朱靖環(huán)，王其飛，華 為，徐 芹

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，浙江杭州 310021；2. 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434023)

小麥赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是威脅我國小麥生產(chǎn)安全和食品安全的重大病害之一[1]。它不僅會造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)，而且導(dǎo)致品質(zhì)劣化，尤其是病原菌產(chǎn)生的毒素積累于病麥粒中，被食用后會對人畜產(chǎn)生毒害作用[2]。小麥赤霉病主要發(fā)生在長江中下游地區(qū)。近年來隨著氣候變化和耕作方式的改變，我國的小麥赤霉病日趨嚴(yán)重，已從長江中下游麥區(qū)蔓延至黃淮麥區(qū)、北方麥區(qū)和西部麥區(qū)[3]。因此，加強小麥赤霉病防控是確保我國糧食安全急需解決的主要問題。培育抗赤霉病品種是防治該病害既經(jīng)濟又環(huán)保的最有效手段，小麥抗赤霉病種質(zhì)材料的鑒定和篩選是培育小麥抗赤霉病品種的先決條件[4]。

國內(nèi)對小麥抗赤霉病種質(zhì)資源的鑒定由來已久。20世紀(jì)70年代初，我國小麥赤霉病研究協(xié)作組歷時10年對34 571份材料進行了鑒定，鑒定出抗赤霉病材料1 796份，其中高抗品種蘇麥3號、望水白和繁60085等，中抗品種平湖劍子麥、溫州紅和尚、翻山小麥、蘇麥2號等，成為我國乃至世界小麥赤霉病抗性品種培育的重要抗源[5]。徐喬喬等于2014-2017年鑒定了不同來源的45個小麥品種赤霉病抗性，其中13個品種至少2個年度表現(xiàn)抗病[6]。張煜等在2016-2018年對762個黃淮南部麥區(qū)小麥品種進行赤霉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)15個品種表現(xiàn)中抗[7]。小麥赤霉病的抗性遺傳較為復(fù)雜，屬于多基因控制的數(shù)量性狀，易受環(huán)境的影響[8]。育種上主要使用蘇麥3號、望水白、黃方柱、海鹽種、白三月黃和黃蠶豆等少數(shù)抗源材料，使得后代抗病品種遺傳基礎(chǔ)愈發(fā)狹窄。目前的抗源材料農(nóng)藝性狀普遍較差，育種上難以直接利用[9-10]。因此，鑒定并挖掘抗赤霉病的優(yōu)異種質(zhì)材料仍然是當(dāng)前小麥抗赤霉病育種的重要任務(wù)。

小麥赤霉病鑒定主要采用土表病麥粒接種法和單花滴注病原菌孢子液接種法。土表接種鑒定能夠揭示供試材料抗侵染和抗擴展的綜合能力，操作簡單粗放，適用于群體材料的初步篩選和鑒定。單小花滴注接種鑒定能夠揭示供試材料的抗擴展能力，較為費時費力，適宜較少數(shù)量材料的精準(zhǔn)鑒定[11-12]。SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性好、共顯性等諸多優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于分析小麥種質(zhì)資源的遺傳多樣和品種間的遺傳距離，可為雜交組合選配提供科學(xué)依據(jù)，有助于提高小麥的育種效率[13]。浙江省地處東南沿海，小麥灌漿成熟期雨水多、氣溫高，是我國赤霉病高發(fā)地帶，赤霉病抗性是該地區(qū)小麥育種必須解決的首要目標(biāo)。本研究將土表接種和單花滴注接種法相結(jié)合，對前期采用病麥粒土表接種法從345個小麥育成品種(系)中初步篩選出的表現(xiàn)抗病的94個小麥品種(系)進行再鑒定，并對其進行SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性分析，同時調(diào)查抗病品種(系)的農(nóng)藝性狀，以期為小麥抗赤霉病育種提供可靠有效的抗源。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試小麥赤霉病菌種為具有強致病力的F15-06、F15-08、F14-09，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用小麥育種團隊分離、鑒定和繁存。2017-2018年通過病麥粒接種從345個小麥育成品種(系)初步篩選出94個抗病品種(系)。這94個品種(系)來源于8個省或直轄市，其中北京17個、陜西1個、河南3個、四川2個、安徽2個、江蘇44個、上海4個、浙江21個(表1)。以蘇麥3號、揚麥158和矮抗58分別作為高抗對照(CK1)、中抗對照(CK2)和高感對照(CK3)。所有的小麥試驗材料由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所小麥育種團隊收集、繁存。

(續(xù)表1 Continued table 1)

(續(xù)表1 Continued table 1)

1.2 赤霉病抗性鑒定

抗病性鑒定試驗在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所赤霉病鑒定圃進行。使用菌株F15-06、F15-08、F14-09混合土表接種和單小花滴注接種的鑒定方法參照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《小麥抗病蟲性評價技術(shù)規(guī)范：小麥抗赤霉病評價技術(shù)規(guī)范》(NY/T1443.4-2007)。2017-2018和2018-2019年的土表接種鑒定試驗中，供試材料(包括3個對照品種)11月份田間播種，每個材料播1行，行長1.2 m，行距0.25 m，播種100粒，3次重復(fù),隨機排列。試驗材料四周設(shè)保護行，播種感病對照品種矮抗58。在小麥抽穗前1個月分2次，前后相隔1周，將制備的大麥病粒均勻撒于小麥行間。每次接種量為60 kg·hm-2，接種后彌霧保濕1周。單花滴注接種于2018-2019年度進行，小麥田間種植方式同上。使用綠豆水培養(yǎng)基制備孢子懸浮液，稀釋濃度為每毫升105個孢子，在小麥揚花初期(10%麥穗揚花)將20 μL孢子懸浮液注入麥穗中部的一個小花內(nèi)，每份材料接種15穗，接種后彌霧保濕1周。

供試材料發(fā)病嚴(yán)重度分級調(diào)查和抗性評價均參照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《小麥抗病蟲性評價技術(shù)規(guī)范：小麥抗赤霉病評價技術(shù)規(guī)范》(NY/T1443.4-2007)，略有改動。在小麥乳熟中后期，土表接種鑒定的每個品種(系)的每個重復(fù)隨機選擇15個麥穗，調(diào)查其病情嚴(yán)重度，并計算病情指數(shù)；單花滴注鑒定的每個品種(系)的每個重復(fù)也隨機選擇15個接種穗，調(diào)查其病情嚴(yán)重度，計算平均嚴(yán)重度。抗病性評價劃分為5個等級，分別為免疫(immune,I)、高抗(highly resistant,HR)、中抗(moderately resistant,MR)、中感(moderately susceptible,MS)和高感(highly susceptible,HS)。土表接種的抗病性鑒定標(biāo)準(zhǔn)：病情指數(shù)=0，免疫；0<病情指數(shù)<蘇麥3號病情指數(shù)，高抗；蘇麥3號病情指數(shù)≤病情指數(shù)<揚麥158病情指數(shù)，中抗；揚麥158病情指數(shù)≤病情指數(shù)<矮抗58病情指數(shù)，中感；病情指數(shù)≥矮抗58病情指數(shù),高感。單花滴注接種參試品種(系)抗病性鑒定標(biāo)準(zhǔn):平均嚴(yán)重度=0,免疫;0<平均嚴(yán)重度<2.0,高抗;2≤平均嚴(yán)重度<3,中抗;3≤平均嚴(yán)重度<3.5,中感;平均嚴(yán)重度≥3.5，高感。相同品種(系)土表接種鑒定抗性等級評價以2個年度中抗性表現(xiàn)較低的等級為準(zhǔn)，相同品種(系)抗性的不同鑒定方法的抗病性評價以土表接種和單花滴注鑒定中表現(xiàn)較低的等級為準(zhǔn)。

1.3 農(nóng)藝性狀調(diào)查

2018-2019年度將上述供試材料(對照品種揚麥20，浙江省小麥主栽品種)種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所試驗地，不接種赤霉病菌株，種植方式同抗病性鑒定，調(diào)查其單株分蘗數(shù)、株高、生育期、穗長、穗粒數(shù)、單株產(chǎn)量和千粒重。

1.4 遺傳多樣性分析

1.4.1 DNA提取

將94個小麥品種(系)及三個對照的種子種植于裝有營養(yǎng)土的育苗穴盤中，在溫室中催芽出苗，每個品種(系)分別取5～10片幼嫩葉片，采用CTAB法[14]提取每個品種單株的總DNA，利用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測DNA的濃度和純度，并將每個樣品的DNA濃度統(tǒng)一稀釋為50 ng·μL-1，放-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 SSR擴增及電泳檢測

在GrainGenes 3.0數(shù)據(jù)庫(http://wheat.pw.usda.gov/GG3)中挑選出260個均勻分布于小麥21條染色體上的SSR標(biāo)記[15]，從參試材料中隨機挑選8個來源不同的小麥品種(系)的DNA對這260對SSR引物進行篩選，共篩選出49對條帶清晰且多態(tài)性明顯的SSR引物用于檢測供試材料(表2)。

PCR擴增的反應(yīng)體積為10 μL。反應(yīng)體系： 2×Taq PCR Mix(北京天根生化科技有限公司) 5 μL，10 μmol·L-1引物F和引物R各0.5 μL，50 ng·μL-1DNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性 30 s，55～65 ℃(根據(jù)不同引物而定)退火30 s， 72 ℃延伸 1 min，循環(huán)35次；72 ℃充分延伸 6 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，恒定電壓130 V，電泳120 min，采用銀染法染色檢測擴增結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

SSR的擴增條帶按照有和無的方法記錄結(jié)果，在相同遷移率的位置，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，建立0/1格式的數(shù)據(jù)庫，然后利用DataTrans 1.0軟件對數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換，利用PowerMaker V3.25軟件進行遺傳多樣性分析和UPGMA聚類分析。UPGMA聚類圖利用MEGA-X軟件進行繪制。利用SPSS 24.0軟件對8個農(nóng)藝性狀進行描述性統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥種質(zhì)材料赤霉病抗性鑒定

2017-2018年度通過土表接種鑒定篩選到94個抗病小麥品種(系)，其中表現(xiàn)免疫的品種(系)3個，高抗品種(系)33個，中抗品種(系)58個。2018-2019年度對這94個品種(系)再次通過土表接種鑒定，篩選得到抗病品種(系)75個，其中高抗品種(系)19個，中抗品種(系)56個；感病品種(系)19個，其中中感品種(系)17個，高感品種(系)2個。2018-2019年度通過單花滴注接種法鑒定，供試材料中表現(xiàn)中抗品種(系)62個，中感品種(系)32個。綜合2種不同方法的鑒定結(jié)果，94個供試材料中，中抗品種(系)51個，中感品種(系)41個，高感品種(系)2個。51份表現(xiàn)抗病的材料中，來源于江蘇、浙江和北京的小麥品種(系)分別有29個、9個和8個，分別占抗病材料56.9%、17.7%和15.7%。

2.2 小麥種質(zhì)材料的遺傳多樣性

2.2.1 基因多樣性

利用49對SSR引物在97個品種(系)中共計檢測出159個等位位點，每對SSR引物可以檢測出2～7個等位位點，平均為3個，其中cfa2219、wmc627、wmc167和wmc59標(biāo)記的多態(tài)性位點最多，均為7個。每個標(biāo)記的基因多樣性值為0.02～0.78，平均為 0.50；其中位于2B染色體上的wmc627標(biāo)記具有最高的基因多樣性，為0.78。此外，49個SSR標(biāo)記的多態(tài)性信息含量(PIC)為0.02～0.75，平均為0.42；其中PIC值高于0.5的19個標(biāo)記，為高度多態(tài)性位點(表2)。

表2 49對SSR標(biāo)記名稱和染色體位置及其在97份小麥種質(zhì)材料中的多態(tài)性

2.2.2 聚類分析

利用SSR數(shù)據(jù)計算得到的97份小麥品種(系)相互間的遺傳距離范圍為0.02～0.74，平均為 0.35。根據(jù)遺傳距離，利用非加權(quán)組平均法(UPGMA)對97個品種(系)進行聚類分析。結(jié)果表明，所有97個品種(系)可以劃分為7個類群(圖1)。Ⅰ類群包含20個品種(系)，其中中抗品種(系)16個，占抗赤霉病品種(系)總數(shù)的 31.4%；Ⅱ類群包含30個品種(系)，其中中抗品種(系)12個，占抗赤霉病品種(系)總數(shù)的23.5%，中抗對照揚麥158包含在該類群中；Ⅲ類群包含26個品種(系)，其中中抗品種(系)14個，占抗赤霉病品種(系)總數(shù)的27.5%；高抗對照蘇麥3號被分在該類群；Ⅳ類群包含7個小麥品種(系)，其中中抗品種(系)2個，占抗赤霉病品種(系)總數(shù)的3.9%；Ⅴ類群僅含有1個中抗品種，占抗赤霉病品種(系)總數(shù)的2.0%；Ⅵ類群包含3個品種(系)，其中中抗品種(系)2個，占抗赤霉病品種(系)總數(shù)的 4.0%；Ⅶ類群包含10個品種(系)，其中中抗品種(系)5個，占抗赤霉病抗品種(系)總數(shù)的9.8%?？共〔牧现饕植荚冖?、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ類群，占抗赤霉病品種(系)總數(shù)的 92.2%；不同來源的抗病品種(系)分布在不同的類群中。

a：97個小麥品種(系)的編號,其中3個對照品種W001、W002和W003用橙色陰影凸顯出來。b：小麥種質(zhì)材料的抗病性，黑色五角星代表高抗，灰色五角星代表中抗；c：聚類分組情況。

2.3 抗病材料的農(nóng)藝性狀

51個表現(xiàn)中抗品種(系)農(nóng)藝性狀的變異較大(表3)。單株分蘗數(shù)平均為3.64個，變化范圍為2.81～4.83個；平均生育期為186.12 d，變化范圍為181.00～191.67 d；平均株高為80.97 cm，變化范圍為71.67～90.33 cm；平均穗長為9.49 cm,變化范圍為7.64～11.54 cm；平均穗粒數(shù)為39.87粒,變化范圍為31.18～47.97粒；平均單株重量為6.66g,變化范圍為4.44～8.96 g；平均千粒重為46.07 g，變化范圍為37.33～ 56.85 g。51份抗病材料中，Y608、慶豐188、寧豐518、明麥7號、寧麥資15116、金運麥4號、zhb003、科運麥1611和華鑒麥3號等9個品種(系)的綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)異，單株產(chǎn)量和千粒重分別都在7.5 g和45 g以上，株高在74.67～84.67 cm之間。

表3 51個抗赤霉病小麥品種(系)主要農(nóng)藝性狀統(tǒng)計分析

3 討 論

小麥赤霉病是威脅我國小麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害之一，培育抗赤霉病新品種是克服小麥赤霉病的根本途徑[16]。篩選和鑒定優(yōu)異的赤霉病抗源是小麥抗病育種的基礎(chǔ)，國內(nèi)外的諸多學(xué)者針對小麥赤霉病抗源的篩選和鑒定已經(jīng)開展了一系列的研究，但是當(dāng)前的小麥育種中仍然缺乏可靠的FHB抗源[17-19]。目前全球范圍內(nèi)僅有蘇麥3號及其衍生后代和來自巴西春小麥品種Frontana作為FHB主要抗源廣泛應(yīng)用于小麥的抗赤霉育種，少數(shù)幾個抗源材料過度使用導(dǎo)致育種材料遺傳背景愈發(fā)狹隘，小麥抗赤霉病育種在很大程度上不能滿足小麥生產(chǎn)發(fā)展的需求[20-21]。因此，不斷挖掘和鑒定小麥抗赤霉病材料豐富抗源的多樣性，對于加快小麥抗赤霉病育種進程、提高小麥品種赤霉病持久抗性具有重要意義。

小麥赤霉病鑒定主要有土表病麥粒和單花滴注病原菌孢子液接種鑒定，病麥粒接種鑒定可鑒別病原菌抗侵染和抗擴展能力，單花滴注可鑒定病原菌抗擴展能力。病麥粒接種鑒定操作簡單，但受環(huán)境的影響較大，單花滴注比較準(zhǔn)確可靠，但工作量較大，且不能鑒定病原菌的抗侵染能力[11-12]。本研究綜合兩種鑒定方法的優(yōu)勢，首先采用病麥粒接種篩選抗赤霉病種質(zhì)材料，再次通過病麥粒和單花滴注接種，綜合鑒定小麥種質(zhì)材料的赤霉病抗性。本試驗對前期通過病麥粒土表接種篩選出的抗赤霉病品種(系)94個，第二年繼續(xù)病麥粒土表接種，其中17個品種(系)感病，所鑒定的材料發(fā)病程度加大，原因可能在于第二年田間的氣候條件有利于病害的發(fā)生。而對這94個材料進行單花滴注鑒定，有32個品種(系)感病，相比于病麥粒接種感病材料增加，說明單花滴注比較能夠精細(xì)鑒定小麥種質(zhì)材料的赤霉病抗性。了解種質(zhì)資源的遺傳背景有助于合理選配親本組合，充分發(fā)揮雜交優(yōu)勢，增大后代群體的性狀分離，提高育種效率。親本的選配還需要考慮到其農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，一般需要株高適中抗倒、生育期不宜太長、穗大粒多、分蘗強、豐產(chǎn)性好。本研究采用分子標(biāo)記分析了供試的97份小麥種質(zhì)材料(包括3個對照品種)的遺傳多樣性，將97份小麥種質(zhì)材料劃分為7個類群，鑒定到的51個抗赤霉病品種(系)分布在7個不同的類群中，因此對于抗病育種的雜交親本選配應(yīng)盡可能選擇不同遺傳類群的種質(zhì)材料。本試驗考查了51份抗赤霉病種質(zhì)材料的單株分蘗數(shù)、株高、生育期、千粒重和單株產(chǎn)量，品種(系)間農(nóng)藝性狀的變異較大。其中包含在類群Ⅰ中的慶豐188、寧豐518、科運麥1611，類群Ⅱ中的寧麥資15116、zhb003、華鑒麥3號，類群Ⅲ中的Y608、明麥7號、金運麥4號，在抗赤霉病育種中雜交親本選擇中可作為重點關(guān)注對象。

鑒定到的51個抗赤霉病品種(系)在Ⅰ至Ⅶ這7個類群中的數(shù)量分別為15、13、14、2、1、1和5個，包含在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類群中的材料占材料總數(shù)的82.4%，抗赤霉病育種中被廣泛使用的對照品種揚麥158和蘇麥3號分別也包含在Ⅱ和Ⅲ類群中(圖1)，說明本研究鑒定的抗赤霉病種質(zhì)資源在很大程度上也存在親緣關(guān)系較近和遺傳背景狹窄的問題，與前人報道的結(jié)果相一致[20-21]。小麥赤霉病的抗性遺傳較為復(fù)雜，屬于多基因控制的數(shù)量性狀，且易受環(huán)境的影響[8]。已經(jīng)在小麥21條染色體上定位了250多個抗小麥赤霉病的QTL位點，但是絕大多數(shù)的QTL位點效應(yīng)均不高且還有待驗證[4,22]。目前已經(jīng)明確的抗赤霉病基因位點有7個，分別為Fhb1[23-24]、Fhb2[24-26]、Fhb3[27]、Fhb4[28]、Fhb5[29]、Fhb6[3029]和Fhb7[31]。利用與已知抗赤霉病基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記，可檢測抗病材料所含有的抗病基因，通過聚合不同的抗赤霉病基因位點，可選育出抗病性強而穩(wěn)定的小麥品種。因此還需要進一步檢測鑒定到的51個抗病材料所含有的抗赤霉病基因，從而利用分子標(biāo)記進行抗赤霉病基因的聚合育種。