺隆對油菜化學(xué)殺雄效果的重要因素。濃度小，殺雄不徹底;濃度大，易出現(xiàn)藥害，影響結(jié)實率，導(dǎo)致制種產(chǎn)量低。適宜濃度應(yīng)是在滿足化學(xué)殺雄效果的同時盡可能降低藥害程度，或是產(chǎn)生輕微藥害的濃度。前人研究中適宜濃度一般為0.05%～0.35%。

在有效劑量相同的條件下，濃度與噴藥量可以采取不同組合，不同組合化學(xué)殺雄效果不盡相同。李建廠等[21]比較化學(xué)雜交劑SX-1飽和噴霧和標準噴霧的化學(xué)殺雄效果，結(jié)果表明飽和噴霧（單株噴藥量12 mL，濃度1.4 mg/L）的化學(xué)殺雄效果明顯好于標準噴霧（單株噴藥量3 mL，濃度5.6 mg/L），藥害明顯比標準噴霧輕，說明合適噴藥量也是影響藥效的因素之一。選擇噴藥量應(yīng)綜合考慮藥液濃度、噴藥方式、噴藥時期等因素，前人研究中常見油菜單株噴藥量為2～20 mL。

不同基因型油菜對苯磺隆的敏感性存在差異，因而不同基因型油菜適宜的噴藥濃度也不同。信曉陽等[22]用2 mg/L苯磺隆溶液處理49個基因型油菜幼苗，鑒定出低度敏感材料2份、中度敏感材料22份、高度敏感材料25份，說明不同基因型油菜對苯磺隆抗性存在差異。王倩等[23]用25 mg/kg苯磺隆溶液處理241份甘藍型油菜種質(zhì)，鑒定出耐苯磺?、窦?份、Ⅱ級30份、Ⅲ級198份、Ⅳ級6份、Ⅴ級4份，對苯磺隆耐性較強的甘藍型油菜品種（系）為希望106、SWU95和WH-33，可作為甘藍型油菜苯磺隆耐性育種的重要資源。

于澄宇等[24]研究表明，苯磺隆對20種基因型油菜的化學(xué)殺雄效果具有一定差異， 對82089、史力豐等葉色較深、花期較晚的品種（系）殺雄率較低。張秀英等[25]研究認為，單株噴藥量10 mL時中雙11號最適合濃度為0.1 mg/L，滬16最適合濃度為0.25 mg/L。何忠軍等[26]研究認為，苯磺隆對甘藍型油菜楊4和中11的最佳施用濃度為0.20～0.25 mg/L，而早熟1號、早熟2號的最佳濃度為0.35 mg/L。

2.2 噴藥時期

已有研究表明苯磺隆誘導(dǎo)油菜雄性敗育主要始于四分體至小孢子單核前期這個階段[7-8]。一般認為這個階段也是第一次噴藥最佳時期?；ǚ郯l(fā)育與花蕾發(fā)育密切相關(guān)，可以通過花蕾長度這一形態(tài)指標來估計小孢子所處發(fā)育階段，因此第一次噴藥時期可以根據(jù)最大花蕾長度來確定，一般認為花蕾長度1.5～2.5 mm比較合適，但是不同環(huán)境不同基因型油菜最適合最大花蕾長度也不盡相同，必要時需要進行鏡檢確定。李東昊等[27]觀察甘藍型油菜湘油15號花粉母細胞減數(shù)分裂行為，認為花蕾長度1.5～2.5 mm時，處于單核花粉粒時期。曹毅等[28]觀察甘藍型油菜蜀雜9號，認為花蕾長度3～4 mm處于四分體時期，花蕾長度4～6 mm處于單核期。

噴藥時期對化學(xué)殺雄效果有較大影響。馮順山等[29]在用0.094 mg/L苯磺隆藥液240 kg/hm2的劑量條件下研究不同噴藥時期對低溫敏感型細胞質(zhì)雄性不育系8963A的輔助殺雄效果，結(jié)果表明：3月5日（最大花蕾平均蕾長1.2 mm）處理，殺雄徹底，但藥害重，結(jié)實差;3月10日（2.5 mm）處理僅個別植株有輕微藥害，殺雄徹底，開花結(jié)角正常;而3月15日（3.5 mm）和3月20日（4.0 mm）輔助殺雄效果不明顯，藥害也不明顯。黃馳等[30]研究0.10 mg/L苯磺隆藥液不同噴施時期對油菜育性的影響，在主花序最大花蕾長度1.50～2.00 mm（即小孢子單核期）和3.00～4.00 mm時噴施都可誘導(dǎo)100%全不育株率，并保持整個花期不育，僅出現(xiàn)輕微藥害;而0.50～1.00 mm處理，由于噴施時期過早，雖然可誘導(dǎo)95.66%全不育株率，但不育持續(xù)時間短，藥害株率高。

油菜花期長達30 d左右，多數(shù)情況下一次噴藥無法實現(xiàn)整個花期不育，一般在初花期前后還要噴一次。如果這2次噴藥間隔期較長，如超過40 d以上，則還需要在間隔期再噴一次?？刂坪脟娝幋螖?shù)和間隔是實現(xiàn)整個花期不育的保證。

選擇合適噴藥時期還應(yīng)考慮天氣條件和土壤墑情，要選擇晴好、溫暖天氣，以日均氣溫達10 ℃以上，田間相對濕度達70%以上為好，注意避開下雨、大風以及露水，一般要求噴藥后24 h內(nèi)不降雨。曹永紅等[31]采用人工模擬中雨研究降雨對化學(xué)雜交劑SX-1使用效果的影響，結(jié)果表明：SX-1噴施后人工模擬中雨時間越近，化學(xué)殺雄效果越差，表現(xiàn)為不育率降低、不育性持續(xù)時間變短;SX-1噴施后8 h降中雨對藥效影響不大。

2.3 施藥方式

目前化學(xué)雜交劑施用方式主要有葉面噴施、涂莖處理和土壤施用等。葉面施用優(yōu)點是藥效高，用藥量較少，操作相對簡單，是大田應(yīng)用主要方式。苯磺隆用作涂莖處理，藥效次于葉面噴施，相對費時費力，一般僅用于人工輔助去雄雜交。土壤施用雖然方法簡單，容易操作，但其最大弊端是用藥量很大。

李建廠等[21]研究化學(xué)雜交劑SX-1涂莖、注莖、灌根、飽和噴霧和標準噴霧共5種方法對油菜的化學(xué)殺雄效果，結(jié)果表明：單株注莖（22 μL，110 mg/L）處理和飽和噴霧（單株噴藥量12 mL，濃度1.2 mg/L）處理對雄性不育誘導(dǎo)效果最好，均可誘導(dǎo)油菜雄性不育株率 100%，且對農(nóng)藝性狀影響不顯著。

2.4 噴藥技術(shù)

化學(xué)雜交劑施用技術(shù)要求較高，均勻一致噴霧是保障良好化學(xué)殺雄效果的前提。然而噴霧效果容易受噴霧機械質(zhì)量優(yōu)劣、噴施人員技術(shù)水平、植株生長狀況及使用環(huán)境等因素限制，施藥劑量往往誤差較大、施藥不均勻，化學(xué)雜交劑利用率低，從而導(dǎo)致化學(xué)殺雄效果不理想。因此，化學(xué)殺雄母本群體要求個體均勻一致，密度適中，加大父母本間距，防止藥液飄移到父本上;噴霧時要求霧化效果好，不漏噴、不重噴;噴藥前需組織專人培訓(xùn)，噴藥時需由專業(yè)技術(shù)人員指導(dǎo)[32]。

2.5 化學(xué)殺雄效果

張寶娟等[33]在陜西楊凌研究苯磺隆對甘藍型油菜中雙9號的殺雄效果，結(jié)果表明：在薹高15～20 cm、最大花蕾長度1～2 mm時第1次噴藥，單株噴藥量15～20 mL，間隔10 d 左右再進行第2次噴藥，單株噴藥量8～10 mL，葉面噴施最佳濃度為0.075～0.100 mg/L，可誘導(dǎo)94%～100%全不育株率，不育持續(xù)時間可達21～25 d，達到整個花期不育，花期推遲1～2 d，藥害較輕，天然授粉結(jié)實率與對照無明顯差異。

王同華等[34]在湖南長沙研究苯磺隆對甘藍型油菜pol-CMS恢復(fù)系SC4和不育系20A的殺雄效果，結(jié)果表明：在SC4薹高12～15 cm，最大花蕾長度1.0～1.5 mm時，噴施0.01、0.05、0.10 mg/L苯磺隆溶液，間隔15 d左右再噴1次，每次噴施至葉片濕潤至白色露珠為止，殺雄作用可以持續(xù)22 d以上，未見明顯藥害，雜交種純度可達75.2%～81.5%;在20A第1次打頂后，噴施0.05、0.10 mg/L苯磺隆溶液，制種純度分別達95.9%～98.1%。

于澄宇等[24]研究苯磺隆對甘藍型油菜秦油3號等20個品種（系）的化學(xué)殺雄效果，結(jié)果表明：在最長花蕾2～3 mm（小孢子單核期）時噴施有效成分90 mg/hm2（折合濃度0.07 mg/L，藥液1 275 kg/hm2）苯磺隆溶液，單株噴藥量6～8 mL，12 d后復(fù)噴1次，噴施時加入0.2%～0.5%洗衣粉，全不育株可達100%，持續(xù)時間22 d，結(jié)實基本正常。

馮順山等[29]研究苯磺隆對甘藍型油菜胞質(zhì)不育系8963A的輔助化學(xué)殺雄效果，結(jié)果表明：最佳噴藥時期是最大花蕾平均長度2.5 mm（平頂期），最佳濃度0.094 mg/L，噴施藥液240 kg/hm2。

黃馳等[30]在成都研究苯磺隆對甘藍型油菜自交系99-35和09QB48-54的殺雄效果，當主花序最大花蕾長度1.5～2.0 mm時，第1次葉面噴施，隔10 d左右再第2次噴施，單株噴藥量15～20 mL時，0.05～0.10 mg/L苯磺隆溶液可誘導(dǎo)全不育株率100%，不產(chǎn)生藥害，整個花期雄性不育;單株噴藥量8～10 mL時，0.30 mg/L苯磺隆溶液可誘導(dǎo)群體不育株率90%以上，但結(jié)實率受到一定影響;0.30 mg/L苯磺隆溶液涂莖2次，可誘導(dǎo)群體全不育株率91.16%。

付三雄等[20]在江蘇溧水研究苯磺隆對甘藍型油菜寧油18號和096030的殺雄效果，結(jié)果表明：在70%最大花蕾長度為1～2 mm時，葉面噴施0.2 mg/L苯磺隆溶液，間隔10 d再噴1次，每次單株噴藥量8～10 mL，可誘導(dǎo)100%全不育株率，整個花期不育，但是藥害較重，相對結(jié)實率僅約 4%。

任莉鎖[3]在陜西楊凌利用抗苯磺隆材料 K5 和 DS3 作為父本、用普通自交系 ZH9 作為母本進行網(wǎng)室模擬制種，ZH9×K5 噴施 0.225 mg/L苯磺隆鈉溶液后父本正常，母本完全不育，結(jié)實性較好。

3 展望

苯磺隆是一種較為理想的油菜化學(xué)雜交劑，然而其誘導(dǎo)油菜雄性不育效果受不同生態(tài)條件、品種、田間長勢、噴藥時期、噴藥濃度、噴藥量以及施藥方式等因素的綜合影響，在使用時，應(yīng)著重考慮以下幾個方面。

一是針對不同生態(tài)區(qū)不同基因型油菜，需要進行苯磺隆噴藥濃度、噴藥量、噴藥時期以及用藥間隔的優(yōu)化，以期達到整個花期最佳雄性不育誘導(dǎo)效果。

二是大面積噴施應(yīng)用時，應(yīng)建立標準化程序，如培育長勢一致且單株之間葉片不重疊的母本群體;實施均勻一致的機械葉面噴藥等。

三是探討基于飽和噴霧的苯磺隆誘導(dǎo)不育技術(shù)，盡可能降低噴藥量對化學(xué)殺雄效果的影響，從而降低對母本群體和噴藥技術(shù)的要求，大大方便大田實際操作。

四是研究建立最佳苯磺隆處理模式下花蕾ALS酶活性變化模型，通過噴藥后早期監(jiān)控花蕾ALS酶活性來預(yù)測殺雄效果及藥害，并根據(jù)需要及時采取措施進行補救，有效降低制種風險，提高生產(chǎn)效益。

五是CIMS途徑組合選配宜選擇推廣面積較大、適宜機械化栽培、產(chǎn)量較高、配合力較好的常規(guī)品種作為母本。

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