姚永偉，韓巧霞，張奧深，雍曉宇，高宏歡，劉素君，宋天啟，王晨陽

(河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，國家小麥工程技術研究中心，河南鄭州 450002)

黃淮海小麥優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)是我國最大的冬小麥產(chǎn)區(qū)，對確保我國的糧食安全具有重大的意義[1]。拔節(jié)期是小麥冬后生長的高峰期，生長發(fā)育迅速，對于水肥要求較高，是決定產(chǎn)量的一個重要階段[2]。黃淮海地區(qū)時常出現(xiàn)低溫災害天氣，主要分為冬、春季凍害。在春季，小麥進入幼穗分化的關鍵期，對溫度的變化十分敏感，若此時突然發(fā)生大幅度的降溫，將嚴重影響小麥產(chǎn)量，一般減產(chǎn)10%～30%，嚴重時減產(chǎn)幅度達到50%[3]。幾乎每年的3-4月份，黃淮麥區(qū)都會出現(xiàn)2～5 d的大幅度降溫天氣，降溫達6～10 ℃左右，有時甚至低于0 ℃，嚴重影響了小麥幼穗的正常發(fā)育，因此對小麥抗低溫的特性研究十分重要[4-5]。

在同樣發(fā)生倒春寒的地塊，不同品種間受害程度差異顯著。而對于引起這種差異的原因，主要有兩種觀點：第一種觀點認為不同的品種發(fā)育進程不一致，生產(chǎn)上所謂的耐倒春寒，很可能是該類品種發(fā)育遲緩、拔節(jié)晚而避開了倒春寒發(fā)生時期，其本身并不具備耐倒春寒機制；第二種觀點認為品種間抵御倒春寒的能力在遺傳基礎上存在差異，有些小麥品種在遭受倒春寒的危害后自我恢復能力很強，小麥的抗凍性在冬季和春季并不是顯著相關，冬季抗凍力強的小麥品種在春季的抗凍性并不一定強[6]。低溫逆境會使細胞發(fā)生一系列生理生化變化，如抗氧化物質(zhì)增加、可溶性糖積累、組織含水量下降、膜流動性改變、新蛋白質(zhì)的誘導合成、多種代謝酶的增加等[7]。本研究選取在河南推廣面積較大且在前期田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)其在春季拔節(jié)期抗凍性存在明顯差異的兩個冬小麥品種百農(nóng)207和鄭麥366，盆栽種植至拔節(jié)期，通過人工氣候室模擬低溫處理，測定其生理指標，并通過熒光定量PCR(qRT-PCR)測定幾個抗逆基因的表達量,分析兩個小麥品種的抗凍性差異機理，以期為冬小麥倒春寒抗性鑒定及品種選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

供試小麥材料為河南省推廣面積較大的半冬性小麥品種百農(nóng)207和鄭麥366。試驗在河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)采用盆栽(26 cm×28 cm)方式進行。盆栽用土為大田0～30 cm 耕層壤質(zhì)潮土，有機質(zhì)含量17.8 g·kg-1，全氮含量0.99 g·kg-1，堿解氮含量57.9 mg·kg-1，速效磷含量67.5 mg·kg-1，速效鉀含量204.8 mg·kg-1，pH值為7.94。測得田間持水量為 25.91%。每盆裝過篩土7.5 kg，之后埋于大田，盆內(nèi)土壤表面與盆外大田保持齊平。3葉期定苗，每盆15株，澆水量根據(jù)土壤墑情決定，每個盆栽保持一致。

小麥植株發(fā)育至拔節(jié)期(藥隔形成初期)時在人工氣候室內(nèi)-5 ℃低溫連續(xù)處理24 h，在低溫處理0 h、6 h和24 h時取主莖最上部全展葉用于生理指標測定及基因表達分析。

1.2 儀器與試劑

定量儀器為QuantStudio 5 Real-Time PCR System, Thermo Fisher Scientific，RNA提取試劑盒RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ均購自寶生物有限公司。

1.3 生理指標的測定

小麥葉片中MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法，脯氨酸含量測定采用茚三酮顯色法，均設置3次生物學重復[8]。

1.4 基因表達分析

1.4.1 小麥葉片總RNA提取與cDNA第一鏈的合成

取小麥葉片0.1 g，用RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系和條件：第一步，總RNA 2.0 μL ,Oligo dT Primer(50 μM) 1 μL,DEPC 9.5 μL,反應條件42 ℃，2 min；第二步，第一步反應混合液 12.5 μL，5×PrimeScript II Buffer 4.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，PrimeScript II RTase 1.0 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，反應條件37 ℃，15 min，85 ℃，5 s獲得cDNA。

1.4.2 實時熒光定量PCR

以小麥Actin基因作為內(nèi)參基因，通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索逆境相關基因序列，用Primer 5.0設計引物，由河南尚亞生物技術有限公司合成(表1)。定量PCR體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL，上游引物 0.75 μL，下游引物 0.75 μL，cDNA 2 μL,ddH2O補足20 μL。qRT-PCR反應條件：預變性95 ℃ for 30 s,變性95 ℃ for 5 s，退火/延伸60 ℃ for 45 s，40個循環(huán)。采取2-△△Ct法計算待測基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

1.5 低溫脅迫后幼穗受凍情況調(diào)查

低溫脅迫處理后，將處理后的盆栽小麥放置在自然條件下自然恢復生長15 d后，調(diào)查幼穗的受凍死亡情況，按盆栽數(shù)量逐盆多次統(tǒng)計分析，取平均值，計算死亡率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Excel 2007和SPSS 22軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 拔節(jié)期低溫脅迫后小麥葉片丙二醛(MDA)含量的變化

由圖1可見，低溫處理(處理0 h)前兩個品種的MDA含量差異不顯著；低溫處理6 h時百農(nóng)207的MDA含量較低溫處理前略降，鄭麥366的MDA含量則顯著升高。隨著低溫脅迫處理時間的延長，低溫處理達到24 h時，兩個小麥品種的MDA含量均較之前顯著下降，且百農(nóng)207的MDA含量顯著低于鄭麥366，說明此時百農(nóng)207膜脂過氧化程度輕于鄭麥366。

圖柱上的字母不同表示處理間差異顯著。下圖同。

2.2 拔節(jié)期低溫脅迫后小麥葉片游離脯氨酸(Pro)含量的變化

從圖2可以看出，百農(nóng)207和鄭麥366葉片游離Pro含量分別在在低溫6和24 h時開始出現(xiàn)下降，整個試驗期間兩個品種的游離Pro平均含量分別為95.09和66.15 μg·g-1。三個測定時間點百農(nóng)207葉片的Pro含量均顯著高于鄭麥366。

圖2 不同時間低溫處理下小麥葉片的脯氨酸含量

2.3 拔節(jié)期低溫脅迫后小麥抗逆相關基因表達的變化

在低溫處理過程中，百農(nóng)207葉片中SOD、POD、WCS120、P5CS、LEA相對表達量(圖3A-E)均較低溫處理前顯著增加；而鄭麥366在低溫處理6 h時SOD的表達量(圖3A)較低溫處理前無顯著變化，其余基因表達量均顯著下降。在低溫處理24 h時，百農(nóng)207的SOD基因表達量較低溫處理6 h時顯著下降，POD表達量變化不顯著(圖3B)，WCS120、P5CS、LEA表達量(圖3C、D、E)都較低溫處理6 h時顯著升高，在低溫處理24 h時這5個基因的表達量都較低溫處理前顯著升高。鄭麥366在低溫處理24 h時SOD、P5CS、LEA、POD表達量都較低溫處理6 h時顯著下降，WCS120無顯著變化，5個基因的表達量在低溫處理24 h時都較低溫處理前均顯著下降。百農(nóng)207的5個基因表達量在低溫處理前都顯著低于鄭麥366。百農(nóng)207葉片中SOD在低溫處理24 h時與鄭麥366表達量無顯著差異，其余基因均顯著高于鄭麥366。

圖3 不同時間低溫處理下小麥葉片抗逆相關基因的相對表達量

2.4 小麥拔節(jié)期低溫處理后幼穗受凍情況

調(diào)查結(jié)果表明，-5 ℃低溫脅迫24 h后，百農(nóng)207和鄭麥366的幼穗受凍率分別達到 72.30%和90.62%，說明拔節(jié)期百農(nóng)207的抗凍性強于鄭麥366。

3 討 論

在低溫脅迫條件下，植物的膜透性增加，引起內(nèi)溶物外滲，導致植物代謝的無序紊亂。植株遭受嚴重凍害時，細胞會滲出更多的內(nèi)溶物，植物抗寒性越強，細胞膜受到的傷害越小[9]。MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，逆境脅迫下植物中MDA含量越高，說明細胞膜受損越嚴重[10-11]。劉艷陽等[12]研究認為，凍害程度低的小麥株系中MDA含量較低,膜質(zhì)過氧化程度小, 抗寒性強；凍害程度高的株系中MDA含量較高, 膜質(zhì)過氧化程度高, 抗寒性弱。因此，MDA含量可作為小麥抗寒性鑒定的指標。脯氨酸被認為是一種植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和羥基自由基清除劑，通過與磷脂相互作用可以穩(wěn)定細胞膜，并可作為碳和氮的來源[13]。游離脯氨酸也是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以減輕植物在低溫脅迫下造成的機械損傷，增加細胞的保水性[14-15]。低溫處理下小麥葉片的脯氨酸含量增加，且小麥抗寒性隨脯氨酸含量的增加而增強[16]。不同小麥品種抗凍性的差異與其在遭受低溫脅迫后相關生理生化反應差異有關[17]。本研究結(jié)果表明，連續(xù)低溫處理24 h時, 百農(nóng)207的MDA含量顯著低于鄭麥366，而Pro含量顯著高于鄭麥366；低溫脅迫后幼穗受凍率與生理指標檢測結(jié)果一致，反映出兩個品種抗凍性存在差異，百農(nóng)207抗凍性高于鄭麥366。

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，人們對植物抗逆性機制的研究重點從生理水平轉(zhuǎn)向分子水平，并分離出許多抗逆基因，如抗?jié)B透脅迫相關基因、抗氧化酶基因、抗膜脂相改變的基因、冷誘導基因等[18]。在前期研究中，我們分離出了凍脅迫相關免受脅迫傷害的功能蛋白抗逆基因如SOD、POD、LEA、P5CS和WCS，其中SOD、POD基因分別控制超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)的合成。WCS120基因是由低溫特異誘導的，編碼一種被認為在小麥冷馴化過程中起重要作用的蛋白質(zhì)[19]。WCS120高表達可以減輕凍害帶來的機械損傷，可維持或提高代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，從而提高植物的抗凍性[20]。胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)[21]氨基酸殘基多以無規(guī)則卷曲的形式存在, 這種結(jié)構(gòu)有利于與水分子結(jié)合, 維持植物體所需的最低含水量。△1-pyrroline-5-carboxylate synthetase(P5CS)參與RNA剪接、脯氨酸生物合成、脫水反應、葉片形態(tài)發(fā)生和負調(diào)控根的生長[22]。P5CS是脯氨酸合成途徑中一個關鍵基因，催化脯氨酸生物合成的最初前兩步[23]。P5CS表達與脯氨酸積累密切相關[24-25]。P5CS過表達會使脯氨酸含量增加，提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、水稻和小麥的抗逆性[26]。本研究表明，不同小麥品種間葉片中相關抗逆基因的表達模式不同，在低溫處理24 h時百農(nóng)207這5個基因的表達量都較低溫處理前顯著升高，而鄭麥366則顯著下降。百農(nóng)207葉片中除SOD在低溫處理24 h時與鄭麥366表達量無顯著差異外，其余四個基因均顯著高于鄭麥366，這與百農(nóng)207的MDA含量顯著低于鄭麥366的結(jié)果相一致，可見低溫條件下，百農(nóng)207清除活性氧的能力顯著高于鄭麥366，膜質(zhì)過氧化程度較低, 抗寒性較強。低溫處理后百農(nóng)207葉片中P5CS基因表達量顯著增加，在低溫處理24 h時顯著高于鄭麥366，而鄭麥366的表達量較處理前顯著下降，與其脯氨酸含量表現(xiàn)相一致。據(jù)報道，脯氨酸的積累是由脯氨酸的生物合成和降解的基因轉(zhuǎn)錄變化所調(diào)控的[27]。Verslues和Sharma[28]也提出了在鹽脅迫條件下擬南芥脯氨酸積累符合PDH和P5CDH下調(diào)、P5CS上調(diào)的代謝模型，本研究結(jié)果與此相似，由于本研究只分析了P5CS表達量變化，因而低溫條件下冬小麥脯氨酸積累是否與其他基因相關有待于進一步探討。

在低溫脅迫后，生理指標和相關抗逆基因表達檢測結(jié)果與低溫脅迫后幼穗受凍率檢測結(jié)果均表明百農(nóng)207拔節(jié)期抗凍性比鄭麥366高。本課題組近三年大田調(diào)查亦發(fā)現(xiàn)百農(nóng)207的抗凍性總體高于鄭麥366，與本研究結(jié)果相一致。因此在大田栽培過程中為避免突然發(fā)生的低溫脅迫對小麥造成的危害，應選育和種植抗凍性強的品種。我們下一步主要進行相關抗凍基因特性及功能研究，并有望獲得凍脅迫基因超表達的小麥植株新品系。